Burada, kısa nükleer RNA'ların Cajal cisimleri adı verilen nükleer yapılara yerelleştirilmesi için gerekli olan RNA dizilerini tespit etmek için floresan etiketli RNA'ların mikroenjeksiyonunu uyguladık. Bu tekniğin iki büyük avantajı vardır. İlk olarak, etiketlenebilen ve izlenmesi zor olan kısa RNA'lar için uygulanabilir.
Ve ikincisi, farklı dizilerin hızlı bir şekilde taranmasına ve RNA yerelleştirmedeki rollerinin test edilmesine olanak tanır. Bir gün önce mikroenjeksiyon, tohum HeLa veya diğer yapışık hücreler 12 milimetre kapakları üzerinde mikroenjeksiyon sırasında% 50 birleştiği zaman ulaşmak için. Başlamak için, bir Petri kabının ortasına hazırlanmış bir kapak yerleştirin, hücreleri ve kültür medya iki milimetre ekleyin.
Ertesi gün, hücre dolu Petri kabını mikroskop aşamasına yerleştirin. Bir mikroloader kullanarak, snRNA karışımının üç mikrolitresini iğneye yükleyin ve iğneyi Petri kabının yüzeyine göre 45 derecelik bir açıyla mikroenjektörtutucuya takın. İğneyi bulmak için 10X uzun mesafe hedefi kullanın.
İlk olarak, enjektörüzerinde hız kaba ayarlayın ve kültür ortamı dokunur kadar iğne indirin. Mikroskop dürbün kullanarak, iğne kültür ortamı dokunur yerdir parlak nokta bulmak. İğnenin ucu gözlemlenene kadar mikroskoba bakarken iğneyi ince ve daha da düşürmek için hızı değiştirin.
İğneyi görme alanının ortasında hareket ettirin ve 40X uzun mesafe hedefine geçin. Bundan sonra, hücreseçin ve hücre üzerinde iğne hareket ettirin. Hücre teması için basıncı ve zamanı ayarlayın.
İğneyi hücreye doğru hareket ettirin ve mikromanipülörün alt sınırını ayarlayın. Alt sınırın ayarlanması protokolün en kritik parçasıdır. Kapak yüzeyi mükemmel olmadığından ve her hücre farklı olduğundan enjeksiyon seansı sırasında alt sınırı birkaç kez ayarlamanız gerekir.
Daha sonra iğneyi hücrenin üzerine geri taşıyın ve enjektörün joystick'indeki enjeksiyon düğmesine basın. İğne otomatik olarak hücre içinde rna karışımı enjekte etmek için sınır ayarlanır yere hareket edecektir. Bitirmek için enjektörün üzerindeki menü düğmesine basın ve iğneyi tutucudan çıkarın.
Daha sonra enjektör ve mikromanipülörü kapatmadan önce tüpü enjektörden çıkartın. Mikroenjeksiyondan sonra hücreleri karbondioksit kuvöze döndürün ve bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, oda sıcaklığında PBS ile hücreleri üç kez durulayın.
PH 6.9'da 0.1 molar borularda %4 paraformaldehit ile hücreleri 20 dakika boyunca düzeltin. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında PBS ile üç kez yıkayın. Sadece snRNA lokalizasyonu analiz edilirse, hücreleri sudaki durulayın ve DAPI ile montaj ortamına monte edin.
Ek protein lokalizasyonu durumunda, hücreyi PBS'de %0.5 Triton X-100 ile oda sıcaklığında beş dakika geçirin. Hücreleri PBS ile üç kez durulayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi uygun birincil ve ikincil antikorlarla lekeleyin. Daha sonra PBS ile üç kez durulayın ve suda bir kez durulayın.
Bundan sonra, DAPI ile bir montaj orta hücreleri monte. Görüntüye hazır olduğunuzda, görüntüleri elde etmek için daldırma hedefiyle donatılmış üst düzey bir floresan mikroskobik sistem kullanın. Mikro enjekte edilen hücreler tanımlandıktan sonra, numune başına 200 nanometre Z adımlı ve matematiksel dekonvolutiona tabi olan 20 Z kesitlerinden oluşan bir yığın toplayın.
Floresan sinyali ölçmek için önce ImageJ'deki mikroskopi görüntüsünü açın ve kanalları pencerelere bölün. Pencereleri eşitleme penceresi aracıyla eşitleyin. Daha sonra, coilin immunostaining ile tanımlanan bir Cajal vücut etrafında ilgi bölge çizin.
Bobin tanımlı Yatırım Getirisi'ndeki snRNA sinyalinin yoğunluğunu ölçün. Nkleoplazm'a rasgele yerleştirilen ROI'daki snRNA floresansının yoğunluğunu belirleyin. Ölçülen değerleri kaydedin ve Cajal gövdesi ve nükleoplazmdaki RNA sinyalinin oranını hesaplayın.
Bu çalışmada floresan etiketli snRNA'lar hücre içindeki ulaşımlarını izlemek için mikro enjekte edilmiştir. SM sitesinin Cajal vücut birikimi için önemli olup olmadığını test etmek için, SM bölgesinden yoksun snRNA doğrudan çekirdeğe mikroenjekte edilir. Tam uzunlukta snRNA pozitif kontrol olarak hizmet etmek için mikroenjekte edilirken sitoplazma içine enjeksiyon bir kontrol olarak hizmet vermektedir.
Kuluçkadan sonra mikroenjekte edilen hücreler sabitlenir ve Cajal cisim işaretbobini dolaylı immünoresans ile görselleşir. Tam uzunlukta snRNA cajal cisimlerde hem nükleer hem de sitoplazmik enjeksiyonlar sonra birikmiş. Buna karşılık, SM alanı olmayan snRNA bu bölmeye mikroenjeksiyon dan sonra sitoplazmada kalırken, SM sitesi olmadan snRNA'nın nükleer mikroenjeksiyonu, snRNA'nın çekirdekte kaldığı ancak Cajal cisimlerde birikmediği için SM bağlama dizisinin Cajal vücut lokalizasyonu için önemli olduğunu ortaya koymaktadır.
Bazen sadece bir hücresel bölmeiçine mikroenjeksiyon başarısız olur ve kandırdı Dextran 70 kilodalton hem çekirdek hem de sitoplazmabulunabilir. Bu hücreler daha fazla analiz atılır. Floresan etiketli snRNA'lar enjeksiyondan önce negatif 80 santigrat derecede depolanmasına rağmen RNA bozulması meydana gelebilir.
Sitoplazmaya enjekte edilen bozulmuş snRNA çekirdeğe taşınmaz ve sitoplazmada lokalize kalır. Bu tür snRNA atılmalıdır ve yeni snRNA sentezlenmelidir. İğneve kompanzasyon basınçlarını hücre tipinize doğru şekilde ayarlamak önemlidir.
Ve daha önce de belirtildiği gibi, hücre enjeksiyonu için doğru alt sınırı ayarı iyi bir mikroenjeksiyon için gereklidir. RNA izolasyonu sırasında kullanılan fenol-kloroformun tehlikeli olduğunu ve mikroenjeksiyon iğnesinin keskin bir nesne olduğunu lütfen unutmayın. Bu malzemeleri kullanırken dikkatli olun.
