Bu protokol hasta tümör örnekleri için kritik bilgilendirici gen füzyonlarının saptanmasında kullanılır. Düzinelerce genin füzyon durumu tek bir tözde eş zamanlı olarak değerlendirilir. Bu tekniğin avantajı, formülatif fiksasyon ile işlenen tümör örneklerinden füzyon partnerinin kimliğine bakılmaksızın gen füzyonlarını tanımlayabildiğimdir.
Klinik tümör örneğinde bazı gen füzyonunun saptanması birçok kanser türünde tanı, prognoz ve tedavi seçimini doğrudan bildirir. Analiz algoritması tarafından çağrılan birçok füzyonun yapıt olduğunu anlamak önemlidir. Verileri çözümlerken en zor görev yapı ve gerçek füzyon çağrıları arasında ayrım.
RNA istenilen konsantrasyonu elde etmek için toplam nükleik asit seyrelterek başlayın. Her numune için, seyreltmenin 20 mikrolitresini önceden soğutulmuş alüminyum bloktaki rastgele astar reaktif şerit tüplere aktarın ve altı ila sekiz kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. Kısaca örnekleri aşağı spin, 96-iyi PCR plaka için tüm hacmi aktarın ve plaka mühür film ile mühür.
Plakayı bir termocycler'a takın, sıkıştırma pedi ile kaplayın ve kapağı kapatın. 65 santigrat derecede 5 dakika kuluçkaya yat. Kuluçkadan sonra, ilk iplikreaktif şerit tüplerde rastgele astar lama ürününün tüm hacmini aktarın.
Yukarı ve aşağı boru ile karıştırın ve kısa bir süre aşağı spin. Tüm hacmi 96 kuyulu bir PCR plakaya aktarın ve RT filmile mühürleyin. Plakayı termocycler'a takın ve müsvedde lerin talimatlarına göre reaksiyonuyguluyor.
İkinci iplikçik cDNA sentezini gerçekleştirin ve onarım ve el yazması yönlere göre ligasyon adım bir ve ikinci ligasyon adım devam edin. Moleküler barkod veya MBC adaptörü şerit tüplerini numaralandırmak için tüpleri arkaya menteşelerle yatay olarak yerleştirin ve kalıcı bir belirteç kullanın. İlk ligasyon adımından boncuk arınma plakasını alın ve her numunenin 40 mikrolitresini MBC adaptör şerit tüplerine aktarın, boncuk peletini rahatsız etmemeye özen tinler.
Pipetleme ile reaktifleri karıştırın, tüpleraşağı spin, ve ligasyon adım iki reaktif şerit tüpler için tüm hacmi aktarın. Örnekleri karıştırın, aşağı döndürün ve bir termocycler bloğuna yerleştirin. Isıtılan kapağı kapalı bırakın ve termocycler'ı 22 derecede beş dakika çalıştırın, ardından 4 santigrat derece tutun.
Daha sonra, onları girdap ve PCR şerit tüpler yeni bir dizi 50 mikrolitre ekleyerek ligasyon temizleme boncuk hazırlamak. Bir dakika için mıknatıs inkübate ve supernatant atın. Mıknatıstan şerit tüpleri çıkarın ve yukarı ve aşağı borulama tarafından ligasyon temizleme tampon 50 mikrolitre boncuk lar yeniden askıya alın.
İkinci ligasyon adımından tüm numune hacmini ligasyon temizleme boncuk şeridine aktarın. Girdap örnekleri karıştırmak ve 10 dakika oda sıcaklığında bırakın. Girdap örnek bir kez kuluçka yarısında.
Daha sonra, örnekleri girdap, onları aşağı spin ve bir dakika için mıknatıs üzerinde kuluçka. Supernatant atın ve taze ligasyon temizleme tampon 200 mikrolitre ekleyin. Girdap yeniden askıya almak için, aşağı spin, ve bir dakika için mıknatıs üzerine yerleştirin.
İki yıkamadan sonra tampon yerine ultra saf su kullanarak üçüncü bir yıkama gerçekleştirin. 5 milimetre sodyum hidroksit 20 mikrolitre boncuk resuspend ve 96-iyi PCR plaka örnekleri aktarın. Plakayı bir sıkıştırma yastığı olan bir termocycler'a yerleştirin ve 75 derecede 10 dakika çalıştırın ve ardından 4 derece santigrat tutun.
Numuneler 4 dereceye kadar soğuduktan sonra plakayı en az üç dakika mıknatısın üzerine yerleştirin ve ilk PCR ile devam edin. İlk PCR reaktif şeridinin her kuyusuna iki mikrolitre GSP1 astar ı ekleyerek PCR reaksiyonlarını hazırlayın. İkinci ligasyon temizleme ürününün 18 mikrolitresini ilk PCR reaktif şerit borularına aktarın ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.
Örnekleri aşağı çevirin ve 96 kuyulu bir PCR plakasına aktarın. Onları termocycler'a yerleştirin ve el yazması talimatlara göre PCR çalıştırın. Her kuyuda 24 mikrolitre arınma boncukları ile dolu bir U-alt plakapcr ürün 20 mikrolitre ekleyerek boncuk arıtma ile devam edin.
Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak ve beş dakika oda sıcaklığında plaka bırakın, sonra iki dakika boyunca mıknatıs üzerinde plaka kuluçka. Boncuklardan supernantant atın ve% 70 etanol 200 mikrolitre ile iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, tüm etanol çıkarın ve iki dakika boyunca örnek hava kuru izin.
Plakayı mıknatıstan çıkarın ve 10 milimetretri-HCl ve pH 8.0'ın 24 mikrolitresinde boncukları yeniden askıya alın. Mıknatısı üç dakika kuluçkaya yatırın ve tabağı iki dakika lığına mıknatısın üzerine yerleştirin. 10 milimetre tris-HCl ikinci PCR ürün bir ila beş seyreltme ler hazırlayarak kütüphane nicelik başlar.
Bunu 1:199, 1:199 ve 20:80'lik 10 milimetretri-HCl'de %05 polisorbatile seri seyreltme ile takip edin. Optik 96 kuyulu plakanın her kuyuya altı mikrolitre ana karışım ekleyerek anahtar PCR'yi kurun ve ardından uygun seyreltme veya standartdört mikrolitre. Plakayı aşağı çevirin ve qPCR aletine yükleyin.
El yazması talimatlara göre qPCR gerçekleştirin. Kütüphane niceliği tamamlandıktan sonra, tüm kütüphaneleri 10 milimetre Tris-HCl ile iki nanomolara seyreltin. Normalleştirilmiş her kütüphanenin 10 mikrolitresini 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne birleştirerek bir kütüphane havuzu yapın.
Daha sonra, 0,2 normal sodyum hidroksit 10 mikrolitre ile kütüphane havuzu10 mikrolitre birleştirerek ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca karışımı kuluçkaya yatırarak, denatüre amplicon kütüphane veya DAL havuzu hazırlayın. Kuluçkadan sonra, pH 7.0'da 200 milimetre tris-hcl 10 mikrolitre ekleyin, ardından 970 mikrolitre HT1 Hibridizasyon Tamponu. 300 mikrolitre HT1, 25 mikrolitre 20 picomolar PhiX ve DAL havuzunun 675 mikrolitresini birleştirerek son yük tüpünü yapın.
Yük tüpünün tüm hacmini sıralayıcı reaktif kartuşunun numune kuyusuna ekleyin ve kartuşun uyanıcıya yükleyin. Pozitif kontrol örneğini seçerek başlayın ve beklenen tüm füzyonların ve onkojenik izoformların tespit edildiğinden ve güçlü kanıt sekmesinde listelendiklerinden emin olun. Her örnek için, GSP2 kontrol değeri başına ortalama benzersiz başlangıç sitelerini inceleyin, ardından kullanıcıyı bireysel füzyon destekleyen okuma yığınlarının web tabanlı JBrowse görünümüne götüren Visualize bağlantısını tıklatarak her olası birleştirme için destekleyici okumaları görselleştirin.
Okumaların çoğunlukla uyumsuzlu olduğunu, ancak okumaların 30'dan fazla tabanının füzyon ortağıyla uyumlu olduğunu ve genler ve astar bağlama siteleri arasındaki kırılma noktasına bitişik dizilerin ekleme veya silme içermez olduğunu doğrulayın. Her çağrı füzyonunun genellikle uyumsuzlukiçermeyen olmasını ve okumaların önemli bir bölümünün füzyon ortağıyla uyumlu olmasını sağlamak çok önemlidir. Bu protokol akciğer adenokarsinom örneğinde gen füzyonu durumunu araştırmak için kullanılmıştır.
Özet güçlü kanıt füzyonları gösterir ve Okuma İstatistikleri sayfası örnek ölçümleri gösterir. Bu örnek iyi RNA kalitesi sergiler, bu nedenle füzyon bulunmazsa negatif sonuçlar rapor edilecektir. Meşru bir füzyon çağrısı, yüksek sayıda destekleyici okuma sayısına, füzyonu destekleyen astardan okumaların yüksek bir yüzdeye ve yüksek sayıda başlangıç sitesi vardır.
Okumaların görselleştirilmesi, füzyon ortağının büyük bölgelerine iyi bir uyum gösterir. Tersine, yapay bir kaynaştırma çağrısı, ortakla eşleme yaparken daha düşük destekleyici ölçümlere ve yüksek hata oranına sahiptir. Analiz algoritması tarafından yapılan yapay füzyon çağrıları yaygındır.
Hasta örneğinde gerçek bir gen füzyonu temsil ettiğinden emin olmak için her çağrıyı elle incelemek çok önemlidir.
