Biz mükemmel teknik destek için yaptığı paha biçilmez MS enstrümantasyon tavsiye, destek ve erişim yanı sıra Bayan Kelly R. Molloy Profesör Brian T. chait teşekkür ederim. Biz kopya düzenleme ile destek için Sayın Kelly Çıplak teşekkür ederim. Bu çalışma NIH hibe P41GM109824, P41GM103314 ve P50GM107632 tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. Hücre Hasat ve Donma <ol><li> Çevrede 25,26 hücre hattı için uygun kültür koşulları kullanılarak, hücre materyalinin 1-8 g büyütün. Bu protokol referanslar 19,27,28 değiştirilmiş hücrelerin en fazla 8 gram (~ 10 9 hücreleri) için optimize edilmiştir. Tipik haliyle, ~ HEK-293 veya HeLa hücrelerinde 5 g yetiştirilen sekiz 500 cm2 kültürü plakalarına ~% 90 konflüansa elde edilebilir. DİKKAT: Bu protokoller ciddi kriyojenik yanıklara neden olabilecek sıvı azot (LN 2), kullanın. Don koruyucu giysi ve egzersiz uygun taşıma önlemleri. </li><li> Büyük bir behere büyüme ortamı (atık) dökünüz. </li><li> büyük dikdörtgen bir buz tavada buz üzerinde kültür çanak yerleştirin. </li><li> kültür tabağına buzla soğutulmuş 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ile 20 ml ilave edilir ve büyük bir hücre kazıyıcı kullanarak çanak hücreleri serbest; 50 ml&#39;lik bir tüpe hücreleri transferi, önceden buz üzerinde soğutulmuştur; Buz tüpü tutun. NOT: Tüm hücre için taşıma adımları transferi manipülasyonlar sırasında hücrelerin aşırı kesme önlemek için bir elektro-pipet seti için &quot;düşük&quot; ve 25 ml&#39;lik pipet kullanın. 50 ml toplama tüpleri düzenleyin ve önceki işlemleri başlatmadan bir buz kovasının içinde PBS 1x. </li><li> Aynı çanak buz soğukluğunda 1x PBS ilave 10 ml. Kalan hücreleri toplamak ve 50 ml tüp aktarabilirsiniz. </li><li> Her yemek için tekrarlayın; farklı yemekler hücre süspansiyonları örnek sayısı ve plastik atıkları azaltmak için kombine edilebilir. Not: hücrelerin kendileri süspansiyon hacminin büyük bir bölümünü teşkil etmez, çünkü hücre süspansiyonu değerinde üç tabak, iki 50 ml&#39;lik tüp içine birleştirilebilir. 50 ml&#39;lik tüpler aslında nominal hacmi daha fazla tutun, çünkü sekiz tabak genellikle beş tür tüpler yayılmış olabilir. </li><li> 1,000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. </li><li> Süpernatantı dikkatlice dökünüz. 10 ml buz gibi soğuk 1 x PBS içinde, her pelletini. resu birleştirinspended peletler, 5 ila 50 ml başına tüpüne kadar, örnek sayısını azaltmak için. </li><li> 1,000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de santrifüje 5 dak. </li><li> Süpernatantı dikkatlice dökünüz. 10 ml buz gibi soğuk 1 x PBS içinde pelletini </li><li> 20 ml şırınga pistonu çıkarın ve bir kenara koyun. şırınga meme Cap ve buna hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 1,000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de, 50 ml bir tüp ve santrifüj 5 dakika içinde şırınga yerleştirin. </li><li> Hücrelerin sadece üst tabakası kadar bir vakum tuzak sistemine bağlı bir ince uçlu pipet ile süpernatant aspire kadar emilmesini başlar. Bu ıslak hücre peleti ile sonuçlanır. </li><li> , Şırınga kapağını açmak piston yerleştirin ve bir strafor kutu içinde bir LN 2 banyosunda tutulan LN 2 ile dolu büyük bir plastik beher, doğrudan hücreleri damla. Zorla şırınga kalan hücrelerin dalma. </li><li> dökerek 50 ml tüpler için donmuş hücreleri aktarın. Gevşek fazla LN 2 buharlaşmasına izin tüpler kap; t tutun-80 ° C &#39;de hem gece boyunca karıştırıldı. Ertesi gün tam kapaklarını sıkıştırın. Dondurulmuş hücre cryomilling kadar -80 ° C &#39;de bu şekilde depolanabilir. NOT: sıkıca aksi takdirde aşırı basınç tüpü patlamasına neden olabilir, LN 2 gözle görülür buharlaştı öncesi tüm tüpleri kapatmayın. LN 2 fazla su ağırlık ekleyerek, hücreler malzeme üzerinde don birikimi neden olabilir harcanmış ve etkin öğütme üzerine protein konsantrasyonu azaltan sonra tüpleri kapanan değil. </li></ol> Dondurulmuş Hücre 2. kriyojenik bozulması NOT: freze ve manipülasyonlar için tüm araçlar LN 2 ile ön soğutulması gerekmektedir. Küçük bir dekanter kavanoz içinde LN 2 eklemek için kapalı freze kavanozun üstünden LN 2 dökme için gerekli olacaktır. Ev yapımı bir araç referansı 19 gösterilmiştir. Kriyojenik eldivenler LN 2 freze cihazı soğutmalı işlemek için gerekli olacaktır. değirmencilikBurada kullanılan kavanoz kapakları genellikle yüklü bir lastik conta ile birlikte (Malzeme Tabloya bakınız); Bu güvenilir aşağıdaki protokol yürütmek için piyasada mevcut olan teflon kapaklı conta ile değiştirilmesi gerekir. Gaz N2 basınç öğütme sırasında kavanoz içinde yüksek seviyelere kadar inşa edebilirsiniz, çünkü Dahası, biz bir güvenlik önlemi bırakma 28 olarak piyasada mevcut 5 bar / 500 kPa basınç valfi yüklemenizi öneririz. <ol><li> -80 ° C depolama hücre boncuk çıkarın ve bir LN 2 banyosunda 50 ml&#39;lik bir tüp tutucu tutun. </li><li> LN 2 içeren bir temiz dikdörtgen buz kovası, 50 ml kavanoz, iki adet 20 mm&#39;lik topları ve kapağı ön serin. birini kullanarak, eğer politetrafloroetilen (PTFE) yalıtkan önceden soğutmak; Ya diskleri bir dizi (27 referans bakınız) ya da bir kol ve-cin (bakınız Şekil 2). Ön soğutma işlemi tamamlandığında LN 2 yatıştırır şiddetli kaynama. </li><li> Set uygun dengedeğirmen. NOT: Bu kavanoz, kavanoz kapağı kütlesine eşit olacaktır, freze topları kullanılan ve hücrelerin miktarı kavanoza eklenecek. herhangi bir PTFE izolatörler kullanılması halinde, kitlesel de dahil edilmelidir. Biz kavanoz, kapağın kitleleri kayıt ve önceden (kullanılan herhangi izolatör dahil ve bunların kombine kütlesi) ve değirmen yakın saklanan bir bilgi kağıda bunları kayıt topları öneririz. </li><li> forseps kullanarak, önceden soğutulmuş freze kavanoz içinde iki önceden soğutulmuş 20 mm freze topları ve donmuş hücreleri yerleştirin. Not: nedeniyle öğütme sırasında kavanoz ve top yüzeylerde malzemenin küçük kayıpları artar öğütülmüş hücrelerin kütlesi olarak geri malzeme artar yüzdesi. tarif edilen yöntemle, malzeme kayıpları ~ 0.3 g ıslak hücre ağırlığı (WCW) sırasına olmak, çok mütevazı. Üreticinin kurallar numunenin maksimum hacim kavanoz hacmi ~ 1/3 olmalıdır yüklenen gösterir. 29 topları toplam hacmi ~ 1/3 ve r olmalıdıremaining ~ 1/3 boş alan topları serbest dolaşımı içindir. </li><li> ~ ½ tam kavanoz up LN 2 Ekle, kavanozun kapağı yerleştirin ve değirmene aksamını aktarın. NOT: birini kullanarak Öncelikle seçilen izolatörü yükleyin. </li><li> ters-rotasyon yönünü her dakika, hiçbir aralık sonu, 400 rpm, 3 dakika: yerinde montajını Kelepçe ve aşağıdaki programı kullanarak öğütme üç kür gerçekleştirin. Her çevrimde arasında LN 2 ile freze kavanoz soğutun. NOT: topları gezegensel hareket kavanoz içinde çarpışır olarak ayrı bir clunking gürültü oluşturulur freze sırasında. Bu sesler duydum değilseniz, freze meydana gelmiyor. Kavanoz içeriğini, bu döngüyü saymak geri LN 2 kavanoz düzeneğini taşımak ve incelemek değil, freze döngüsünü sona erdir. kurdu hayır buz sağlamak ve varsa, önceden soğutulmuş spatula ile uzak kavanoz duvarlarından onu çip. Adım 2.5 den tekrar başlayın. Hiçbir izolatör veya yalıtkan diskleri kullanıyorsanız, geri kavanoz düzeneğini taşımak LN <sdöngüleri arasındaki ub&gt; 2 serin yeniden ve tam her zaman ½ ~ için LN 2 ekleyin. LN 2 öğütme sırasında kavanoz sıcaklığı arttıkça kavanoz içinde buharlaşır ekledi. Bu kavanoz içindeki basınç birikmesi ile sonuçlanır. değirmen kavanozu boşaltırken, bu nedenle, çok yavaş kelepçe bırakın. kelepçe hızla bırakılırsa, hücre toz hızlı basıncın ile kaçabilir. kelepçenin yavaş salgılanan yumuşak, kontrollü bir şekilde kavanozdan kaçmasına basıncın ve hücre malzemesinin kaybını önler. Bu normaldir - gazlı N2 nazik kaçış genellikle kelepçe yavaşça serbest olarak tıslama duyulabilir. Bir kol-ve-cin yalıtkan kullanıyorsanız, kavanoz montaj değirmende sol ve LN 2 yerinde izolatör / kavanoz montaj eklenebilir. </li><li> Geri LN 2 kavanoz taşıyın ve soğutmak için bir an dinlendirin. Bir manşon ve-diski yalıtkan kullanılıyorsa, kavanoz kol W çıkarılabilirher iki tarafta kaldıraç sağlayan iki spatula yardımıyla, i. Kavanoz LN 2 dinlenme sonra, dikkatlice forseps kullanarak topları kaldırmak, kapağı kaldırmak ve önceden soğutulmuş bir spatula kullanarak önceden soğutulmuş 50 ml tüp toz transferi. Açık kavanoz / toz biraz LN 2 ekleme kaldırmadan önce, topları üzerine fırıncı olan toz çıkarmak için yardımcı olabilir. NOT: Kavanoz açıldıktan sonra, topları çıkarmadan önce ona LN 2 küçük bir miktar ekleyin. Bu yüzeylerde fırıncı toz kurtarmak için yardımcı olacaktır. Hücre tozu -80 ° C veya altında, kullanılıncaya kadar tutulmalıdır. Deneyimlerimize göre, hücre toz performansı etkilemeden, esas olarak sonsuza kadar bu şekilde saklanabilir. </li></ol> Hücre özleri Protein Kompleksleri 3. Affinity Yakalama NOT: Aşağıdaki protokol faiz, eş protein ile etkileşime afinite bir afinite ligandı oluşan medya, yem ya da antikor uygularparamanyetik boncuk ölçekli mikron için upled. Bu ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak, in-house 19,30 hazırlanabilir ya da hazır reaktifler olarak satın alınabilir. <ol><li> Hücre ekstresi hazırlanması NOT: Hücre tozu tutarken, mutfak eşyaları ve tüpler LN 2 ile önceden soğutulmuş kullanmayı unutmayın. Hücre tozu içeren tüpler her zaman değil -80 ° C&#39;de LN 2 tutulmalıdır. 50 ml tüp (ler) LN 2 plastik bir kap içinde, tüp raf hücre tozu içeren yerleştirin. <ol><li> 1.5 ya da 2 mi mikrofüj tüpe, hücre tozu 100 mg tartılır. NOT: hücrelerin bu miktar genellikle nanogram yüzlerce onlarca hedef proteini verecektir iyi bir başlangıç ​​noktasıdır başına kopya binlerce, bir orta ifade protein (~ 50 kDa kitle için afinite yakalama sonra mevcut aralığı olduğunu gözlemledim hedefin çıkarma ve yakalama verimliliği küstah hücresi), ≳70% bulunmaktadır. Bu tür verimler doğrudan visualiz sağlamakSDS-PAGE ve protein boyama ile saflaştırılmış fraksiyonunun yapımı. </li><li> Boş mikrofuge&#39;de tüp ile dara analitik terazi. Bir LN 2 kaşık veya spatula soğutmalı kullanarak bir tüp içine hücre tozu dağıtın. analitik terazi üzerinde tüp içinde dağıtılan toz kütlesini kontrol edin. NOT: Hücre tozların dışarı ağırlığında, küçük hacimsel ölçüm kaşık kullanılabilir kolaylaştırmak için. Bunlar (19 referans bakınız) tekrarlanabilir sonuçlar verdiği bulunmuştur. Biz vidalı kapak ya da &#39;güvenli kilit&#39; mikrosantrifüj tüpleri kullanılarak en iyi sonuçları bulduk. Potansiyel olarak örnek kaybı ile sonuçlanan - Standart mikrosantrifüj tüpleri hemen önce ekstre çözeltisine ilave edilmesinden sonra ısıtma sırasında açık pop neden olabilir tüpleri girebilir LN 2 buharlaştırma Basınç. </li><li> tüp açın (veya vidalı kapağı gevşetin) hücre tozu ile ve 1 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Bu tüp içindeki basıncı serbest bırakmak ve ekstraksiyon hemen donmaması olacakÇözelti, tozun ilave edildi. Hiçbir çözülme bu 1 dakika inkübasyon sırasında görülmektedir. </li><li> 3.1.5 adımına geçilmesi sırasında kısa bir süre için, daha sonra buz üzerinde tutmak proteaz inhibitörleri ve vorteks ile takviye özümleme 400 ul ekle. Numuneler elüsyon kadar daha sonraki tüm manipülasyonlara arasında buz üzerinde tutulmalıdır. Not: özütleyici iyi bileşim olup protein kompleksi (ES) bağlıdır arıtılacak. Bazı genel bilgi, Tablo 1 ve destek referanslarda verilmektedir. </li><li> örnek, herhangi bir agrega dağıtmak için kısa bir düşük enerji darbe vermek için bir mikrotip ultrasonikatör kullanın. 4 bakliyat (2 saniye her 2 A; toplam enerjinin yaklaşık 15-20 J) ile (Ultra) sonikasyon. NOT: Vorteks özümleme içine hücre tozu dağıtır, ama çözüm karakterine bağlı olarak, bazı büyüklükler görülebilir. Biz bu agrega dağıtma sonraki afinite çekimi sırasında en iyi verimi sağladığını bulmuşlardır. Kısa bir mikro uçlu sonikatyon kolayca bu agrega dağılır. Çözüm açık agrega olmadan, yarı saydam, ancak homojen görünmelidir. Su banyosu sonicators verimli önemli ölçüde daha uzun numune alma süreleri olmadan bu tür agrega dağıtmak için çok düşük güç olma eğilimindedir, ancak uygun ayarlarla uygun olabilir. </li><li> Santrifüj ile özü netleştirmek (örneğin, 20,000 xg, 10 dakika, 4 ° C). Not: berraklaştınlmış hücre Özütün bir alikotu, pelet, post-afinite yakalama yüzer içeriğine karşılaştırma için kaydedilebilir ve afinite ortamının elüsyonundan sonra, elde edilen fraksiyonlar, hedef proteinin ekstre etkinliğini ve yakalama belirlenmesi örneğin, Western blot ile (tartışma). </li><li> süpernatant (açıklık ekstresi) çıkarın ve afinite yakalama geçin. Not: pelet, hedef protein D&#39;salım derecesini belirlemek için, 70 ° C &#39;de, SDS-PAGE numune yükleme tamponu içinde yeniden ekstre edilebilirAşama 3.1.6 &#39;de elde edilen ekstrakt ile karşılaştırıldığında, başlangıç ​​denatüre edici olmayan ekstraksiyon uring. </li></ol></li><li> Affinity Yakalama <ol><li> Manyetik afinite orta ön yıkama. Hücre ekstreleri santrifüj edilirken bu yapılabilir. </li><li> mıknatıs tüpü (ler) yerleştirin. boncuklar kaldırılacak depolama çözümü izin, saniyeler içinde tüpün tarafında birikir. </li><li> tanelerine ekstraksiyon çözeltisi 500 ul ekle. orta hızda Kısaca vorteks karışımı (tekrar süspansiyon için yeterli). alt tüm içeriğini toplamak için bir mini-santrifüj tüpleri Darbe dönerler. Aksi takdirde çözümler asgari taşınmasını sağlar. mıknatıs tüpler yerleştirin ve çözüm aspire. NOT: ayırt edici özelliklere sahip Manyetik medya ticari tedarikçiler geniş bir yelpazede temin edebilirsiniz. Sonuçlar boncuk büyüklüğü, bütünlüğü, yüzey kaplama ve antikor birleştirme kimyası da dahil olmak üzere, bu özelliklere bağlı olarak değişebilir. Side-by-siuygulamanızda de çalışmalar bir seçim ayıracı yerleşmeden önce tavsiye edilir. </li><li> tekrar süspansiyon kısaca önceden yıkanmış afinite orta ve vorteks içeren bir 1.5-2.0 ml tüp açıklık hücre ekstresi aktararak afinite yakalama başlatın. </li><li> çevirici tekerlek sürekli hafifçe karıştırılarak, 4 ° C &#39;de 30 dakika boyunca inkübe edin; boncuk inkübasyon boyunca asılı kalmalıdır. </li><li> tüpün dibine tüm içeriğini toplamak için bir mini-santrifüj tüpleri Darbe dönerler. Süpernatant aspire ve aşama 3.2.3 de tarif edildiği gibi, soğuk ekstraksiyon çözeltisinin 1 ml&#39;si ile boncuk üç kez yıkayın. mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. çözüm çıkarın. sonraki çözümü eklemek ve tekrar devam edin. 2. Yıkama sırasında, pipetleme yeni bir mikrofüj tüpe birlikte boncuklar ve yıkama solüsyonu aktarın. Bu T ile inkübasyon için kullanılan tüpün duvarlarına adsorbe rastgele proteinleri tarafından, elüsyon noktada numune kontaminasyonu azaltıro özü hücre. 3. yıkamadan sonra, boncuklar altına tüm içeriğini toplamak için bir mini-santrifüj darbe bükülmüş kısaca olmalıdır. geri mıknatıs tüp yerleştirin ve kalan sıvı kaldırmak. Bu, elüsyon homojen hacimli olacaktır elüt örnekleri sağlanması önce çözeltinin son birkaç ul kaldırılmasını mümkün kılar. Aynı zamanda elüsyon çözümü artık yıkama seyreltilmiş olmayacak gibi sağım, etkili olacak sağlar; bu kalıntılar, aynı zamanda bir tuzu etkilerine katkıda (aşağıya bakınız), SDS-PAGE protein göçünü değiştirebilir. Not: sonrası bağlayıcı Yüzer kısımdan bir şişe 3.1.6 oluşturulan açıklık ekstresine karşılaştırma için kaydedilebilir. western blot ile. Sonuç hücre özütünden hedef proteinin tükenmesi derecesini gösterir. </li><li> ya bir doğal veya denatüre edici bir şekilde elüte; alt uygulama 1 için en iyi strateji düşünün. NOT: Yerli elüsyon Strategie ayrıntılarıs kullanılan afinite etiketi (Tartışma bakınız) bağlıdır. Protein lekeleme 31 SDS-PAGE ile numunenin analizi ile takip edilen SDS-PAGE örnek tamponu ile elüsyon denatüre çoğu kullanıcı için, en pratik ilk yaklaşım olacaktır. NOT: elektroforez sistemi bağlıdır örnek tampon bileşimi kullanılır. Birçok laboratuarları süreksiz elektroforez ve Laemmli tampon sisteminin 32-34 yararlanarak, kendi Tris-glisin jeller attı. Ortak bir örnek tampon tarifi (1x) içerir:% 10 sukroz, 50 mM DTT,% 2 Blue SDS (w / v), 62.5 mM Tris-CI pH 8.8,% 0.0004 (ağırlık / hacim) bromofenol 31 (w / v) . Biz DTT atlar bir 1.1x stok hazırlanıyor öneririz. 500 mM DTT hacmi SDS-PAGE önce örnek eklenmelidir inci 1/10 (aşağıya bakınız). Pek çok ticari olarak temin edilebilir, SDS-PAGE sistemi de mevcuttur; Bu sistem özel numune tamponları içerebilir. </li><li> serbest azaltmak için (indirgeme maddesi SDS-PAGE numune tampon eklemeboncuklardan antikor zincirlerinin) ve çalkalama ile oda sıcaklığında 5-10 dakika süreyle inkübe edin. NOT: Bu süpernatant içine çekilen proteinleri serbest, çoğu afinite bazlı etkileşimleri müdahale edecek. Daha kalıcı etkileşimler serbest bırakılması için yüksek sıcaklık yararlanabilir (tipik olarak 70 ° C yeterlidir). </li><li> Toplamak ve süpernatant kaydedin. Numuneler kısa bir depolama için -20 ° (birkaç gün) dondurulabilir veya -80 uzun depolama ° C Analiz istendiği kadar. </li><li> Standart teknikler 31 kullanılarak protein boyama ile takip edilen SDS-PAGE numune, öznenin. MS numune bileşimi 1 karakterize etmek için kullanılabilir. Bağımsız protein bantları tanımlanması için eksize edilebilir ya da tüm örnek, yalnızca kısa bir süre için (jele 4-6 mm) örnek elektroforeze ve bir araya numunedeki tüm proteinlerin işlenmesi tek bir analizde, özelliği edilebilir &quot;jel yatağından. &#39; NOT: inisiyatif önce DTT ekleting elektroforezi. Planlama MS geçmek için, numuneler elektroforez 35 sonra alkillenebilir; Bununla birlikte, önceden elektroforez 36 alkillemek için sıklıkla daha uygundur. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu üç protokol (1), cryomilling katı hal kırılması için hücreleri hazırlamak (2) bir planeter bilyalı değirmende kırılma elde etmek ve (3) ile kompleks yakalama ilgili bir proteini afinite hücre toz özler üretmek için birlikte çalışır fizyolojik Uygulayıcılar. Birçok farklı hücre parçalama teknikleri kırma etkisi, kesme ve / veya basıncı kullanılarak mekanik / fiziksel yaklaşımlar, yanı sıra kimyasal / enzimatik yaklaşımlar, farklı artıları ve eksileri 49,50 ile her dahil mevcuttur. Her araştırmacı hücre kırılması ve protein ekstraksiyonu için seçilen herhangi bir yaklaşım (aşağıda açıklanmıştır) ampirik optimizasyonu gerektiren önyargıları 51,52 tanıtmak için muhtemel akılda tutarak, onların analizleri için en uygun yöntemler keşfetmek için teşvik edilmektedir. Mekanik yöntemler protein kompleksleri bozabilir yüksek ısı ve / veya kesme kuvvetlerine neden olabilir. Cryomilling t örneklerin LN 2 soğutma istihdam sayesinde ısıtma etkilerini önlersürecin kendisi süresi. Planet bilyalı değirmenler parçacık büyüklüğü azaltma 53,54 bileşenleri olarak, kesme stresi dahil olmak üzere etki ve sürtünme kuvvetleri, dayanmak anlaşılmalıdır. ayarlarda biz protein komplekslerinin dejenerasyonu gözlenen değil bildirdi. Nitekim biz çıkarılan ve &#39;yumuşak&#39; deterjan bazlı lizis 7 kullanan hazırlıkları daha yüksek spesifik aktivite sergileyen görünüşte sağlam ~ 50 MDa nükleer gözenek kompleksleri 11 ve enzimatik olarak aktif retrotranspozonlar erişebilirsiniz. Hücre lizizi kimyasal / enzimatik yöntemler hücre içeriği, bir in vitro ortamı hücre zarları ve yapısal makromoleküllerin bozulması destekler ancak protein kompleksinin bütünlüğünü korumak için uygun olmayabilir (ES salınan ama bunlarla sınırlı muzdarip ) ilgi. Sık sık, ne komplekslerinin bileşenleri ilgi protein ile oluşturulan, ne de koşullar hedef kompleksleri stabilize etmek için gerekliönceden bilinen. Katı hal öğütme en büyük yararı, kırılması ve çıkarma kaynağı malzeme yönlendirilir, bağlanmamış olan, ilave sıvının serbest hazırlanabilir (veya aşağıdaki -80 ° C&#39;de) içinde saklanarak, topladığı ve uygun isteğe bağlı deney için alınacak olduğu; örneğin, afinite yakalama in vitro koşullarda optimize araştırmak için. Protein etkileşimleri dolayısıyla özütleyici hacmini fizyolojik etkileşimlerini muhafaza etmek için avantajlı olabilir en aza indirerek, yüksek konsantrasyonda 55,56 en stabildir. Öte yandan, pratik hususlar vardır - protein kompleksleri afinite ortamı ile hedef kompleksleri karıştırmak için, hücre dışına ve çözünmez agregaların ücretsiz ağdalı olmayan sulu fazda, içine bölümlenmiş gerekiyor. Ayrıca, in vitro ortamda (pH, tuz konsantrasyonu, vb) üzerinde bir miktar standardizasyon ve kontrol sistemli ve yeniden üretilebilirlik için gereklidir. Biz pr özler bulmakseyreltme aralığında oduced 1: 4-1: 9 (w: v) kaliteli sonuçlar veren pratik ve teorik endişeler, tatmin. Buna ek olarak, orta ihtiyaçlarını afinite hücre ekstresi uygun oranı belirlenir. Bu yakınlık ortamın değişen miktarlarda özler titrasyon ile deneysel olarak yapılır ve aşağıda daha ayrıntılı olarak ele alınan, deney sinyal-gürültü oranı saptanabilir etkiler olabilir. Hedef proteinin mükemmel tükenmesi tipik haliyle, hedef proteinin eriyebilen fraksiyonunun ≥70%, ancak&gt;% 90 tercih edilir ve ekstraksiyon şartlarına dikkatli parametre ile elde olabilir. Gibi pek çok pratik hususlar referans 1 kaplıdır. Ev yapımı alternatifler canlı olmasına rağmen paramanyetik boncuklar, özel bir mikrosantrifüj tüp tutucu neodimyum mıknatıslar kullanılarak manipüle. tutucu içine yerleştirilen tanecikler manyetik alanın etkisi altında lastiğin yan toplanır. Çözümler sonra di olmadan kaldırılmış olabilirboncuk sturbing. Burada kullanılan planet bilyalı değirmen ile geliştirilen sunulan cryomilling protokolünün bir sınırlama, (Malzeme tabloya bakınız) malzemenin minimum miktarda etkili bir tesis için gerekli olan bu cihaz (&gt; 1 g) kullanılarak hücre tozu geri olmasıdır. Bu gibi miktarlar, kolayca çok sayıda mikrop, hücre çizgileri ve model organizmalar ile elde edilir, ve aynı zamanda sık sık laboratuar hayvanları eksize dokuları ile elde edilebilir. Bununla birlikte, bazı hücre çizgileri az olabilir bolluğu ve hayvan dokularında büyümesi çok zor olabilir. malzemenin daha küçük miktarları nispeten elde edilen bir toz incelik kurban olmasına rağmen, potansiyel olarak daha küçük kaplar kullanılarak diğer aygıtları kullanarak öğütülebilir. Buna ek olarak, mekanik öğütme cihazların maliyeti, bazı laboratuarlarda için çok pahalı olabilir olabilir. Bir haşere kullanarak el ile en ekonomik bir de dahil olmak üzere, alternatif kurulumları 14-19 bir dizi kullanılarak elde edilebilir Cryomillingle ve harç, kırılma verimliliği önemli ölçüde düşer rağmen. Afinite yakalama protokoller genellikle bu nedenle maksimum protein çözeltisi içine ekstrakt edildikten ve hedef protein kompleksleri yakalanması için maksimum potansiyel kolaylaştırmak için hücre lisis oluşumunun bir yüksek verim için amaçlanmıştır. Diğer yandan, bu tüp ekleme maya için gösterilmiştir maksimum liziz nitro biyokimyasal etki 57,58 maksimal ile eşit olmayabilir ayıklar. Biz şu ana kadar test edilen sistemlerde bu tür sorunları görülmez ve cryomilling bu nedenle kasıtlı eden hücre kopması sınırlamamaktadır. In vitro enzimatik tahliller için optimize Yine de, bu olasılığı akılda tutulmalıdır. cryomilling hücrelerinin kırılması için çok etkili bir yöntem olmasına rağmen, homojen olmayan agrega zaman görsel muayene ile gözlemlenen, çünkü, sonication sınırlı bir miktarda, genellikle memeli dokularında üretim homojen bütün hücre hülasaları yarar: tipik haliyleekstraksiyon koşulları tuzu (100-300 mM) ve iyonik olmayan bir deterjan (% 0.1-1 h / h) konsantrasyonları düşük-orta kullanılmıştır. bu agregaların varlığı sonraki afinite yakalama verimini ve / veya kalitesini düşürebilir görülmektedir, çünkü biz rutin (onlar çıplak gözle görülmez bile) onları dağıtmak için sonikasyon uygulamak. Agrega önce öğütülmüş maya hücreleri 58 özütlerinde bildirilenlere benzer aglomere membran fragmanları ile tutarlıdır. Sonikasyon için de aynı şekilde bu protokolü uygulanan sonikasyon derecesi parçası DNA kayda değer değildir, DNA kesme ve çözelti içine kromatin parçaları serbest bazı protokoller kullanılır. ilgi konusu proteinine karşı mükemmel bir afinite ligandı veya antikorun sınırlı sayıda (ya da yüksek maliyet) başka engel olabilir. piyasada mevcut afinite reaktifler geniş bir dizi model organizma genomik etiketleme ya da tr mükellef olduğunda kaldıraçlı olabilirafinite etiketli füzyonları olarak ilgi konusu olan proteinlerin ekspresyonunu ektopik ifade vektörleri ile ansfection. Ancak, özel antikorların üretimi artan mümkün hale gelmiştir ve her ikisi de poliklonal ve monoklonal antikorlar, afinite yakalama uygulamalarda mükemmel gerçekleştirebilir. Bunlar pek çok unsuru da referans 1 daha detaylı olarak ele alınmıştır. Afinite ortamın hücre parçalama yöntemi ve bir seçim sonuçları nasıl etkilediğini örnekleri, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Farklı ekstraksiyon ile sağlanan etkilerin örnekleri, referans 1,11,24 görülebilir. Bu ve diğer deney parametrelerinin zor hekimlerini ayırt hale afinite yakalama kalitesini etkileyebilir, çünkü &quot;kordon proteomlarda&quot; ve hesaplama yaklaşımlar depoları spesifik olmayan kirletici FP 40-43 belirlemeye yardımcı geliştirilmiştir ortadan kaldırmak için. Bununla birlikte, bu tür yaklaşımlar sadece substitSınırlı ölçüde 59 optimal numune hazırlama ute. en iyi uygulamaları gözlemlemek ve ampirik afinite yakalama deneyi, aşağı analizler için daha aşağıda tartışılan en kaliteli örneklerini sağlayacaktır optimize. örnek saflığı artırabilir kolay uygulanabilir pratik yerli ayırmaktır. Ana yıkama en çok fazla deney için sağlam afinite izole edilmiş bir protein kompleksi elde etmek için kullanılır; sık sık örnek saflığı artırır gibi, aynı zamanda bu nedenle tek başına kullanılabilir. Şekil 1, panel II gösterildiği gibi, ancak, Örnek saflığını geliştirmek için ana elüsyon kabiliyeti, hücre özü hedef proteinin bolluk afinite ortamın miktarına doğru titrasyon bağlıdır - Orta fazla olduğunda , boş paratoplar doğal akıtılan fraksiyonları gözlenebilen AP proteinlerinin dışı hedef birikimini izin verebilir. Burada açıklanan reaktifler ve prosedürler kullanılarak, bu HBizim deneyim olarak deneylere FP tek en büyük katkıyı bir kez canlı hücrenin bağlamında kaldırılır takılı protein kendisi olduğunu. (Şek. 1.II ve Şek. S1). Bu gibi durumlarda, antijen yokluğunda alakasız Proteomlar elde parental hücre hattı kontrol pratik değere sahip; aynı şekilde hedef antijen şey ama yoksun olan etiket okunur veya başak-denetimler için. Bu nedenle, doğrudan sayısal MS kullanarak post-lizis protein etkileşimleri birikimini ölçen I-KİR 7,38, ne zaman pratik uygulama. protokol Aşama 3.2.7 belirtildiği gibi, ana elüsyon için prosedürler kullanılmıştır afinite sistemi detayları ile değişecektir. Ana yıkama en çok eğilim aracı kompleksin serbest, etiketin etiketli protein kompleksi ya da proteolitik yarılma rekabetçi şekilde çıkarılması ile elde edilir. küçük epitop etiketleri oluşan çeşitli afinite sistemleri fo, mevcutR epitop kendisi etiketlenmiş protein kompleksleri 60 rekabet elüsyon için yararlı bir peptid olarak mevcut olduğu. Aynı şekilde, birçok proteazlar füzyon proteinleri 61 özel stratejik afinite yerleştirilen soydaş siteleri yarmak için kullanılabilir etiketli vardır. seçilen afinite sistemlerinin özelliklerine bağlı olarak, uygun bir yıkama düzeni kabul edilebilir. Genellikle, elde edilen sonuçların kalitesi önemli ölçüde numune hazırlama kalitesi ile etkilenecektir. Bakım ve hassasiyet korurken mümkün olduğu kadar çabuk bu protokollerin her adımda dikkatli ve hassas çalışmak ve önemlidir. Her manipülasyon etkinliğini anlamak için her adımda ilgilenilen proteinin bölümleme izlemek için tavsiye edilir. Örnek: söz konusu hücre ya da dokuda ilgili protein kadar bol? Belki çalışmada (ve kompleksleri) kapsamında, protein kütlece karakterize zor olacakDüşük bolluk nedeniyle spektrometresi. Saflaştırılmış Kompleksi (yaklaşık aralığı nanogram), genel protein lekeleme ile tespit ise, kütle spektrometrisi başarılı muhtemeldir. ilgi yakalanan proteinin, sadece duyarlı geliştirilmiş kemiluminesans batı lekeleme (yaklaşık pikogram aralık) tarafından tespit edilebilir varsa, kütle spektrometresi etkili olabilmesi için daha az olasıdır. İlgili protein hücre içinde bol miktarda olsa bile, hücre özü ne kadar bol üretilir? çözüm protein bölümü mı yoksa pelet var? İkincisi ise, yeni bir çıkarma çözüm düzeltebilir bu icat edilebilir. Hücre ekstresi için eğilim aracı ile birleştirilir sonra, ne kadar etkili proteinin yakalanır? Protein sonraki yıkar bağlı kalacağı mu? Peki ya diğer copurifying proteinler hakkında? protokol uygun adımları her numunenin bir bölümünde kaydederek Bu sorular havaalanı protein karşı Western blotting ile tipik haliyle, cevap olabilirya da genel bir protein boyama, ancak diğer deneyler de uygun olabilir. bir trade-off bir özelliği ya da diğer maksimize yapılacak olabilir ancak her adımı en iyi duruma getirme, yakalanan komplekslerin verim ve saflık artıracaktır. Birçok araştırmacı için afinite yakalama tipik bir uygulaması, ilgi konusu olan proteinlerin az sayıda in vivo uygulayıcılara adayı tespit etmektir; Bu adaylar genellikle fiziksel interactors biyolojik önemini göstermek için in vivo dik yaklaşımlarla doğrulama tabi tutulur. Affinity yakalama ayrıca, bir (neredeyse) proteom çapında gözlenen proteinleri copurifying in vivo komplekslerinde varsayılan ilişkin hesaplama çıkarımlar kolaylaştıran listeleri oluşturmak için yüksek verimli çalışmalar tarafından istihdam edilmektedir. Bu tür çalışmalar, çok sayıda örnek literatürde bulunabilir. Bu yaklaşım keşfetmek insanın lehine verilen herhangi bir hedef için yakalama koşullarının optimizasyonu foregoesy hedefler; Böyle, olayla kompleksleri olarak kendilerini nadiren herhangi bir numunede tamamen sağlam ve son derece saf alınır. Bunun yerine, bir çok farklı afinite çekilen örnekler arasında görülen bileşimler kısmi örtüşmeler çıkarımlar 42 bir temel olarak kullanılır. Her iki yaklaşım da interaktom anlayışımıza değerli verileri katkıda bulunur. Bununla birlikte, afinite yakalama biri büyük yararı sık sık, sağlam ve yüksek derecede saflaştırılmış çabalar prosedürünü optimize etmek için yapılması kaydıyla kompleksleri elde etmek için fırsat sunuyoruz olmasıdır. Biz, yaklaşım geleceği fizyolojik interactors ve daha aşağı biyokimyasal, enzimolojik daha sık kullanılması ve yapısal çalışmaların gamının daha doğru değerlendirilmesi için kolay ve endojen protein kompleksleri 11 yakalanmasını optimize verimliliğinin arttırılması yatıyor inanıyoruz örneğin, 7,9,23 başvuruyor.

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:
<ol start="29">
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
	<li>Williams, R. J., &#38; Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911&#8211;1912 (1932).</li>
	<li>Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
</ol>
to:
<ol start="29">
	<li>Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1&#8211;3at &#60;http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/&#62; Retsch GmbH (2014).</li>
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
</ol>

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated.

Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Prosedürlerde tipik bir uygulaması, interactomic karakterizasyonu 1 ilgi endojen protein kompleksleri, yüksek verim ve saflıkta stabilize etmek ve elde etmektir. Esas olarak proteinlerden müteşekkildir hem stabil ve geçici olarak ilişkili olan makromoleküler kompleksler, dinamik ağlar, hücresel süreçleri 2,3 orkestra anlaşılmaktadır. Protein-protein etkileşimlerini belirlemek için çok sayıda deney yaklaşım olsa da, afinite yakalama izole edilmesi ve fizyolojik protein kompleksleri 4-6 kesme için en yaygın olarak kullanılan yöntemler arasında yer alır. Ayrıca, bu teknik, bir görüntü-okuma veri noktaları olarak sadece fiziksel kişiler gibi makromoleküler kompleksler üretme avantajına sahiptir; Avantajlı olarak, elde edilen kompleksler böylece ek alt biyokimyasal, enzimatik ve yapısal deneyleri 7-9 bir dizi de kullanılabilir. sunulan protokoller protein, harita ihtiyacına yanıt olarak geliştirilmiştirn-protein etkileşim ağları hücre biyolojisi efektör molekülleri olarak kendi rollerini makromoleküler kompleksleri karakterize ve. Bunlar doku kültüründe yetiştirilen memeli hücreleri için kendi uygulama ile ilgili olarak detaylı bir, ama uygun sistem özel ince ayarlar belirli bir biyolojik numune bir yelpazede aynı şekilde uygulanabilir. afinite yakalama tarihi ilk immünoafinite kromatografisi deneyleri ile geri yirminci yüzyılın uzanan - yaygın immunoprecipitation olarak günümüzde adlandırılan benzeyen (IP) - 1950&#39;lerin başında literatürde görünen. Tekniğin ana kullanım, mevcut 10-13 Bu yüzyılın geliştirilecek. Çeşitli hücre ve moleküler biyolojik çalışmalar, en azından son kırk yıl 14-19 için kriyojenik sıcaklıklarda öğütülmesi ile hücrelerin mekanik kırılmasını kullanmış olması; ve (süper) paramanyetik boncuk kullanılarak moleküler ayrımları bec varSon yirmi yıl 20&#39;den fazla giderek daha yaygın ome. Kendimiz tarafından üretilen işin geniş bir gövde ve daha geniş araştırma topluluğu tarafından kanıtlandığı gibi, sinerjik protein kompleksi afinite yakalama deneylerinde 1 elde edilebilir sonuçları iyileştirmek için hizmet vermiştir bu farklı teknolojileri birleştirerek 7,9,11,18,19,21 -23. Destekleyici sonuçları Şekil 1&#39;de sunulmuştur. Uyarılar ve etkili afinite yakalama deneyleri yürütme için geçerli hususlar koleksiyonu referansı 1 bulunabilir. Örneğin, ilgi konusu bir protein inter aktörlerin katalog şimdiye kadar bilinmeyen copurifying proteinleri (keşif analiz) tespit etmek için protein kütle spektrometrisi (MS) (I) e;: Tipik haliyle, bu yaklaşımın en uygun olan Belirli bir karşılıklı etkileşim eşinin mevcudiyetinde (II) deneyi, örneğin, içinde olduğundan şüphelenilen bir protein, özellikle protein veya sınırlı sayıda tespit etmek için, MS veya Western blot kullanımıfaiz (hipotez testi) protein ile teract; ya da (III) Ek teknikler ile daha fazla çalışma ile (hazırlama muamele) için ilgi konusu proteini ihtiva eden endojen monte edilmiş protein kompleksleri hazırlamak. bir afinite yakalama deney rejimine başlamadan önce, hedef proteinin, ilgilenilen doğal hedef proteinine karşı veya bir füzyon proteini eklenmiş bir etiket karşı, tipik olarak, bir IP-kompetan antikora bağlanan bir yüksek kaliteli afinite reajanı için kesinlikle gereklidir. tüm yaygın afinite yakalama ile birlikte kullanılan, Western blotting, ve protein MS (örneğin Coomassie mavisi, SYPRO Ruby veya gümüş aşağıdaki SDS-PAGE), genel protein lekeleme: yerinde yapılan deneysel okuma uygun yöntem için de önemlidir 1. sunulan protokolleri için eğilim aracı olarak bir antikor konjuge manyetik boncuklar kullanmaktadır. Iken afinite orta işlevi başlangıçta, birkaç deneysel parametreleri kullanan testlerde doğrulanabilirHer deney ampirik 1,11,24 optimize edilmelidir iyi sonucu elde. protokolleri üç ayrı faza ayrılır: donmuş hücre malzemesinin (1) hazırlanması; (2) çok düşük bir sıcaklıkta katı halde öğütme hücre kopması; ve (3) ekstraksiyon ve antikor-bağlı para-manyetik boncuklar kullanılarak afinite yakalama.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1304">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Growth media &#38; cell culturing implements</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:403px;">For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 cm^2 culture dishes</td>
			<td style="width:172px;">Corning</td>
			<td>431110</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large beaker (1-2L)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular ice pan&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>13-900-747</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large cell scrapers</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-100-242</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid nitrogen&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">50 ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td>For producing frozen cells (I), &#38; cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 ml Luer lock syringe</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur lock syringe caps</td>
			<td>www.dymax.com</td>
			<td>T11182</td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Refrigerated centrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml tube rack, 4 position</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Styrofoam box</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &#38; affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Planetary ball mill, PM 100&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.540.0001&#160;</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling jar, 50 ml&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>01.462.0149</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel milling balls, 20 mm &#216;&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>05.368.0062</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm&#160;&#160;</td>
			<td style="width:172px;">www.marcorubber.com</td>
			<td>T1044-2.62x44.63</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">mini-LN2 decanter</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">see Ref 19</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml PTFE jar insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">Retsch</td>
			<td style="width:164px;">custom order</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">PTFE puck insulator (optional)</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;">The Rockefeller University</td>
			<td>For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional)</td>
			<td style="width:172px;">http://www.leeimh.com/</td>
			<td style="width:164px;">558 series check valve</td>
			<td>For cryomilling (II)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">1.5 - 2 ml microfuge tubes</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Extractant</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:567px;">cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:172px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:164px;">11873580001</td>
			<td style="width:403px;">For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Microtip sonicator, Q700</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">Q700</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">low intensity 1/16&#8221; microtip probe</td>
			<td style="width:172px;">Qsonica</td>
			<td style="width:164px;">4717</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Bench-top refrigerated microcentrifuge</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Dynabeads M-270 Epoxy</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:164px;">14302D</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads</td>
			<td style="width:172px;">homemade</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III); see reference 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Sample rotator&#160;</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Neodymium magnet</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:164px;">123-21D&#160;</td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent)</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">DTT</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">SDS-polyacrylamide gel</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:567px;">Protein Stain</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td>For affinity capture (III)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells

Affinity yakalama fazla çalışma için endojen protein kompleksleri izole etmek için etkili bir tekniktir. bir antikor ile birlikte kullanıldığında, bu yöntem, aynı zamanda sık sık immüno olarak adlandırılır. Afinite yakalama bir laboratuvar ölçekli ve yüksek verimli bir çerçevede uygulanabilir. Protein kütle spektrometrisi ile birleştiğinde, afinite yakalama interaktom analizi bir beygir olduğu kanıtlanmıştır. ilgili sayısız adımlar yürütmek için potansiyel birçok yolu olmasına rağmen, aşağıdaki protokoller bizim tercih yöntemleri uygulamak. İki özellik ayırt edici: eğilim aracı olarak hücre ekstreleri ve antikor-bağlı paramanyetik taneler oluşturmak için cryomilled hücre tozun kullanımı. Bir çok durumda, daha geleneksel bir afinite yakalama uygulamaları ile elde edilen üstün sonuçlar elde edilmiştir. Cryomilling hücre kopması diğer formları ile ilgili çok sayıda sorun önler. Denat kaçınarak Bu malzemenin verimli kırılma içerirIsıtma veya köpük ilişkili doyma sorunları. Bu makromoleküler ayrışma hafifletici, çıkarma noktasına doğal protein konsantrasyonu yukarı korur. Bu ekstre proteinler zararlı enzimatik aktiviteleri sınırlar çözelti içinde harcadığı zamanı azaltır ve afinite ortamı tarafından proteinlerin spesifik olmayan adsorpsiyon azaltabilir. Mikron ölçekli manyetik afinite medya giderek geleneksel agarose- ve Sefaroz tabanlı medya yerine, son birkaç yıl içinde daha yaygın hale gelmiştir. manyetik ortamda İlköğretim faydaları genellikle daha düşük spesifik olmayan protein adsorpsiyonu arasında; protein kompleksi bağlama çünkü hiçbir boyut dışlama sınırı yerine gözenekleri içinde daha boncuk yüzeyinde meydana gelir; ve manipülasyon kolaylığı ve mıknatıslar kullanılarak taşıma.

Şekil 1, panel ben cryomilling ve manyetik boncuk örnek kalitesini artırmak için birlikte çalışabilir olduğunu göstermektedir. Paneller IA-Cı afinite yakalama için kullanılan çözünmeyen bir ortam ihtiva eden malzemenin geri Proteomun 19 etkileyebilir göstermektedir. İlgili protein saflaştırılmış FLAG-etiketli bakteriyel alkalin fosfataz (BAP), insan hücre ekstreleri halinde spaykı. BAP özel etkileşim insan proteinleri copurify beklenmemektedir. SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile değerlendirildiği copurifying proteinlerin imzası kullanılan akışkana bağlı olarak değişmektedir. Mikron ölçekli manyetik boncukları spesifik olmayan protein adsorpsiyon nispeten düşük bir seviyesini gösteren, en temiz profili gösterdi. Paneller numarası ve IE hücre parçalama yöntemi, aynı zamanda geri Proteomun etkileyebilir göstermektedir. Resim örnekte, bir endojen protein sitesini (37 kompleks), afinite captu tabi tutuldu vecyromilled veya sonike hücreden yeniden 19 ayıklar. Hücre ekstresi cryomilled hücre tozundan üretilen zaman daha az yüksek kütle kirleticiler gözlendi. endojen protein kompleksleri incelemek için afinite yakalama kullanarak bir meydan okuma yanlış pozitif (FP) ilgi proteinin iyi niyetli fizyolojik inter aktörlerin ayırt etmek zor olabilir olmasıdır. FP ve / veya ilgi duyulan kendisinin proteine ​​spesifik olmayan tüpler ve kaplar adsorpsiyon, afinite ortamı antikor veya afinite ligandı dahil olmak üzere birçok kaynaktan ortaya çıkabilir. Sonuç olarak, kayda değer çaba yakalama işlemi optimize tahsis edilmelidir. FP tespiti farklı araçlar çok sayıda deneysel 38-40 ve hesaplamalı farklı artıları ve eksileri ile 41-43, her yaklaşımları da dahil olmak üzere, geliştirilmiş edildiği için merkezi bir sorun olmaya devam etmektedir. Kendi deneylerde daha önce F bir model belirtildiğiP proteini kontrol hücre özleri ile α-FLAG manyetik ortamın kuluçkadan sonra elde edilen, bu 3xFLAG-etiketli proteinlerinin varlığında elde edilen model farklı olduğu bağlanma. Bundan başka, bu FP 3xFLAG peptid 7 ile inkübasyon yoluyla ortamdan serbest olabilir. Bu gözlem, fırsatçı aynı kökenli epitopunun yokluğunda α-FLAG paratop fps bağlanması ile tutarlıdır. birçok çalışma afinite yakalamak için sahte bir kontrol olarak etiketsiz &#39;ebeveyn hücre hattı&#39; kullanmak beri bu FP kökenli doğasını anlamak önemlidir; bu kontroller nedenle etiketli protein ile etkileşimleri özgünlüğünü belirlemek için uygun olmayabilir. arka plan belirlemek için antikor paratoplar işgal bizim afinite ortamı katkıda ya da değil, biz 3xFLAG ve α-BAYRAK manyetik ortam ve varlığında HEK 293T hücre özleri (hiçbir takılı protein ifade) veya yokluğunun kullanarak sahte afinite yakalama deneyler yaptılar bağlanmapeptid başak-in. Sonuçlar, Şekil 1, panel II&#39;de gösterilmiştir. Kısaca, α-FLAG manyetik ortam hücre özütlerinde inkübe edildi, 30 dakika boyunca, pH 7.4, 20 mM HEPES-Na Triton X-100 V ila 500 mM NaCl ve% 1 v / ihtiva eden (≳10 mg / ml toplam protein). Ortam daha sonra rekabetçi bir denatüre edici elüsyon elde etmek α-FLAG paratop yerel olarak veya SDS-PAGE numune tampon maddesi ile bağlı olan herhangi bir protein yer değiştirmesi için 1 mg / ml 3xFLAG peptidi ile enkübe edilmiştir. Hücre ekstreleri ml 1 ug / ve 3xFLAG peptid 10 ug / ml ile tutturuldu ek olarak, aynı deney gerçekleştirildi. Yıkanarak ayrılan bütün fraksiyonlar, SDS-PAGE ve gümüş lekeleme tabi tutuldu. Bu kendi aynı kökenli epitopa yokluğunda, α-FLAG ortamı 3xFLAG peptidi ile elüte edilebilir plan proteinleri taranabilir düzeyde bir yakalama yok olduğu görülmektedir - Şekil 1-II ile verilen örnekte, baskın türler 37 ile gözlenmiştir 50 kDa. ile elüt desenSDS-PAGE örnek tamponu ilave belirgin türleri ile, karşılaştırılabilir. Bununla birlikte, 1 ug / ml 3xFLAG peptid varlığında AP için eğilim aracı bağlanma tespit seviyesinin altında elimine edildi ve ya doğal ya da denatüre elüsyon fraksiyonlarında gözlenmedi. Bu sonuç, 3xFLAG / α-Flag M2 olduğu gibi, boş antikor paratoplar kendi aynı kökenli epitopunun yokluğunda seçici olmayan olabilir ve hatta yüksek afinitede epitop bağlanan antikorların afinite yakalama sırasında elde edilen proteomu önemli ölçüde katkıda düşündürmektedir eşleştirme. Ayrıca, çoğunlukla, spesifik olmayan azaltmak için seçilen yüksek tuz kullanılarak, çok katı koşullar, antijen / antikor etkileşimi olmadan etkili olabileceğini suggestd. Takip biz SDS-PAGE yanı sıra nicel MS (Şek. S1) tarafından benzer bir deney de dahil olmak üzere analizi yapıldı. sayısal 347 Proteinlerin, her proteinin bir (yanlış disko kaydetmek görülmektedirÇok oranı =% 1; Bir 3xFLAG peptid kontrol örneği çivili ile karşılaştırıldığında Tablo S1) 3xFLAG etiketli yem protein ile ilişkili bulunmuştur. Bu sonuçlar, deneylerde proteinlerin çoğunluğu etiketli protein ile birlikte saflaştırmak için muhtemel olan veya boş α-FLAG paratoplar yan ürünlerinin hedef dışı olduğunu gösterir. Deneyimlerimize göre, yüksek sinyal-gürültü afinite yakalama sonucu, keskin, bol ve yaklaşık stoikiometrik bantlar gibi diğer sönük bant arka plan boyaması bir yetersizlik ayrık bir modeli ile SDS-PAGE ve protein boyama örneklenmiştir; Bu prensibin bir çok örneği, referans 11&#39;de görülebilir. Cryomilling zaman (önerilir) PTFE yalıtkan kullanmak için güdü, öğütme sırasında kavanozun ısınma oranını azaltmak öğütme işlemi sırasında tekrarlanan LN 2 soğutma yükünü hafifletmek ve buz derecesini azaltmak içinkavanoza oluşumu. Bu tutarlı bir freze performansı kolaylaştırır ve hücre tozu işleme kolaylaştırır. Örnek yalıtkanlar referans 27 (diskleri) bulunan ve Şekil 2, aşağıdaki (kol ve-diski) tasvir edilebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig1.jpg" /> Şekil 1: Temsilci Sonuçlar seçin. (I) &#39;in bu panel referans 19 modifiye edilmiştir. Coomassie Blue SDS-poliakrilamid jel boyandı. (SOL) Mikron ölçekli manyetik boncuk hedef dışı agaroz tabanlı medya daha bağlayıcı düşük gösteriyor. (A), manyetik boncukları; (B) geleneksel agaroz; (C) demir emdirilmiş (manyetik) agaroz; Her anti-FLAG M2 antikorlara bağlı olan ve FLAG etiketli bakteriyel alkalin fosfatazı yakalamak için kullanılan (BAP; etiketli) cryomilled HEK-293 hücrelerinden üretilen özler içerisine arttı. Agaroz bazlı saflaştırmaspesifik olmayan adsorpsiyon (etiketlenmemiş grupları) daha yüksek seviyeleri göstermişlerdir. endojen protein kompleksi saflaştırmak için kullanıldığında cryomilled HeLa hücrelerinden üretilen (sağ) özler sonikasyon ile üretilen daha antikor bağlanmış manyetik boncuk üzerine düşük hedef dışı adsorpsiyonu sergiler. LAP-etiketli 44 RBM7 SONRAKİ kompleksi 19,37 (D) saflaştırmak için poliklonal anti-GFP antikorlara bağlanmış manyetik boncuklar kullanılarak çekilen afinite cryomilled bir toz elde edilen ekstre olmuştur; (E) ekstreler sağlam hücrelerinin sonikasyonu ile üretilir. dikey siyah çubuk yüksek kitle non-spesifik interaktörler sonication tarafından hazırlanan numunede zenginleştirilmiş bir biçimde gözlenir jel bölgesini vurgular. siyah oklar beklenen spesifik inter aktörlerin belirtilen (etiketli). şerit D ve E ~ 50 kDa gözlenen bantlar lama IgG ağır zincirlerine bağlanabilir. (II) gümüş SDS-poliakrilamid jel boyandı. (Std.) Bir sahte afinite yakalama HEK-293 üzerinde yapılanT hücresi standart bir şekilde ayıklar. yakalanmasından sonra, bağlanmış malzeme elüsyon (N) 1 mg / ml 3xFLAG peptit veya SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde elüsyon denatüre (D), denatüre edici olmayan elüsyon yoluyla elde edilmiştir; Std olarak (PB 1). ancak 3xFLAG peptid afinite ortamı üzerinde α-FLAG paratoplar engellemek için 1 ug / ml ekstraksiyon çözeltisi dahil edilmiştir; PB 1 Ama 10 ug / ml 3xFLAG peptid varlığında (PB 10). IgG ilgili bantları ve 3xFLAG peptid etiketli. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig2.jpg" /> Şekil 2: Kol-ve-pak PTFE yalıtkan. 250 ml&#39;lik bir PTFE kavanoz gösterilir (1). 50 ml&#39;lik paslanmaz çelik öğütme kavanoz (2) PTFE kavanoz (3) içinde uyuyor ve sağlarfırsat döngüleri arasındaki değirmen içinde yüklü freze kavanozu bırakmak. Bir üst PTFE yalıtkan cin (2) kelepçe montaj ve kavanoz kapağının arasında kullanılır. Yüklü kavanoz ve yalıtkan düzeneğini (3) soğutmak için, LN 2 kavanoz çevreleyen izolatör gövdesine doğrudan ilave edilir. freze sonraki döngü sonra başlatılabilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reaktif </td><td> önerilen Konsantrasyon </td><td> notlar </td></tr><tr><td> Sodyum klorit </td><td> 0.1-0.5 M </td><td> Yüksek konsantrasyonda (&gt; 300 mM) total protein çıkarılmasını artırmak ve düşük arka plan tutmak eğilimindedir, ancak bazı başka türlü istikrarlı Inter uzaklıkta şerit olabiliraktörler. 150 mM altındaki konsantrasyonlar spesifik olmayan arka plan azaltılması tipik olarak etkili değildir. </td></tr><tr><td> amonyum asetat </td><td> 0,2-2 M </td><td> İki tampon oluşan bir tuz, bir nötr pH değeri çözelti 57 elde edilir. Daha yüksek konsantrasyonları bazı protein kompleksleri stabilize eder. Asidik çözümler amonyak kaybı nedeniyle eski, yanlış depolanan kristalin stoklarından neden olabilir. Ek pH tamponu ya da tuzlar, amonyum asetat içeren ekstraksiyon gereklidir. Elde edilen sonuçlar modüle NaCl ile kombine edilebilir. </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> % 0.1 h / h </td><td> Bir non-iyonik bir deterjan 58; tipik olarak, NaCl ile birleştirildi. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0.5-1% h / h </td><td> Bir non-iyonik bir deterjan 58; tipik olarak NaCl veya NH4 CH3 CO 2H ile kombine </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 5 mM </td><td> Bir zvitteryonik deterjanın 58 &lt;/ Sup&gt;; tipik olarak, NaCl ile birleştirildi. </td></tr><tr><td> Sarkosyl </td><td> 1 mM </td><td> Arka plan azaltır ve potansiyel olarak ikili bağlantı açığa kararlı kompleks bileşenler kapalı şerit olabilir anyonik deterjan 58; tipik olarak, NaCl ile birleştirildi. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Tris-CI </td><td> 20 mM </td><td rowspan="2"> pKa, 4 ° C, 25 ° C &#39;de 8.1 8.8. </td></tr><tr><td> (PH 8.0) içinde </td></tr><tr><td rowspan="2"> HEPES-Na </td><td> 20 mM </td><td rowspan="2"> pKa, 4 ° C, 25 ° C &#39;de 7.5 7.8&#39;e a. Veya NaOH KOH tuzuna bağlı olarak, pH dengeleme için (örneğin NaCl, KCI, veya CH3 CO2 K) özümleme kullanılır. </td></tr><tr><td> (PH 7.4) </td></tr></tbody></table> Tablo 1: protein kompleksleri saflaştırılması için önerilen bir kaç reaktifler yararlı. Bu tablo, lTavsiye edilen çalışma konsantrasyonlarda insan hücre çizgilerinden saflaştırılması protein kompleksleri için yararlı olan bazı reaktifler, ists. Tipik bir özütleyici formülasyon bir pH tamponu, bir tuz ve bir deterjan 1,11,24,45-48 içerir. En iyi uygulama istenen sonucu verir reaktiflerin az karmaşık kombinasyonunu tespit etmektir. <img alt="Şekil S1" src="/files/ftp_upload/54518/54518figS1.jpg" /> Şekil S1: Mix yanlış pozitiflerin saflaştırılması (harita görüntüleme) SILAC analizinden sonra. I. Şematik: Bu deneyde sırasıyla Ağır ve hafif etiketli HEK-293T hücreleri 7 saflaştırılmıştır (pLD401 eksprese) ORF2p protein kompleksleri 3xFLAG etiketli. Işık etiketli hücre ekstraktı rekabetçi inhibe ederek 3xFLAG etiketli ORF2p afinite yakalama önlemek için 3xFLAG peptid ile çivili edildi; Bu olmayan öz dirençli oluşabilir protein bağlanmasını bloke beklenmemektedirManyetik orta ya da antikorun olmayan paratopic yapılar ile otomatik. Manyetik boncuklardan yıkanmasından sonra, ağır ve hafif örnekleri karışık sonrası saflaştırma ve kantitatif MS ile analiz edildi numune ya da bağlantılı proteinler parçasını belirlemek için, (39-SILAC MAP); Tablo S1 bulunan başka metodolojik ayrıntı. II. Gümüş hafif ve ağır etiketli malzeme benzer sonuçlar (H L karşılaştırın) elde olduğunu gösteren jelini ve 3xFLAG başak in (II) varlığında gerçekleştirilir saflaştırma rekabetçi inhibe oldu. Aşağıda, Tablo S1 de tarif edildiği gibi, karışık H ve önceden jel bazlı proteomik analizi LI kısımları kapsayan Coomassie Mavi G-250 ile renklendirilmişlerdir jel yatağından. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir sürümünü indirmek için buraya tıklayınız.</a> Tablo S1:MAP-SILAC. Bu levha Şekil S1 açıklanan MAP-SILAC deney yürütülmesi üzerine elde edilen veriler içeriyor. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells at JoVE.com

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

protein-complex-affinity-capture-from-cryomilled-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.8K Görüntüleme.  The Rockefeller University.  Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder. 

Video: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Biyokimya

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

Affinity Kromatografi Reçiyatlarının Hızlı Gelişimi İçin Aktif Çapraz Bağlantılı Agarose - Örnek Olay Olarak Antikor Yakalama

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty acids via a labile thioester bond. S-acylation, which is emerging as a widespread regulatory mechanism, can modulate almost all aspects of the biological activity of proteins, from complex formation to protein trafficking and protein stability. The recent progress in understanding of the biological function of protein S-acylation was achieved largely due to the development of novel biochemical tools allowing robust and sensitive detection of protein S-acylation in a variety of biological samples. Here, we describe acyl resin-assisted capture (Acyl-RAC), a recently developed method based on selective capture of endogenously S-acylated proteins by thiol-reactive Sepharose beads. Compared to existing approaches, Acyl-RAC requires fewer steps and can yield more reliable results when coupled with mass spectrometry for identification of novel S-acylation targets. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between fatty acid species attached to cysteines via the same thioester bond.

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) is a highly sensitive, reliable and easy to perform method to detect reversible lipid modification of cysteine residues (S-acylation) in a variety of biological samples.

Acyl-Reşin Destekli Yakalama ile Protein S-Acylation Tespiti

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...