iPS türevi mikroglia, in vitro deneyler için biyolojik olarak ilgili bir insan mikroglia kaynağını temsil eder ve sağlık ve hastalıkta mikroglia biyolojisini araştırmak için önemli bir araçtır. Büyüme faktörlerinin minimum kullanımını gerektiren ve yüksek saflık ve verim sağlayan basit bir mikroglia farklılaşma protokolü sunuyoruz. Ayrıca, tamamen insanlaştırılmış bir fagositoz testi gösteriyoruz.
iPSC türevi mikroglia benzeri hücreler, ortam buharlaşmasına karşı çok hassastır. Hücre kültürü plakasının köşesindeki kuyucukları kullanmaktan kaçınmalı ve hayatta kalmayı iyileştirmek için tüm boş kuyuları suyla doldurmalısınız. İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücreler veya iPSC'ler% 80 akıcılığa ulaştığında, bir mililitre DPBS ile yıkayarak ve 37 santigrat derecede iki dakika boyunca bir mililitre ayrışma reaktifi ekleyerek kolonileri ayrıştırır.
Tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için birden çok kez kazıyarak bir hücre kaldırıcı kullanarak kolonileri yerinden çıkarın. Süspansiyonu toplayın ve dokuz mililitre DPBS içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra hücreleri bir dakika boyunca 500 kez g'de santrifüj edin, süpernatanı çıkarın ve Embriyoid Gövdenin veya EB'nin bir mililitresinde yeniden askıya alın.
10 mikrolitre hücre alın ve tripan mavisi ile bir ila iki tane seyreltin. Hücreleri bir hemositometrede sayın ve hücre sayısına dayanarak, hücre stokunu 100 mikrolitre başına 10.000 hücrelik son bir seyreltmeye kadar seyreltin. Hücreleri kaplamak için, seyreltilmiş hücrelerin 100 mikrolitresini kuyu başına düşük yapışmalı yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakaya ekleyin.
Plakayı üç dakika boyunca 125 kez g'de santrifüj yapın ve dört gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. İkinci günde, çok kanallı bir pipet kullanarak, eski yarım EB ortamını yeni bir ortamla değiştirin. İlkel Makrofaj Öncülleri veya PMP'ler üretmek için, bir mililitre buz gibi soğuk Matrigel kaplama çözeltisi ekleyerek altı delikli bir plakanın kuyularını kaplayın.
Daha sonra plakayı iki saat veya bir gecede 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. EB farklılaşmasının dördüncü gününde, bir mililitrelik pipet ucu kullanarak, EB'leri Matrigel kaplı kuyucuklara aktarın. EB'leri kuyudan çıkarmak için pipeti yukarı ve aşağı doğru yerleştirin.
Ardından, EB'lerin kuyunun kenarına yerleşmesine izin vermek için plakayı eğik tutun. Tüm EB'ler yerleştikten sonra, yavaşça pipet yapın ve eski ortamı değiştirin, EB'yi kuyunun kenarında üç mililitre taze hazırlanmış PMP tam ortam ile tutun. Plakayı manuel olarak yan yana ve arkadan öne doğru karıştırarak kuyucuklardaki hücreleri eşit olarak dağıtın.
Ardından, EB'lerin kuyunun dibine yapışmasına izin vermek için plakayı yedi gün boyunca inkübe edin. Yedi gün sonra, EB'leri kuyucukların dibine tutturulduklarından emin olmak için bir ışık alanı mikroskobu altında dört kat büyütmede inceleyin. Yarım orta bir değişim gerçekleştirin ve 21. günde, tam ortamı üç mililitre PMP tam ortam ile değiştirin.
28. günde, süpernatantta PMP'ler olarak adlandırılan yuvarlak hücreleri arayın. Ardından, EB'leri rahatsız etmeden 10 mililitrelik pipet ve otomatik pipetter kullanarak PMP'leri içeren ortamı toplayın. Ortamdaki PMP'leri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Toplanan PMP'leri dört dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj edin ve süpernatantı bir ila iki mililitre mikroglia benzeri hücrede veya IMG bazal ortamında yeniden askıya almadan önce aspire edin. Daha sonra hemositometredeki hücreleri daha önce tarif edildiği gibi sayın. Hücrelerin geri kalanını santrifüj edin ve PMP'leri istenen konsantrasyona kadar seyreltin.
Daha sonra hücreleri, taze hazırlanmış IMG tam ortamı kullanarak hücre kültürü ile muamele edilmiş plakalar üzerinde santimetre kare başına 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda plakalayın. Canlı hücre fagositoz testi için, 20 ila 30 kez 10 ila dördüncü PMP'leri 96 delikli bir plakaya ve 100 mikrolitre IMG tam ortamına yerleştirin ve 10 gün boyunca farklılaşma işlemini izleyin. Tahlil gününde, kuyucuk başına 40 mikrolitre ortam çıkarın ve 10 mikrolitre nükleer boyama çözeltisi ekleyin.
Plakayı iki saat boyunca inkübe edin. Etiketli sinaptozomları buz üzerinde çözün ve bir dakika boyunca bir su sonikatör kullanarak hafifçe sonikleştirin. Yine, hemen sinaptozomları buzun üzerine yerleştirin.
Etiketli sinaptozomları IMG tam ortamında, 50 mikrolitre ortam başına bir mikrolitre sinaptozomda seyreltin. Negatif kontrol için, aktin polimerizasyonunu ve dolayısıyla fagositozu inhibe etmek için IMG tam ortamında 60 mikromolar Sitokalasin D hazırlayın. Daha sonra, 10 mikromolar'lık son konsantrasyon için her bir oyuğa bu çözeltinin 10 mikrolitresini ekleyin ve 30 dakika boyunca inkübe edin.
Plakayı inkübatörden çıkarın ve 10 dakika boyunca 10 santigrat derecede inkübe edin. Plakayı buz üzerinde tutun ve sinaptozom içeren 50 mikrolitre ortam ekleyin. Plakayı 10 santigrat derecede üç dakika boyunca 270 kez g'de santrifüj yapın ve görüntüleme elde edilene kadar plakayı buz üzerinde tutun.
Plakayı canlı bir hücre görüntüleme okuyucusuna yerleştirin ve analiz edilecek kuyucukları seçin. Ardından bir 20X objektif lens seçin. Ardından, odağı, Işık Yayan Diyotu veya LED'i, yoğunluğu, entegrasyon süresini ve parlak alan ve mavi kanalların kazancını ayarlayın.
Sinaptozom floresansı ilk zaman noktasında ihmal edilebilir olmalıdır. Kuyu başına bir montajda elde edilecek tek tek karo sayısını seçin. Kuyunun merkezinde 16 karo elde edin ve toplam kuyu alanının yaklaşık% 5'ini görüntüleyin.
Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ve görüntüleme için istenen zaman aralığına ayarlayın. Ardından, analiz yazılımını açın. Ardından görüntüleri içeren denemeyi açın ve Veri Azaltma simgesine tıklayın.
Menüde, metin makalesinde açıklanan parametrelerle montajdaki dörte dört ayrı döşemeden tam bir görüntü oluşturmak için Görüntüleme İşlemi altında Görüntüleme Dikiş'i seçin. Bu görüntüler için DAPI ve RFP kanallarını kullanarak bir yoğunluk eşiği tanımlayın. Bir resim açın ve Analiz Et'e tıklayın.
Analiz altında, Hücresel Analiz'i seçin ve Algılama Kanalı'nın altında, DAPI veya RFP kanallarında dikişli bir görüntü seçin. Ardından, Birincil Maske ve Sayı sekmesine gidin ve DAPI kanalındaki hücre çekirdeklerini veya RFP kanalındaki sinaptozom sinyalini doğru seçen bir eşik değeri ve nesne boyutu değerleri oluşturun. Çekirdek sayısını saymak için Veri Azaltma menüsüne gidin ve Görüntü Analizi altında Hücresel Analiz'i seçin.
Yine, Birincil Maske ve Sayı sekmesine gidin ve Kanal altında, DAPI dikişli görüntüleri seçin ve metin makalesinde açıklanan parametreleri kullanın. Ardından, Hesaplanan Metrikler sekmesine gidin ve Hücre Sayısı'nı seçin. Ardından sinaptozom sinyalinin alanını elde etmek için Veri Azaltma menüsüne gidin ve Analiz altında Hücresel Analiz'i seçin.
Yine, Birincil Maske ve Sayı sekmesine gidin ve Kanal altında, RFP dikişli görüntüleri seçin ve metin makalesinde ayrıntılı olarak açıklanan parametreleri kullanın. Ardından, Hesaplanan Metrikler sekmesine gidin ve Nesne Toplamı Alanı'nı seçin. Veri Azaltma sekmesinde, yazılımın elde edilen tüm görüntüleri analiz etmesine izin vermek için Tamam'a tıklayın.
Görüntüler analiz edildikten sonra, her zaman noktası için Nesne Toplamı Alanı ve Hücre Sayısı değerlerini dışa aktarın. Ardından, zaman noktası başına normalleştirilmiş alanı hesaplamak için Nesne Toplamı Alanı'nı Hücre Sayısı'na bölün. Birden fazla tedaviyi veya genotipleri karşılaştırıyorsanız, verilen denklemi kullanarak fagositoz indeksini hesaplayın.
Farklılaşmamış iPSC'ler, iyi tanımlanmış kenarlara sahip kompakt koloni morfolojisi gösterir. Ayrışmış iPSC'ler, EB'ler olarak adlandırılan küresel agregalar oluşturdu ve farklılaşmanın dördüncü gününe kadar boyut olarak büyüdü. EB'ler PMP üretimi için kaplandığında, Matrigel kaplı plakalara yapışırlar ve bir hücre tabakası küresel agregaları yayar ve çevreler.
28. günde, süspansiyonda büyük bir sitoplazma-çekirdek oranına sahip yuvarlak hücreler ortaya çıkar. Laminin 521 kaplamalı plakalarda daha yüksek PMP verimi nedeniyle, iPSC'lerin Matrigel yerine Laminin 521 kaplı plakalarda kültürlenmesi şiddetle tavsiye edilir. PMP'lerin IMG ortamına maruz kalmasından sonra, hücreler uzun süreçlerin varlığında küçük bir sitoplazma ile mikroglia benzeri bir morfoloji kazanırlar.
Ayrıca, mikroglia kimliği immünofloresan boyama ile doğrulandı. Tipik olarak, hücrelerin% 95'inden fazlası IB1'i eksprese eder ve hücrelerin yaklaşık% 90'ı P2RY12 ve TMEM119'u eksprese eder. Western blot analizi, iPSC'nin insan sinapsosomlarının eksprese ettiği sinaptik belirteçler, sinaptofizin ve postsinaptik yoğunluk proteini 95 için düşük motor nöronlar türettiğini doğruladı.
İlk zaman noktasına kıyasla kontrolde, 10 saat boyunca, kırmızı floresan sinyali sağlamdı, çünkü sinaptozomların çoğu yutulmuştu ve asidik hücre içi bölmelere lokalize edilmişti. Sitochalasin D-ile tedavi edilen IMG'lerde, kırmızı sinyalin sıfır ve 10 saat boyunca güçlü bir şekilde azaltılması, tespit edilen sinyalin fagositik olaylardan kaynaklandığını göstermiştir. Yutulmuş sinaptozomların alanı zamanla 16 saate kadar artmıştır.
Bununla birlikte, Sitokalasin D ile tedavi edilen hücrelerden gelen kırmızı sinyal alanı zamanla artmadı. iPS türevi Microglia benzeri hücreler, nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkların incelenmesinde fagositoz ve inflamatuar yanıt dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.
