Monoklonal antikorlar biyofarmasötik pazara hakimdir ve tipik olarak Protein A kromatografisi ile saflaştırılır. Buna göre reçine antikor bazlı terapötik fiyatını etkileyen üretim sırasında önemli bir maliyet sürücüsüdür. Burada yeni bir yakınlık ligand hiv nötralize antikor 2F5 doğrusal epitop için bir taşıyıcı olarak okunur floresan protein dayalı açıklar.
Genel olarak yöntemimiz monoklonal antikorların yakalanmasında kullanılabilecek afinite kromatografi reislerinin hızlı bir şekilde üretilmesine olanak sağlar. Bu yeteneği ham bitki ekstresinden antikor 2F5 yakalayarak gösterdik. Dinamik bağlama kapasitesini ve reçine yeniden kullanılabilirliğini iyileştirmek için yakalama koşullarını ve çözüm arabelleğini optimize ettik.
Rezorinimiz Protein A'dan daha genel olarak daha gevşek koşullara izin verir ve monoklonal antikorların saflaştırma maliyetlerini azaltma potansiyeline sahiptir. Ayrıca, rezorin kolayca lineer epitoplar bağlamak diğer antikorlara adapte edilebilir. Bu prosedüre başlamak için, hazırlanan afinite ligand çözeltisinin konsantrasyonuna, deneylerin tasarımında tanımlandığı şekilde litre başına 5 ila 15 gram aralığında olacak şekilde ayarlayın.
Bağlantı reaksiyonu hazır olana kadar çözümü buzüzerinde saklayın. Sonra, dfe çözeltisi ile bir iki mililitreşli şırınga doldurun. Ve bir mililitre yatak hacmi ile NHS-aktive çapraz bağlantı agarose sütunlar üzerinde şırıngamonte monte etmek için bir adaptör hazırlayın.
Bağlantı için kullanılan her 10 sütun için 30 mililitre devre dışı bırakma çözeltisi, 30 mililitre düşük pH çözeltisi ve bir mililitre depolama çözeltisi hazırlayın. Sonra bir tüp içinde bir milimolar hidroklorik asit 20 mililitre hazırlayın. Ve en az 20 dakika buzda kuluçkaya yatırın.
Bağlantı reaksiyonu sırasında ki tüm adımlar için kesirler üzerinden akışını izlemek için hassas bir ölçek hazırlayın. Bundan sonra, mühürlü bir NHS-şifreli crosslinked agarose sütun açın. Havanın sütuna girmesini önlemek için bağdaştırıcı girişine bir damla arabellek uygulayın.
Şırınga adaptörlerini sütun girişine monte edin. Altı mililitre buz soğuk bir milimolar hidroklorik asit ile sütun yıkayın, bir akış hızı daha az dakikada bir mililitre. İki mililitrelik şırınga kullanarak, dakikada bir mililitreden daha az bir akış hızında n1,5 mililitre DFE çözeltisi enjekte edin.
Ve sonraki analiz için hassas bir ölçekte fraksiyonüzerinden akış toplamak. Her iki ucunda ki kolon mühür ve 22 santigrat derece, 15 ila 45 dakika kuluçka. Sonraki aktivasyon çözeltisi altı mililitre enjekte, düşük pH çözeltisi altı mililitre takip, dakikada bir mililitreden daha az bir akış hızında, reçine olmayan kovalent bağlı ligands kaldırın.
Altı mililitre aktivasyon solüsyonu enjekte edin ve kolonda 15 dakika kuluçkaya yatın. Bundan sonra, sütuniçine altı mililitre düşük pH çözeltisi enjekte edin. Ardından altı mililitre aktivasyon çözümü.
Sonra sütuna altı mililitre daha düşük pH çözeltisi enjekte edin. Sütuna iki mililitre depolama çözeltisi enjekte edin ve dört santigrat derecede saklayın. İlk 2F5 içeren açıklık bitki ekstresi ya 100 mililitre hazırlamak, ya da tercih edilen hücre tabanlı ifade sistemi için supernatant, aynı zamanda 2F5 içeren.
Sonraki eşitlik arabelleği hazırlamak ve yüksek demir X mukavemeti yanılsama tampon, metin protokolünde belirtildiği gibi. Renkbilim sistemini tamponlarla temizle. Kromatografi sistemine bir DFE yakınlık sütunu monte edin.
Ve dakikada bir mililitre akış hızında, denge tampon beş CV ile dengeleyin. UV emiciliğini 280 nanometreden izleyin. Daha sonra 80 mililitre ya açıklık bitki ekstresi, ya da dakikada 5 mililitre akış hızında sütun üzerine supernatant yükleyin.
İki dakikalık bir temas süresini garanti etmek için. İki mililitrek veya atılım eğrisi rekonstrüksiyonörnekleri üzerinden akış toplamak. Hemen numune analizi mümkün değilse, numuneler üzerinden akışı dört santigrat derecede saklayın.
Bu yıkamadan sonra equilibr tampon 6CV ile sütun yıkayın. Yıkamanın başında, ortasında ve sonunda bir örnek toplayın. MAB2F5'i beş cilt yüksek iyonik mukavemet liyasürü tamponuyla seyreltin.
280 nanometredeki UV sinyali taban çizgisinin üzerinde beş milimetrelik emici üniteye yükseldiğinde DFE fraksiyonu toplayın. Metin protokolünde belirtildiği gibi, her epitop-antikor çifti için yanılsama arabelleği optimize edin. Füzyon proteinI DFE transgenik tütün bitkileri, bir serada yetiştirilen ifade edilir.
DFE'nin toplam toparlanması kilogram başına 23,5 miligramdır. %90'ın üzerinde bir saflıkla reçineüzerinde hareketsiz hale getirilen mutlak DFE miktarı, sütuna enjekte edilen DFE kütlesi ile artar ve litre başına yaklaşık 15 gram olan platolar, daha fazla DFE enjekte edildikçe kaplin verimi sürekli olarak azalır. DFE molekülleri, kaplin sonra bile, kırmızı floresan korumak için görülür.
Renk yoğunluğu, hareketsiz DFE'nin toplam miktarına karşılık gelir. Bu nedenle sütun rengi, bağlantı verimliliğini ve sütun kalitesini tahmin etmek için basit bir kalite kontrol parametresi olarak kullanılabilir. Rekombinant 2F5 antikor geçici bir fitotron yetiştirilen Nicotiana benthamiana bitkilerde üretilir.
Ham bitki özü 2F5 yakalama, saflaştırılmış DFE yaklaşık yedi miligram ile birleştiğinde, yakınlık sütunları kullanılarak test edilir. Magnezyum klorür konsantrasyonu 1.25 molar bir iyileşme yakın bir iyileşme ile DFE afinite rezorneden 2F5 elute için yeterlidir 100%ve protein A resinile karşılaştırılabilir yaklaşık% 97 saflık. DFE yakınlık resen10%2F5 atılım dbc, ilk değerinin yaklaşık% 15, 25 döngüleri boyunca doğrusal azalır.
Yakınlık ligandımızın bağlantı kapasitesini optimize etmek için bir deney tasarımı yaklaşımı kullandık. Bu koşullar gelecekte diğer ligandlar için ince ayarlı olabilir. Yöntemimiz ürüne özgü ligand için bir alt taşıyıcı protein iplik floresan protein kullanır.
Aynı zamanda sadece operatöre anında ve sezgisel geribildirim sağlayarak, seferberlik prosedürügörsel bir kalite göstergesi olarak işlevleri ekleyin.
