Name: protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells
Uploaded: 2016-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells at JoVE.com

Biz mükemmel teknik destek için yaptığı paha biçilmez MS enstrümantasyon tavsiye, destek ve erişim yanı sıra Bayan Kelly R. Molloy Profesör Brian T. chait teşekkür ederim. Biz kopya düzenleme ile destek için Sayın Kelly Çıplak teşekkür ederim. Bu çalışma NIH hibe P41GM109824, P41GM103314 ve P50GM107632 tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. Hücre Hasat ve Donma <ol><li> Çevrede 25,26 hücre hattı için uygun kültür koşulları kullanılarak, hücre materyalinin 1-8 g büyütün. Bu protokol referanslar 19,27,28 değiştirilmiş hücrelerin en fazla 8 gram (~ 10 9 hücreleri) için optimize edilmiştir. Tipik haliyle, ~ HEK-293 veya HeLa hücrelerinde 5 g yetiştirilen sekiz 500 cm2 kültürü plakalarına ~% 90 konflüansa elde edilebilir. DİKKAT: Bu protokoller ciddi kriyojenik yanıklara neden olabilecek sıvı azot (LN 2), kullanın. Don koruyucu giysi ve egzersiz uygun taşıma önlemleri. </li><li> Büyük bir behere büyüme ortamı (atık) dökünüz. </li><li> büyük dikdörtgen bir buz tavada buz üzerinde kültür çanak yerleştirin. </li><li> kültür tabağına buzla soğutulmuş 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ile 20 ml ilave edilir ve büyük bir hücre kazıyıcı kullanarak çanak hücreleri serbest; 50 ml&#39;lik bir tüpe hücreleri transferi, önceden buz üzerinde soğutulmuştur; Buz tüpü tutun. NOT: Tüm hücre için taşıma adımları transferi manipülasyonlar sırasında hücrelerin aşırı kesme önlemek için bir elektro-pipet seti için &quot;düşük&quot; ve 25 ml&#39;lik pipet kullanın. 50 ml toplama tüpleri düzenleyin ve önceki işlemleri başlatmadan bir buz kovasının içinde PBS 1x. </li><li> Aynı çanak buz soğukluğunda 1x PBS ilave 10 ml. Kalan hücreleri toplamak ve 50 ml tüp aktarabilirsiniz. </li><li> Her yemek için tekrarlayın; farklı yemekler hücre süspansiyonları örnek sayısı ve plastik atıkları azaltmak için kombine edilebilir. Not: hücrelerin kendileri süspansiyon hacminin büyük bir bölümünü teşkil etmez, çünkü hücre süspansiyonu değerinde üç tabak, iki 50 ml&#39;lik tüp içine birleştirilebilir. 50 ml&#39;lik tüpler aslında nominal hacmi daha fazla tutun, çünkü sekiz tabak genellikle beş tür tüpler yayılmış olabilir. </li><li> 1,000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. </li><li> Süpernatantı dikkatlice dökünüz. 10 ml buz gibi soğuk 1 x PBS içinde, her pelletini. resu birleştirinspended peletler, 5 ila 50 ml başına tüpüne kadar, örnek sayısını azaltmak için. </li><li> 1,000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de santrifüje 5 dak. </li><li> Süpernatantı dikkatlice dökünüz. 10 ml buz gibi soğuk 1 x PBS içinde pelletini </li><li> 20 ml şırınga pistonu çıkarın ve bir kenara koyun. şırınga meme Cap ve buna hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 1,000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de, 50 ml bir tüp ve santrifüj 5 dakika içinde şırınga yerleştirin. </li><li> Hücrelerin sadece üst tabakası kadar bir vakum tuzak sistemine bağlı bir ince uçlu pipet ile süpernatant aspire kadar emilmesini başlar. Bu ıslak hücre peleti ile sonuçlanır. </li><li> , Şırınga kapağını açmak piston yerleştirin ve bir strafor kutu içinde bir LN 2 banyosunda tutulan LN 2 ile dolu büyük bir plastik beher, doğrudan hücreleri damla. Zorla şırınga kalan hücrelerin dalma. </li><li> dökerek 50 ml tüpler için donmuş hücreleri aktarın. Gevşek fazla LN 2 buharlaşmasına izin tüpler kap; t tutun-80 ° C &#39;de hem gece boyunca karıştırıldı. Ertesi gün tam kapaklarını sıkıştırın. Dondurulmuş hücre cryomilling kadar -80 ° C &#39;de bu şekilde depolanabilir. NOT: sıkıca aksi takdirde aşırı basınç tüpü patlamasına neden olabilir, LN 2 gözle görülür buharlaştı öncesi tüm tüpleri kapatmayın. LN 2 fazla su ağırlık ekleyerek, hücreler malzeme üzerinde don birikimi neden olabilir harcanmış ve etkin öğütme üzerine protein konsantrasyonu azaltan sonra tüpleri kapanan değil. </li></ol> Dondurulmuş Hücre 2. kriyojenik bozulması NOT: freze ve manipülasyonlar için tüm araçlar LN 2 ile ön soğutulması gerekmektedir. Küçük bir dekanter kavanoz içinde LN 2 eklemek için kapalı freze kavanozun üstünden LN 2 dökme için gerekli olacaktır. Ev yapımı bir araç referansı 19 gösterilmiştir. Kriyojenik eldivenler LN 2 freze cihazı soğutmalı işlemek için gerekli olacaktır. değirmencilikBurada kullanılan kavanoz kapakları genellikle yüklü bir lastik conta ile birlikte (Malzeme Tabloya bakınız); Bu güvenilir aşağıdaki protokol yürütmek için piyasada mevcut olan teflon kapaklı conta ile değiştirilmesi gerekir. Gaz N2 basınç öğütme sırasında kavanoz içinde yüksek seviyelere kadar inşa edebilirsiniz, çünkü Dahası, biz bir güvenlik önlemi bırakma 28 olarak piyasada mevcut 5 bar / 500 kPa basınç valfi yüklemenizi öneririz. <ol><li> -80 ° C depolama hücre boncuk çıkarın ve bir LN 2 banyosunda 50 ml&#39;lik bir tüp tutucu tutun. </li><li> LN 2 içeren bir temiz dikdörtgen buz kovası, 50 ml kavanoz, iki adet 20 mm&#39;lik topları ve kapağı ön serin. birini kullanarak, eğer politetrafloroetilen (PTFE) yalıtkan önceden soğutmak; Ya diskleri bir dizi (27 referans bakınız) ya da bir kol ve-cin (bakınız Şekil 2). Ön soğutma işlemi tamamlandığında LN 2 yatıştırır şiddetli kaynama. </li><li> Set uygun dengedeğirmen. NOT: Bu kavanoz, kavanoz kapağı kütlesine eşit olacaktır, freze topları kullanılan ve hücrelerin miktarı kavanoza eklenecek. herhangi bir PTFE izolatörler kullanılması halinde, kitlesel de dahil edilmelidir. Biz kavanoz, kapağın kitleleri kayıt ve önceden (kullanılan herhangi izolatör dahil ve bunların kombine kütlesi) ve değirmen yakın saklanan bir bilgi kağıda bunları kayıt topları öneririz. </li><li> forseps kullanarak, önceden soğutulmuş freze kavanoz içinde iki önceden soğutulmuş 20 mm freze topları ve donmuş hücreleri yerleştirin. Not: nedeniyle öğütme sırasında kavanoz ve top yüzeylerde malzemenin küçük kayıpları artar öğütülmüş hücrelerin kütlesi olarak geri malzeme artar yüzdesi. tarif edilen yöntemle, malzeme kayıpları ~ 0.3 g ıslak hücre ağırlığı (WCW) sırasına olmak, çok mütevazı. Üreticinin kurallar numunenin maksimum hacim kavanoz hacmi ~ 1/3 olmalıdır yüklenen gösterir. 29 topları toplam hacmi ~ 1/3 ve r olmalıdıremaining ~ 1/3 boş alan topları serbest dolaşımı içindir. </li><li> ~ ½ tam kavanoz up LN 2 Ekle, kavanozun kapağı yerleştirin ve değirmene aksamını aktarın. NOT: birini kullanarak Öncelikle seçilen izolatörü yükleyin. </li><li> ters-rotasyon yönünü her dakika, hiçbir aralık sonu, 400 rpm, 3 dakika: yerinde montajını Kelepçe ve aşağıdaki programı kullanarak öğütme üç kür gerçekleştirin. Her çevrimde arasında LN 2 ile freze kavanoz soğutun. NOT: topları gezegensel hareket kavanoz içinde çarpışır olarak ayrı bir clunking gürültü oluşturulur freze sırasında. Bu sesler duydum değilseniz, freze meydana gelmiyor. Kavanoz içeriğini, bu döngüyü saymak geri LN 2 kavanoz düzeneğini taşımak ve incelemek değil, freze döngüsünü sona erdir. kurdu hayır buz sağlamak ve varsa, önceden soğutulmuş spatula ile uzak kavanoz duvarlarından onu çip. Adım 2.5 den tekrar başlayın. Hiçbir izolatör veya yalıtkan diskleri kullanıyorsanız, geri kavanoz düzeneğini taşımak LN <sdöngüleri arasındaki ub&gt; 2 serin yeniden ve tam her zaman ½ ~ için LN 2 ekleyin. LN 2 öğütme sırasında kavanoz sıcaklığı arttıkça kavanoz içinde buharlaşır ekledi. Bu kavanoz içindeki basınç birikmesi ile sonuçlanır. değirmen kavanozu boşaltırken, bu nedenle, çok yavaş kelepçe bırakın. kelepçe hızla bırakılırsa, hücre toz hızlı basıncın ile kaçabilir. kelepçenin yavaş salgılanan yumuşak, kontrollü bir şekilde kavanozdan kaçmasına basıncın ve hücre malzemesinin kaybını önler. Bu normaldir - gazlı N2 nazik kaçış genellikle kelepçe yavaşça serbest olarak tıslama duyulabilir. Bir kol-ve-cin yalıtkan kullanıyorsanız, kavanoz montaj değirmende sol ve LN 2 yerinde izolatör / kavanoz montaj eklenebilir. </li><li> Geri LN 2 kavanoz taşıyın ve soğutmak için bir an dinlendirin. Bir manşon ve-diski yalıtkan kullanılıyorsa, kavanoz kol W çıkarılabilirher iki tarafta kaldıraç sağlayan iki spatula yardımıyla, i. Kavanoz LN 2 dinlenme sonra, dikkatlice forseps kullanarak topları kaldırmak, kapağı kaldırmak ve önceden soğutulmuş bir spatula kullanarak önceden soğutulmuş 50 ml tüp toz transferi. Açık kavanoz / toz biraz LN 2 ekleme kaldırmadan önce, topları üzerine fırıncı olan toz çıkarmak için yardımcı olabilir. NOT: Kavanoz açıldıktan sonra, topları çıkarmadan önce ona LN 2 küçük bir miktar ekleyin. Bu yüzeylerde fırıncı toz kurtarmak için yardımcı olacaktır. Hücre tozu -80 ° C veya altında, kullanılıncaya kadar tutulmalıdır. Deneyimlerimize göre, hücre toz performansı etkilemeden, esas olarak sonsuza kadar bu şekilde saklanabilir. </li></ol> Hücre özleri Protein Kompleksleri 3. Affinity Yakalama NOT: Aşağıdaki protokol faiz, eş protein ile etkileşime afinite bir afinite ligandı oluşan medya, yem ya da antikor uygularparamanyetik boncuk ölçekli mikron için upled. Bu ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak, in-house 19,30 hazırlanabilir ya da hazır reaktifler olarak satın alınabilir. <ol><li> Hücre ekstresi hazırlanması NOT: Hücre tozu tutarken, mutfak eşyaları ve tüpler LN 2 ile önceden soğutulmuş kullanmayı unutmayın. Hücre tozu içeren tüpler her zaman değil -80 ° C&#39;de LN 2 tutulmalıdır. 50 ml tüp (ler) LN 2 plastik bir kap içinde, tüp raf hücre tozu içeren yerleştirin. <ol><li> 1.5 ya da 2 mi mikrofüj tüpe, hücre tozu 100 mg tartılır. NOT: hücrelerin bu miktar genellikle nanogram yüzlerce onlarca hedef proteini verecektir iyi bir başlangıç ​​noktasıdır başına kopya binlerce, bir orta ifade protein (~ 50 kDa kitle için afinite yakalama sonra mevcut aralığı olduğunu gözlemledim hedefin çıkarma ve yakalama verimliliği küstah hücresi), ≳70% bulunmaktadır. Bu tür verimler doğrudan visualiz sağlamakSDS-PAGE ve protein boyama ile saflaştırılmış fraksiyonunun yapımı. </li><li> Boş mikrofuge&#39;de tüp ile dara analitik terazi. Bir LN 2 kaşık veya spatula soğutmalı kullanarak bir tüp içine hücre tozu dağıtın. analitik terazi üzerinde tüp içinde dağıtılan toz kütlesini kontrol edin. NOT: Hücre tozların dışarı ağırlığında, küçük hacimsel ölçüm kaşık kullanılabilir kolaylaştırmak için. Bunlar (19 referans bakınız) tekrarlanabilir sonuçlar verdiği bulunmuştur. Biz vidalı kapak ya da &#39;güvenli kilit&#39; mikrosantrifüj tüpleri kullanılarak en iyi sonuçları bulduk. Potansiyel olarak örnek kaybı ile sonuçlanan - Standart mikrosantrifüj tüpleri hemen önce ekstre çözeltisine ilave edilmesinden sonra ısıtma sırasında açık pop neden olabilir tüpleri girebilir LN 2 buharlaştırma Basınç. </li><li> tüp açın (veya vidalı kapağı gevşetin) hücre tozu ile ve 1 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Bu tüp içindeki basıncı serbest bırakmak ve ekstraksiyon hemen donmaması olacakÇözelti, tozun ilave edildi. Hiçbir çözülme bu 1 dakika inkübasyon sırasında görülmektedir. </li><li> 3.1.5 adımına geçilmesi sırasında kısa bir süre için, daha sonra buz üzerinde tutmak proteaz inhibitörleri ve vorteks ile takviye özümleme 400 ul ekle. Numuneler elüsyon kadar daha sonraki tüm manipülasyonlara arasında buz üzerinde tutulmalıdır. Not: özütleyici iyi bileşim olup protein kompleksi (ES) bağlıdır arıtılacak. Bazı genel bilgi, Tablo 1 ve destek referanslarda verilmektedir. </li><li> örnek, herhangi bir agrega dağıtmak için kısa bir düşük enerji darbe vermek için bir mikrotip ultrasonikatör kullanın. 4 bakliyat (2 saniye her 2 A; toplam enerjinin yaklaşık 15-20 J) ile (Ultra) sonikasyon. NOT: Vorteks özümleme içine hücre tozu dağıtır, ama çözüm karakterine bağlı olarak, bazı büyüklükler görülebilir. Biz bu agrega dağıtma sonraki afinite çekimi sırasında en iyi verimi sağladığını bulmuşlardır. Kısa bir mikro uçlu sonikatyon kolayca bu agrega dağılır. Çözüm açık agrega olmadan, yarı saydam, ancak homojen görünmelidir. Su banyosu sonicators verimli önemli ölçüde daha uzun numune alma süreleri olmadan bu tür agrega dağıtmak için çok düşük güç olma eğilimindedir, ancak uygun ayarlarla uygun olabilir. </li><li> Santrifüj ile özü netleştirmek (örneğin, 20,000 xg, 10 dakika, 4 ° C). Not: berraklaştınlmış hücre Özütün bir alikotu, pelet, post-afinite yakalama yüzer içeriğine karşılaştırma için kaydedilebilir ve afinite ortamının elüsyonundan sonra, elde edilen fraksiyonlar, hedef proteinin ekstre etkinliğini ve yakalama belirlenmesi örneğin, Western blot ile (tartışma). </li><li> süpernatant (açıklık ekstresi) çıkarın ve afinite yakalama geçin. Not: pelet, hedef protein D&#39;salım derecesini belirlemek için, 70 ° C &#39;de, SDS-PAGE numune yükleme tamponu içinde yeniden ekstre edilebilirAşama 3.1.6 &#39;de elde edilen ekstrakt ile karşılaştırıldığında, başlangıç ​​denatüre edici olmayan ekstraksiyon uring. </li></ol></li><li> Affinity Yakalama <ol><li> Manyetik afinite orta ön yıkama. Hücre ekstreleri santrifüj edilirken bu yapılabilir. </li><li> mıknatıs tüpü (ler) yerleştirin. boncuklar kaldırılacak depolama çözümü izin, saniyeler içinde tüpün tarafında birikir. </li><li> tanelerine ekstraksiyon çözeltisi 500 ul ekle. orta hızda Kısaca vorteks karışımı (tekrar süspansiyon için yeterli). alt tüm içeriğini toplamak için bir mini-santrifüj tüpleri Darbe dönerler. Aksi takdirde çözümler asgari taşınmasını sağlar. mıknatıs tüpler yerleştirin ve çözüm aspire. NOT: ayırt edici özelliklere sahip Manyetik medya ticari tedarikçiler geniş bir yelpazede temin edebilirsiniz. Sonuçlar boncuk büyüklüğü, bütünlüğü, yüzey kaplama ve antikor birleştirme kimyası da dahil olmak üzere, bu özelliklere bağlı olarak değişebilir. Side-by-siuygulamanızda de çalışmalar bir seçim ayıracı yerleşmeden önce tavsiye edilir. </li><li> tekrar süspansiyon kısaca önceden yıkanmış afinite orta ve vorteks içeren bir 1.5-2.0 ml tüp açıklık hücre ekstresi aktararak afinite yakalama başlatın. </li><li> çevirici tekerlek sürekli hafifçe karıştırılarak, 4 ° C &#39;de 30 dakika boyunca inkübe edin; boncuk inkübasyon boyunca asılı kalmalıdır. </li><li> tüpün dibine tüm içeriğini toplamak için bir mini-santrifüj tüpleri Darbe dönerler. Süpernatant aspire ve aşama 3.2.3 de tarif edildiği gibi, soğuk ekstraksiyon çözeltisinin 1 ml&#39;si ile boncuk üç kez yıkayın. mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. çözüm çıkarın. sonraki çözümü eklemek ve tekrar devam edin. 2. Yıkama sırasında, pipetleme yeni bir mikrofüj tüpe birlikte boncuklar ve yıkama solüsyonu aktarın. Bu T ile inkübasyon için kullanılan tüpün duvarlarına adsorbe rastgele proteinleri tarafından, elüsyon noktada numune kontaminasyonu azaltıro özü hücre. 3. yıkamadan sonra, boncuklar altına tüm içeriğini toplamak için bir mini-santrifüj darbe bükülmüş kısaca olmalıdır. geri mıknatıs tüp yerleştirin ve kalan sıvı kaldırmak. Bu, elüsyon homojen hacimli olacaktır elüt örnekleri sağlanması önce çözeltinin son birkaç ul kaldırılmasını mümkün kılar. Aynı zamanda elüsyon çözümü artık yıkama seyreltilmiş olmayacak gibi sağım, etkili olacak sağlar; bu kalıntılar, aynı zamanda bir tuzu etkilerine katkıda (aşağıya bakınız), SDS-PAGE protein göçünü değiştirebilir. Not: sonrası bağlayıcı Yüzer kısımdan bir şişe 3.1.6 oluşturulan açıklık ekstresine karşılaştırma için kaydedilebilir. western blot ile. Sonuç hücre özütünden hedef proteinin tükenmesi derecesini gösterir. </li><li> ya bir doğal veya denatüre edici bir şekilde elüte; alt uygulama 1 için en iyi strateji düşünün. NOT: Yerli elüsyon Strategie ayrıntılarıs kullanılan afinite etiketi (Tartışma bakınız) bağlıdır. Protein lekeleme 31 SDS-PAGE ile numunenin analizi ile takip edilen SDS-PAGE örnek tamponu ile elüsyon denatüre çoğu kullanıcı için, en pratik ilk yaklaşım olacaktır. NOT: elektroforez sistemi bağlıdır örnek tampon bileşimi kullanılır. Birçok laboratuarları süreksiz elektroforez ve Laemmli tampon sisteminin 32-34 yararlanarak, kendi Tris-glisin jeller attı. Ortak bir örnek tampon tarifi (1x) içerir:% 10 sukroz, 50 mM DTT,% 2 Blue SDS (w / v), 62.5 mM Tris-CI pH 8.8,% 0.0004 (ağırlık / hacim) bromofenol 31 (w / v) . Biz DTT atlar bir 1.1x stok hazırlanıyor öneririz. 500 mM DTT hacmi SDS-PAGE önce örnek eklenmelidir inci 1/10 (aşağıya bakınız). Pek çok ticari olarak temin edilebilir, SDS-PAGE sistemi de mevcuttur; Bu sistem özel numune tamponları içerebilir. </li><li> serbest azaltmak için (indirgeme maddesi SDS-PAGE numune tampon eklemeboncuklardan antikor zincirlerinin) ve çalkalama ile oda sıcaklığında 5-10 dakika süreyle inkübe edin. NOT: Bu süpernatant içine çekilen proteinleri serbest, çoğu afinite bazlı etkileşimleri müdahale edecek. Daha kalıcı etkileşimler serbest bırakılması için yüksek sıcaklık yararlanabilir (tipik olarak 70 ° C yeterlidir). </li><li> Toplamak ve süpernatant kaydedin. Numuneler kısa bir depolama için -20 ° (birkaç gün) dondurulabilir veya -80 uzun depolama ° C Analiz istendiği kadar. </li><li> Standart teknikler 31 kullanılarak protein boyama ile takip edilen SDS-PAGE numune, öznenin. MS numune bileşimi 1 karakterize etmek için kullanılabilir. Bağımsız protein bantları tanımlanması için eksize edilebilir ya da tüm örnek, yalnızca kısa bir süre için (jele 4-6 mm) örnek elektroforeze ve bir araya numunedeki tüm proteinlerin işlenmesi tek bir analizde, özelliği edilebilir &quot;jel yatağından. &#39; NOT: inisiyatif önce DTT ekleting elektroforezi. Planlama MS geçmek için, numuneler elektroforez 35 sonra alkillenebilir; Bununla birlikte, önceden elektroforez 36 alkillemek için sıklıkla daha uygundur. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu üç protokol (1), cryomilling katı hal kırılması için hücreleri hazırlamak (2) bir planeter bilyalı değirmende kırılma elde etmek ve (3) ile kompleks yakalama ilgili bir proteini afinite hücre toz özler üretmek için birlikte çalışır fizyolojik Uygulayıcılar. Birçok farklı hücre parçalama teknikleri kırma etkisi, kesme ve / veya basıncı kullanılarak mekanik / fiziksel yaklaşımlar, yanı sıra kimyasal / enzimatik yaklaşımlar, farklı artıları ve eksileri 49,50 ile her dahil mevcuttur. Her araştırmacı hücre kırılması ve protein ekstraksiyonu için seçilen herhangi bir yaklaşım (aşağıda açıklanmıştır) ampirik optimizasyonu gerektiren önyargıları 51,52 tanıtmak için muhtemel akılda tutarak, onların analizleri için en uygun yöntemler keşfetmek için teşvik edilmektedir. Mekanik yöntemler protein kompleksleri bozabilir yüksek ısı ve / veya kesme kuvvetlerine neden olabilir. Cryomilling t örneklerin LN 2 soğutma istihdam sayesinde ısıtma etkilerini önlersürecin kendisi süresi. Planet bilyalı değirmenler parçacık büyüklüğü azaltma 53,54 bileşenleri olarak, kesme stresi dahil olmak üzere etki ve sürtünme kuvvetleri, dayanmak anlaşılmalıdır. ayarlarda biz protein komplekslerinin dejenerasyonu gözlenen değil bildirdi. Nitekim biz çıkarılan ve &#39;yumuşak&#39; deterjan bazlı lizis 7 kullanan hazırlıkları daha yüksek spesifik aktivite sergileyen görünüşte sağlam ~ 50 MDa nükleer gözenek kompleksleri 11 ve enzimatik olarak aktif retrotranspozonlar erişebilirsiniz. Hücre lizizi kimyasal / enzimatik yöntemler hücre içeriği, bir in vitro ortamı hücre zarları ve yapısal makromoleküllerin bozulması destekler ancak protein kompleksinin bütünlüğünü korumak için uygun olmayabilir (ES salınan ama bunlarla sınırlı muzdarip ) ilgi. Sık sık, ne komplekslerinin bileşenleri ilgi protein ile oluşturulan, ne de koşullar hedef kompleksleri stabilize etmek için gerekliönceden bilinen. Katı hal öğütme en büyük yararı, kırılması ve çıkarma kaynağı malzeme yönlendirilir, bağlanmamış olan, ilave sıvının serbest hazırlanabilir (veya aşağıdaki -80 ° C&#39;de) içinde saklanarak, topladığı ve uygun isteğe bağlı deney için alınacak olduğu; örneğin, afinite yakalama in vitro koşullarda optimize araştırmak için. Protein etkileşimleri dolayısıyla özütleyici hacmini fizyolojik etkileşimlerini muhafaza etmek için avantajlı olabilir en aza indirerek, yüksek konsantrasyonda 55,56 en stabildir. Öte yandan, pratik hususlar vardır - protein kompleksleri afinite ortamı ile hedef kompleksleri karıştırmak için, hücre dışına ve çözünmez agregaların ücretsiz ağdalı olmayan sulu fazda, içine bölümlenmiş gerekiyor. Ayrıca, in vitro ortamda (pH, tuz konsantrasyonu, vb) üzerinde bir miktar standardizasyon ve kontrol sistemli ve yeniden üretilebilirlik için gereklidir. Biz pr özler bulmakseyreltme aralığında oduced 1: 4-1: 9 (w: v) kaliteli sonuçlar veren pratik ve teorik endişeler, tatmin. Buna ek olarak, orta ihtiyaçlarını afinite hücre ekstresi uygun oranı belirlenir. Bu yakınlık ortamın değişen miktarlarda özler titrasyon ile deneysel olarak yapılır ve aşağıda daha ayrıntılı olarak ele alınan, deney sinyal-gürültü oranı saptanabilir etkiler olabilir. Hedef proteinin mükemmel tükenmesi tipik haliyle, hedef proteinin eriyebilen fraksiyonunun ≥70%, ancak&gt;% 90 tercih edilir ve ekstraksiyon şartlarına dikkatli parametre ile elde olabilir. Gibi pek çok pratik hususlar referans 1 kaplıdır. Ev yapımı alternatifler canlı olmasına rağmen paramanyetik boncuklar, özel bir mikrosantrifüj tüp tutucu neodimyum mıknatıslar kullanılarak manipüle. tutucu içine yerleştirilen tanecikler manyetik alanın etkisi altında lastiğin yan toplanır. Çözümler sonra di olmadan kaldırılmış olabilirboncuk sturbing. Burada kullanılan planet bilyalı değirmen ile geliştirilen sunulan cryomilling protokolünün bir sınırlama, (Malzeme tabloya bakınız) malzemenin minimum miktarda etkili bir tesis için gerekli olan bu cihaz (&gt; 1 g) kullanılarak hücre tozu geri olmasıdır. Bu gibi miktarlar, kolayca çok sayıda mikrop, hücre çizgileri ve model organizmalar ile elde edilir, ve aynı zamanda sık sık laboratuar hayvanları eksize dokuları ile elde edilebilir. Bununla birlikte, bazı hücre çizgileri az olabilir bolluğu ve hayvan dokularında büyümesi çok zor olabilir. malzemenin daha küçük miktarları nispeten elde edilen bir toz incelik kurban olmasına rağmen, potansiyel olarak daha küçük kaplar kullanılarak diğer aygıtları kullanarak öğütülebilir. Buna ek olarak, mekanik öğütme cihazların maliyeti, bazı laboratuarlarda için çok pahalı olabilir olabilir. Bir haşere kullanarak el ile en ekonomik bir de dahil olmak üzere, alternatif kurulumları 14-19 bir dizi kullanılarak elde edilebilir Cryomillingle ve harç, kırılma verimliliği önemli ölçüde düşer rağmen. Afinite yakalama protokoller genellikle bu nedenle maksimum protein çözeltisi içine ekstrakt edildikten ve hedef protein kompleksleri yakalanması için maksimum potansiyel kolaylaştırmak için hücre lisis oluşumunun bir yüksek verim için amaçlanmıştır. Diğer yandan, bu tüp ekleme maya için gösterilmiştir maksimum liziz nitro biyokimyasal etki 57,58 maksimal ile eşit olmayabilir ayıklar. Biz şu ana kadar test edilen sistemlerde bu tür sorunları görülmez ve cryomilling bu nedenle kasıtlı eden hücre kopması sınırlamamaktadır. In vitro enzimatik tahliller için optimize Yine de, bu olasılığı akılda tutulmalıdır. cryomilling hücrelerinin kırılması için çok etkili bir yöntem olmasına rağmen, homojen olmayan agrega zaman görsel muayene ile gözlemlenen, çünkü, sonication sınırlı bir miktarda, genellikle memeli dokularında üretim homojen bütün hücre hülasaları yarar: tipik haliyleekstraksiyon koşulları tuzu (100-300 mM) ve iyonik olmayan bir deterjan (% 0.1-1 h / h) konsantrasyonları düşük-orta kullanılmıştır. bu agregaların varlığı sonraki afinite yakalama verimini ve / veya kalitesini düşürebilir görülmektedir, çünkü biz rutin (onlar çıplak gözle görülmez bile) onları dağıtmak için sonikasyon uygulamak. Agrega önce öğütülmüş maya hücreleri 58 özütlerinde bildirilenlere benzer aglomere membran fragmanları ile tutarlıdır. Sonikasyon için de aynı şekilde bu protokolü uygulanan sonikasyon derecesi parçası DNA kayda değer değildir, DNA kesme ve çözelti içine kromatin parçaları serbest bazı protokoller kullanılır. ilgi konusu proteinine karşı mükemmel bir afinite ligandı veya antikorun sınırlı sayıda (ya da yüksek maliyet) başka engel olabilir. piyasada mevcut afinite reaktifler geniş bir dizi model organizma genomik etiketleme ya da tr mükellef olduğunda kaldıraçlı olabilirafinite etiketli füzyonları olarak ilgi konusu olan proteinlerin ekspresyonunu ektopik ifade vektörleri ile ansfection. Ancak, özel antikorların üretimi artan mümkün hale gelmiştir ve her ikisi de poliklonal ve monoklonal antikorlar, afinite yakalama uygulamalarda mükemmel gerçekleştirebilir. Bunlar pek çok unsuru da referans 1 daha detaylı olarak ele alınmıştır. Afinite ortamın hücre parçalama yöntemi ve bir seçim sonuçları nasıl etkilediğini örnekleri, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Farklı ekstraksiyon ile sağlanan etkilerin örnekleri, referans 1,11,24 görülebilir. Bu ve diğer deney parametrelerinin zor hekimlerini ayırt hale afinite yakalama kalitesini etkileyebilir, çünkü &quot;kordon proteomlarda&quot; ve hesaplama yaklaşımlar depoları spesifik olmayan kirletici FP 40-43 belirlemeye yardımcı geliştirilmiştir ortadan kaldırmak için. Bununla birlikte, bu tür yaklaşımlar sadece substitSınırlı ölçüde 59 optimal numune hazırlama ute. en iyi uygulamaları gözlemlemek ve ampirik afinite yakalama deneyi, aşağı analizler için daha aşağıda tartışılan en kaliteli örneklerini sağlayacaktır optimize. örnek saflığı artırabilir kolay uygulanabilir pratik yerli ayırmaktır. Ana yıkama en çok fazla deney için sağlam afinite izole edilmiş bir protein kompleksi elde etmek için kullanılır; sık sık örnek saflığı artırır gibi, aynı zamanda bu nedenle tek başına kullanılabilir. Şekil 1, panel II gösterildiği gibi, ancak, Örnek saflığını geliştirmek için ana elüsyon kabiliyeti, hücre özü hedef proteinin bolluk afinite ortamın miktarına doğru titrasyon bağlıdır - Orta fazla olduğunda , boş paratoplar doğal akıtılan fraksiyonları gözlenebilen AP proteinlerinin dışı hedef birikimini izin verebilir. Burada açıklanan reaktifler ve prosedürler kullanılarak, bu HBizim deneyim olarak deneylere FP tek en büyük katkıyı bir kez canlı hücrenin bağlamında kaldırılır takılı protein kendisi olduğunu. (Şek. 1.II ve Şek. S1). Bu gibi durumlarda, antijen yokluğunda alakasız Proteomlar elde parental hücre hattı kontrol pratik değere sahip; aynı şekilde hedef antijen şey ama yoksun olan etiket okunur veya başak-denetimler için. Bu nedenle, doğrudan sayısal MS kullanarak post-lizis protein etkileşimleri birikimini ölçen I-KİR 7,38, ne zaman pratik uygulama. protokol Aşama 3.2.7 belirtildiği gibi, ana elüsyon için prosedürler kullanılmıştır afinite sistemi detayları ile değişecektir. Ana yıkama en çok eğilim aracı kompleksin serbest, etiketin etiketli protein kompleksi ya da proteolitik yarılma rekabetçi şekilde çıkarılması ile elde edilir. küçük epitop etiketleri oluşan çeşitli afinite sistemleri fo, mevcutR epitop kendisi etiketlenmiş protein kompleksleri 60 rekabet elüsyon için yararlı bir peptid olarak mevcut olduğu. Aynı şekilde, birçok proteazlar füzyon proteinleri 61 özel stratejik afinite yerleştirilen soydaş siteleri yarmak için kullanılabilir etiketli vardır. seçilen afinite sistemlerinin özelliklerine bağlı olarak, uygun bir yıkama düzeni kabul edilebilir. Genellikle, elde edilen sonuçların kalitesi önemli ölçüde numune hazırlama kalitesi ile etkilenecektir. Bakım ve hassasiyet korurken mümkün olduğu kadar çabuk bu protokollerin her adımda dikkatli ve hassas çalışmak ve önemlidir. Her manipülasyon etkinliğini anlamak için her adımda ilgilenilen proteinin bölümleme izlemek için tavsiye edilir. Örnek: söz konusu hücre ya da dokuda ilgili protein kadar bol? Belki çalışmada (ve kompleksleri) kapsamında, protein kütlece karakterize zor olacakDüşük bolluk nedeniyle spektrometresi. Saflaştırılmış Kompleksi (yaklaşık aralığı nanogram), genel protein lekeleme ile tespit ise, kütle spektrometrisi başarılı muhtemeldir. ilgi yakalanan proteinin, sadece duyarlı geliştirilmiş kemiluminesans batı lekeleme (yaklaşık pikogram aralık) tarafından tespit edilebilir varsa, kütle spektrometresi etkili olabilmesi için daha az olasıdır. İlgili protein hücre içinde bol miktarda olsa bile, hücre özü ne kadar bol üretilir? çözüm protein bölümü mı yoksa pelet var? İkincisi ise, yeni bir çıkarma çözüm düzeltebilir bu icat edilebilir. Hücre ekstresi için eğilim aracı ile birleştirilir sonra, ne kadar etkili proteinin yakalanır? Protein sonraki yıkar bağlı kalacağı mu? Peki ya diğer copurifying proteinler hakkında? protokol uygun adımları her numunenin bir bölümünde kaydederek Bu sorular havaalanı protein karşı Western blotting ile tipik haliyle, cevap olabilirya da genel bir protein boyama, ancak diğer deneyler de uygun olabilir. bir trade-off bir özelliği ya da diğer maksimize yapılacak olabilir ancak her adımı en iyi duruma getirme, yakalanan komplekslerin verim ve saflık artıracaktır. Birçok araştırmacı için afinite yakalama tipik bir uygulaması, ilgi konusu olan proteinlerin az sayıda in vivo uygulayıcılara adayı tespit etmektir; Bu adaylar genellikle fiziksel interactors biyolojik önemini göstermek için in vivo dik yaklaşımlarla doğrulama tabi tutulur. Affinity yakalama ayrıca, bir (neredeyse) proteom çapında gözlenen proteinleri copurifying in vivo komplekslerinde varsayılan ilişkin hesaplama çıkarımlar kolaylaştıran listeleri oluşturmak için yüksek verimli çalışmalar tarafından istihdam edilmektedir. Bu tür çalışmalar, çok sayıda örnek literatürde bulunabilir. Bu yaklaşım keşfetmek insanın lehine verilen herhangi bir hedef için yakalama koşullarının optimizasyonu foregoesy hedefler; Böyle, olayla kompleksleri olarak kendilerini nadiren herhangi bir numunede tamamen sağlam ve son derece saf alınır. Bunun yerine, bir çok farklı afinite çekilen örnekler arasında görülen bileşimler kısmi örtüşmeler çıkarımlar 42 bir temel olarak kullanılır. Her iki yaklaşım da interaktom anlayışımıza değerli verileri katkıda bulunur. Bununla birlikte, afinite yakalama biri büyük yararı sık sık, sağlam ve yüksek derecede saflaştırılmış çabalar prosedürünü optimize etmek için yapılması kaydıyla kompleksleri elde etmek için fırsat sunuyoruz olmasıdır. Biz, yaklaşım geleceği fizyolojik interactors ve daha aşağı biyokimyasal, enzimolojik daha sık kullanılması ve yapısal çalışmaların gamının daha doğru değerlendirilmesi için kolay ve endojen protein kompleksleri 11 yakalanmasını optimize verimliliğinin arttırılması yatıyor inanıyoruz örneğin, 7,9,23 başvuruyor.

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:
<ol start="29">
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
	<li>Williams, R. J., &#38; Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911&#8211;1912 (1932).</li>
	<li>Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
</ol>
to:
<ol start="29">
	<li>Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1&#8211;3at &#60;http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/&#62; Retsch GmbH (2014).</li>
	<li>Cristea, I. M., &#38; Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).</li>
	<li>Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63&#8211;117 (2005).</li>
	<li>Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321&#8211;349 (1964).</li>
	<li>Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404&#8211;427 (1964).</li>
	<li>Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680&#8211;685 (1970).</li>
	<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., &#38; Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856&#8211;2860 (2006).</li>
	<li>DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., &#38; Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at &#60;http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html&#62; (2006).</li>
	<li>Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624&#8211;637 (2011).</li>
	<li>Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., &#38; Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752&#8211;1756 (2005).</li>
	<li>Wang, X., &#38; Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46&#8211;57 (2008).</li>
	<li>Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223&#8211;239 (2008).</li>
	<li>Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861&#8211;879 (2010).</li>
	<li>Armean, I. M., Lilley, K. S., &#38; Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1&#8211;13 (2013).</li>
	<li>Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).</li>
	<li>Cheeseman, I. M., &#38; Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).</li>
	<li>Deppert, W. R., &#38; Luka&#265;in, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839&#8211;862 (1999).</li>
	<li>Ugwu, S. O., &#38; Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86&#8211;108 (2004).</li>
	<li>Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603&#8211;617 (2009).</li>
	<li>Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359&#8211;376 (2012).</li>
	<li>Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3&#8211;22 (2008).</li>
	<li>Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285&#8211;303 (2009).</li>
	<li>Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., &#38; Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403&#8211;3408 (2015).</li>
	<li>Glatter, T., Ahrn&#233;, E., &#38; Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).</li>
	<li>Zhao, Q.-Q., Yamada, S., &#38; Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29&#8211;36 (1989).</li>
	<li>Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., &#38; Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).</li>
	<li>Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345&#8211;347 (1982).</li>
	<li>Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597&#8211;604 (2001).</li>
	<li>Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).</li>
	<li>Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).</li>
	<li>Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., &#38; Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783&#8211;784 (2007).</li>
	<li>Zhao, X., Li, G., &#38; Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093&#8211;8 (2013).</li>
	<li>Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283&#8211;293 (2011).</li>
</ol>

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated.

Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Prosedürlerde tipik bir uygulaması, interactomic karakterizasyonu 1 ilgi endojen protein kompleksleri, yüksek verim ve saflıkta stabilize etmek ve elde etmektir. Esas olarak proteinlerden müteşekkildir hem stabil ve geçici olarak ilişkili olan makromoleküler kompleksler, dinamik ağlar, hücresel süreçleri 2,3 orkestra anlaşılmaktadır. Protein-protein etkileşimlerini belirlemek için çok sayıda deney yaklaşım olsa da, afinite yakalama izole edilmesi ve fizyolojik protein kompleksleri 4-6 kesme için en yaygın olarak kullanılan yöntemler arasında yer alır. Ayrıca, bu teknik, bir görüntü-okuma veri noktaları olarak sadece fiziksel kişiler gibi makromoleküler kompleksler üretme avantajına sahiptir; Avantajlı olarak, elde edilen kompleksler böylece ek alt biyokimyasal, enzimatik ve yapısal deneyleri 7-9 bir dizi de kullanılabilir. sunulan protokoller protein, harita ihtiyacına yanıt olarak geliştirilmiştirn-protein etkileşim ağları hücre biyolojisi efektör molekülleri olarak kendi rollerini makromoleküler kompleksleri karakterize ve. Bunlar doku kültüründe yetiştirilen memeli hücreleri için kendi uygulama ile ilgili olarak detaylı bir, ama uygun sistem özel ince ayarlar belirli bir biyolojik numune bir yelpazede aynı şekilde uygulanabilir. afinite yakalama tarihi ilk immünoafinite kromatografisi deneyleri ile geri yirminci yüzyılın uzanan - yaygın immunoprecipitation olarak günümüzde adlandırılan benzeyen (IP) - 1950&#39;lerin başında literatürde görünen. Tekniğin ana kullanım, mevcut 10-13 Bu yüzyılın geliştirilecek. Çeşitli hücre ve moleküler biyolojik çalışmalar, en azından son kırk yıl 14-19 için kriyojenik sıcaklıklarda öğütülmesi ile hücrelerin mekanik kırılmasını kullanmış olması; ve (süper) paramanyetik boncuk kullanılarak moleküler ayrımları bec varSon yirmi yıl 20&#39;den fazla giderek daha yaygın ome. Kendimiz tarafından üretilen işin geniş bir gövde ve daha geniş araştırma topluluğu tarafından kanıtlandığı gibi, sinerjik protein kompleksi afinite yakalama deneylerinde 1 elde edilebilir sonuçları iyileştirmek için hizmet vermiştir bu farklı teknolojileri birleştirerek 7,9,11,18,19,21 -23. Destekleyici sonuçları Şekil 1&#39;de sunulmuştur. Uyarılar ve etkili afinite yakalama deneyleri yürütme için geçerli hususlar koleksiyonu referansı 1 bulunabilir. Örneğin, ilgi konusu bir protein inter aktörlerin katalog şimdiye kadar bilinmeyen copurifying proteinleri (keşif analiz) tespit etmek için protein kütle spektrometrisi (MS) (I) e;: Tipik haliyle, bu yaklaşımın en uygun olan Belirli bir karşılıklı etkileşim eşinin mevcudiyetinde (II) deneyi, örneğin, içinde olduğundan şüphelenilen bir protein, özellikle protein veya sınırlı sayıda tespit etmek için, MS veya Western blot kullanımıfaiz (hipotez testi) protein ile teract; ya da (III) Ek teknikler ile daha fazla çalışma ile (hazırlama muamele) için ilgi konusu proteini ihtiva eden endojen monte edilmiş protein kompleksleri hazırlamak. bir afinite yakalama deney rejimine başlamadan önce, hedef proteinin, ilgilenilen doğal hedef proteinine karşı veya bir füzyon proteini eklenmiş bir etiket karşı, tipik olarak, bir IP-kompetan antikora bağlanan bir yüksek kaliteli afinite reajanı için kesinlikle gereklidir. tüm yaygın afinite yakalama ile birlikte kullanılan, Western blotting, ve protein MS (örneğin Coomassie mavisi, SYPRO Ruby veya gümüş aşağıdaki SDS-PAGE), genel protein lekeleme: yerinde yapılan deneysel okuma uygun yöntem için de önemlidir 1. sunulan protokolleri için eğilim aracı olarak bir antikor konjuge manyetik boncuklar kullanmaktadır. Iken afinite orta işlevi başlangıçta, birkaç deneysel parametreleri kullanan testlerde doğrulanabilirHer deney ampirik 1,11,24 optimize edilmelidir iyi sonucu elde. protokolleri üç ayrı faza ayrılır: donmuş hücre malzemesinin (1) hazırlanması; (2) çok düşük bir sıcaklıkta katı halde öğütme hücre kopması; ve (3) ekstraksiyon ve antikor-bağlı para-manyetik boncuklar kullanılarak afinite yakalama.

<table><tbody><tr><td>Growth media &amp;amp; cell culturing implements</td><td></td><td></td><td>For producing frozen cells (I)</td></tr><tr><td>500 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; culture dishes</td><td>Corning</td><td>431110</td><td>For producing frozen cells (I)</td></tr><tr><td>Large beaker (1-2 L)</td><td></td><td></td><td>For producing frozen cells (I)</td></tr><tr><td>Rectangular ice pan&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>13-900-747</td><td>For producing frozen cells (I), &amp;amp; cryomilling (II)</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>For producing frozen cells (I)</td></tr><tr><td>Large cell scrapers</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>08-100-242</td><td>For producing frozen cells (I)</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &amp;amp; affinity capture (III)</td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Corning</td><td>352098</td><td>For producing frozen cells (I), &amp;amp; cryomilling (II)</td></tr><tr><td>20 ml Luer lock syringe</td><td></td><td></td><td>For producing frozen cells (I)</td></tr><tr><td>Leur lock syringe caps</td><td>www.dymax.com</td><td>T11182</td><td>For producing frozen cells (I)</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td></td><td></td><td>For producing frozen cells (I)</td></tr><tr><td>50 ml tube rack, 4 position</td><td></td><td></td><td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &amp;amp; affinity capture (III)</td></tr><tr><td>Styrofoam box</td><td></td><td></td><td>For producing frozen cells (I), cryomilling (II), &amp;amp; affinity capture (III)</td></tr><tr><td>Planetary ball mill, PM 100&amp;nbsp;</td><td>Retsch</td><td>20.540.0001&amp;nbsp;</td><td>For cryomilling (II)</td></tr><tr><td>Stainless steel milling jar, 50 ml&amp;nbsp;</td><td>Retsch</td><td>01.462.0149</td><td>For cryomilling (II)</td></tr><tr><td>Stainless steel milling balls, 20 mm &amp;Oslash;&amp;nbsp;</td><td>Retsch</td><td>05.368.0062</td><td>For cryomilling (II)</td></tr><tr><td>Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>www.marcorubber.com</td><td>T1044-2.62x44.63</td><td>For cryomilling (II)</td></tr><tr><td>mini-LN&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; decanter</td><td>homemade</td><td>see Ref 19</td><td>For cryomilling (II)</td></tr><tr><td>250 ml PTFE jar insulator (optional)</td><td>homemade</td><td>The Rockefeller University</td><td>For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request</td></tr><tr><td>PTFE puck insulator (optional)</td><td>homemade</td><td>The Rockefeller University</td><td>For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.</td></tr><tr><td>5 bar/500 kPa pressure relief valve (optional)</td><td>http://www.leeimh.com/</td><td>558 series check valve</td><td>For cryomilling (II)</td></tr><tr><td>1.5-2 ml microfuge tubes</td><td></td><td></td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>Extractant</td><td></td><td></td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>Complete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets</td><td>Roche Applied Science</td><td>11873580001</td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td></td><td></td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td></td><td></td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>Microtip sonicator, Q700</td><td>Qsonica</td><td>Q700</td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>low intensity 1/16&amp;rdquo; microtip probe</td><td>Qsonica</td><td>4717</td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>Bench-top refrigerated microcentrifuge</td><td></td><td></td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Epoxy</td><td>Thermo Fisher</td><td>14302D</td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads</td><td>homemade</td><td></td><td>For affinity capture (III); see reference 19</td></tr><tr><td>Sample rotator&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>Neodymium magnet</td><td>Life Technologies</td><td>123-21D&amp;nbsp;</td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent)</td><td></td><td></td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>SDS-PAGE system</td><td></td><td></td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>SDS-polyacrylamide gel</td><td></td><td></td><td>For affinity capture (III)</td></tr><tr><td>Protein Stain</td><td></td><td></td><td>For affinity capture (III)</td></tr></tbody></table>

protein complex affinity capture from cryomilled mammalian cells

Affinity yakalama fazla çalışma için endojen protein kompleksleri izole etmek için etkili bir tekniktir. bir antikor ile birlikte kullanıldığında, bu yöntem, aynı zamanda sık sık immüno olarak adlandırılır. Afinite yakalama bir laboratuvar ölçekli ve yüksek verimli bir çerçevede uygulanabilir. Protein kütle spektrometrisi ile birleştiğinde, afinite yakalama interaktom analizi bir beygir olduğu kanıtlanmıştır. ilgili sayısız adımlar yürütmek için potansiyel birçok yolu olmasına rağmen, aşağıdaki protokoller bizim tercih yöntemleri uygulamak. İki özellik ayırt edici: eğilim aracı olarak hücre ekstreleri ve antikor-bağlı paramanyetik taneler oluşturmak için cryomilled hücre tozun kullanımı. Bir çok durumda, daha geleneksel bir afinite yakalama uygulamaları ile elde edilen üstün sonuçlar elde edilmiştir. Cryomilling hücre kopması diğer formları ile ilgili çok sayıda sorun önler. Denat kaçınarak Bu malzemenin verimli kırılma içerirIsıtma veya köpük ilişkili doyma sorunları. Bu makromoleküler ayrışma hafifletici, çıkarma noktasına doğal protein konsantrasyonu yukarı korur. Bu ekstre proteinler zararlı enzimatik aktiviteleri sınırlar çözelti içinde harcadığı zamanı azaltır ve afinite ortamı tarafından proteinlerin spesifik olmayan adsorpsiyon azaltabilir. Mikron ölçekli manyetik afinite medya giderek geleneksel agarose- ve Sefaroz tabanlı medya yerine, son birkaç yıl içinde daha yaygın hale gelmiştir. manyetik ortamda İlköğretim faydaları genellikle daha düşük spesifik olmayan protein adsorpsiyonu arasında; protein kompleksi bağlama çünkü hiçbir boyut dışlama sınırı yerine gözenekleri içinde daha boncuk yüzeyinde meydana gelir; ve manipülasyon kolaylığı ve mıknatıslar kullanılarak taşıma.

Şekil 1, panel ben cryomilling ve manyetik boncuk örnek kalitesini artırmak için birlikte çalışabilir olduğunu göstermektedir. Paneller IA-Cı afinite yakalama için kullanılan çözünmeyen bir ortam ihtiva eden malzemenin geri Proteomun 19 etkileyebilir göstermektedir. İlgili protein saflaştırılmış FLAG-etiketli bakteriyel alkalin fosfataz (BAP), insan hücre ekstreleri halinde spaykı. BAP özel etkileşim insan proteinleri copurify beklenmemektedir. SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile değerlendirildiği copurifying proteinlerin imzası kullanılan akışkana bağlı olarak değişmektedir. Mikron ölçekli manyetik boncukları spesifik olmayan protein adsorpsiyon nispeten düşük bir seviyesini gösteren, en temiz profili gösterdi. Paneller numarası ve IE hücre parçalama yöntemi, aynı zamanda geri Proteomun etkileyebilir göstermektedir. Resim örnekte, bir endojen protein sitesini (37 kompleks), afinite captu tabi tutuldu vecyromilled veya sonike hücreden yeniden 19 ayıklar. Hücre ekstresi cryomilled hücre tozundan üretilen zaman daha az yüksek kütle kirleticiler gözlendi. endojen protein kompleksleri incelemek için afinite yakalama kullanarak bir meydan okuma yanlış pozitif (FP) ilgi proteinin iyi niyetli fizyolojik inter aktörlerin ayırt etmek zor olabilir olmasıdır. FP ve / veya ilgi duyulan kendisinin proteine ​​spesifik olmayan tüpler ve kaplar adsorpsiyon, afinite ortamı antikor veya afinite ligandı dahil olmak üzere birçok kaynaktan ortaya çıkabilir. Sonuç olarak, kayda değer çaba yakalama işlemi optimize tahsis edilmelidir. FP tespiti farklı araçlar çok sayıda deneysel 38-40 ve hesaplamalı farklı artıları ve eksileri ile 41-43, her yaklaşımları da dahil olmak üzere, geliştirilmiş edildiği için merkezi bir sorun olmaya devam etmektedir. Kendi deneylerde daha önce F bir model belirtildiğiP proteini kontrol hücre özleri ile α-FLAG manyetik ortamın kuluçkadan sonra elde edilen, bu 3xFLAG-etiketli proteinlerinin varlığında elde edilen model farklı olduğu bağlanma. Bundan başka, bu FP 3xFLAG peptid 7 ile inkübasyon yoluyla ortamdan serbest olabilir. Bu gözlem, fırsatçı aynı kökenli epitopunun yokluğunda α-FLAG paratop fps bağlanması ile tutarlıdır. birçok çalışma afinite yakalamak için sahte bir kontrol olarak etiketsiz &#39;ebeveyn hücre hattı&#39; kullanmak beri bu FP kökenli doğasını anlamak önemlidir; bu kontroller nedenle etiketli protein ile etkileşimleri özgünlüğünü belirlemek için uygun olmayabilir. arka plan belirlemek için antikor paratoplar işgal bizim afinite ortamı katkıda ya da değil, biz 3xFLAG ve α-BAYRAK manyetik ortam ve varlığında HEK 293T hücre özleri (hiçbir takılı protein ifade) veya yokluğunun kullanarak sahte afinite yakalama deneyler yaptılar bağlanmapeptid başak-in. Sonuçlar, Şekil 1, panel II&#39;de gösterilmiştir. Kısaca, α-FLAG manyetik ortam hücre özütlerinde inkübe edildi, 30 dakika boyunca, pH 7.4, 20 mM HEPES-Na Triton X-100 V ila 500 mM NaCl ve% 1 v / ihtiva eden (≳10 mg / ml toplam protein). Ortam daha sonra rekabetçi bir denatüre edici elüsyon elde etmek α-FLAG paratop yerel olarak veya SDS-PAGE numune tampon maddesi ile bağlı olan herhangi bir protein yer değiştirmesi için 1 mg / ml 3xFLAG peptidi ile enkübe edilmiştir. Hücre ekstreleri ml 1 ug / ve 3xFLAG peptid 10 ug / ml ile tutturuldu ek olarak, aynı deney gerçekleştirildi. Yıkanarak ayrılan bütün fraksiyonlar, SDS-PAGE ve gümüş lekeleme tabi tutuldu. Bu kendi aynı kökenli epitopa yokluğunda, α-FLAG ortamı 3xFLAG peptidi ile elüte edilebilir plan proteinleri taranabilir düzeyde bir yakalama yok olduğu görülmektedir - Şekil 1-II ile verilen örnekte, baskın türler 37 ile gözlenmiştir 50 kDa. ile elüt desenSDS-PAGE örnek tamponu ilave belirgin türleri ile, karşılaştırılabilir. Bununla birlikte, 1 ug / ml 3xFLAG peptid varlığında AP için eğilim aracı bağlanma tespit seviyesinin altında elimine edildi ve ya doğal ya da denatüre elüsyon fraksiyonlarında gözlenmedi. Bu sonuç, 3xFLAG / α-Flag M2 olduğu gibi, boş antikor paratoplar kendi aynı kökenli epitopunun yokluğunda seçici olmayan olabilir ve hatta yüksek afinitede epitop bağlanan antikorların afinite yakalama sırasında elde edilen proteomu önemli ölçüde katkıda düşündürmektedir eşleştirme. Ayrıca, çoğunlukla, spesifik olmayan azaltmak için seçilen yüksek tuz kullanılarak, çok katı koşullar, antijen / antikor etkileşimi olmadan etkili olabileceğini suggestd. Takip biz SDS-PAGE yanı sıra nicel MS (Şek. S1) tarafından benzer bir deney de dahil olmak üzere analizi yapıldı. sayısal 347 Proteinlerin, her proteinin bir (yanlış disko kaydetmek görülmektedirÇok oranı =% 1; Bir 3xFLAG peptid kontrol örneği çivili ile karşılaştırıldığında Tablo S1) 3xFLAG etiketli yem protein ile ilişkili bulunmuştur. Bu sonuçlar, deneylerde proteinlerin çoğunluğu etiketli protein ile birlikte saflaştırmak için muhtemel olan veya boş α-FLAG paratoplar yan ürünlerinin hedef dışı olduğunu gösterir. Deneyimlerimize göre, yüksek sinyal-gürültü afinite yakalama sonucu, keskin, bol ve yaklaşık stoikiometrik bantlar gibi diğer sönük bant arka plan boyaması bir yetersizlik ayrık bir modeli ile SDS-PAGE ve protein boyama örneklenmiştir; Bu prensibin bir çok örneği, referans 11&#39;de görülebilir. Cryomilling zaman (önerilir) PTFE yalıtkan kullanmak için güdü, öğütme sırasında kavanozun ısınma oranını azaltmak öğütme işlemi sırasında tekrarlanan LN 2 soğutma yükünü hafifletmek ve buz derecesini azaltmak içinkavanoza oluşumu. Bu tutarlı bir freze performansı kolaylaştırır ve hücre tozu işleme kolaylaştırır. Örnek yalıtkanlar referans 27 (diskleri) bulunan ve Şekil 2, aşağıdaki (kol ve-diski) tasvir edilebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig1.jpg" /> Şekil 1: Temsilci Sonuçlar seçin. (I) &#39;in bu panel referans 19 modifiye edilmiştir. Coomassie Blue SDS-poliakrilamid jel boyandı. (SOL) Mikron ölçekli manyetik boncuk hedef dışı agaroz tabanlı medya daha bağlayıcı düşük gösteriyor. (A), manyetik boncukları; (B) geleneksel agaroz; (C) demir emdirilmiş (manyetik) agaroz; Her anti-FLAG M2 antikorlara bağlı olan ve FLAG etiketli bakteriyel alkalin fosfatazı yakalamak için kullanılan (BAP; etiketli) cryomilled HEK-293 hücrelerinden üretilen özler içerisine arttı. Agaroz bazlı saflaştırmaspesifik olmayan adsorpsiyon (etiketlenmemiş grupları) daha yüksek seviyeleri göstermişlerdir. endojen protein kompleksi saflaştırmak için kullanıldığında cryomilled HeLa hücrelerinden üretilen (sağ) özler sonikasyon ile üretilen daha antikor bağlanmış manyetik boncuk üzerine düşük hedef dışı adsorpsiyonu sergiler. LAP-etiketli 44 RBM7 SONRAKİ kompleksi 19,37 (D) saflaştırmak için poliklonal anti-GFP antikorlara bağlanmış manyetik boncuklar kullanılarak çekilen afinite cryomilled bir toz elde edilen ekstre olmuştur; (E) ekstreler sağlam hücrelerinin sonikasyonu ile üretilir. dikey siyah çubuk yüksek kitle non-spesifik interaktörler sonication tarafından hazırlanan numunede zenginleştirilmiş bir biçimde gözlenir jel bölgesini vurgular. siyah oklar beklenen spesifik inter aktörlerin belirtilen (etiketli). şerit D ve E ~ 50 kDa gözlenen bantlar lama IgG ağır zincirlerine bağlanabilir. (II) gümüş SDS-poliakrilamid jel boyandı. (Std.) Bir sahte afinite yakalama HEK-293 üzerinde yapılanT hücresi standart bir şekilde ayıklar. yakalanmasından sonra, bağlanmış malzeme elüsyon (N) 1 mg / ml 3xFLAG peptit veya SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde elüsyon denatüre (D), denatüre edici olmayan elüsyon yoluyla elde edilmiştir; Std olarak (PB 1). ancak 3xFLAG peptid afinite ortamı üzerinde α-FLAG paratoplar engellemek için 1 ug / ml ekstraksiyon çözeltisi dahil edilmiştir; PB 1 Ama 10 ug / ml 3xFLAG peptid varlığında (PB 10). IgG ilgili bantları ve 3xFLAG peptid etiketli. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54518/54518fig2.jpg" /> Şekil 2: Kol-ve-pak PTFE yalıtkan. 250 ml&#39;lik bir PTFE kavanoz gösterilir (1). 50 ml&#39;lik paslanmaz çelik öğütme kavanoz (2) PTFE kavanoz (3) içinde uyuyor ve sağlarfırsat döngüleri arasındaki değirmen içinde yüklü freze kavanozu bırakmak. Bir üst PTFE yalıtkan cin (2) kelepçe montaj ve kavanoz kapağının arasında kullanılır. Yüklü kavanoz ve yalıtkan düzeneğini (3) soğutmak için, LN 2 kavanoz çevreleyen izolatör gövdesine doğrudan ilave edilir. freze sonraki döngü sonra başlatılabilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reaktif </td><td> önerilen Konsantrasyon </td><td> notlar </td></tr><tr><td> Sodyum klorit </td><td> 0.1-0.5 M </td><td> Yüksek konsantrasyonda (&gt; 300 mM) total protein çıkarılmasını artırmak ve düşük arka plan tutmak eğilimindedir, ancak bazı başka türlü istikrarlı Inter uzaklıkta şerit olabiliraktörler. 150 mM altındaki konsantrasyonlar spesifik olmayan arka plan azaltılması tipik olarak etkili değildir. </td></tr><tr><td> amonyum asetat </td><td> 0,2-2 M </td><td> İki tampon oluşan bir tuz, bir nötr pH değeri çözelti 57 elde edilir. Daha yüksek konsantrasyonları bazı protein kompleksleri stabilize eder. Asidik çözümler amonyak kaybı nedeniyle eski, yanlış depolanan kristalin stoklarından neden olabilir. Ek pH tamponu ya da tuzlar, amonyum asetat içeren ekstraksiyon gereklidir. Elde edilen sonuçlar modüle NaCl ile kombine edilebilir. </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> % 0.1 h / h </td><td> Bir non-iyonik bir deterjan 58; tipik olarak, NaCl ile birleştirildi. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 0.5-1% h / h </td><td> Bir non-iyonik bir deterjan 58; tipik olarak NaCl veya NH4 CH3 CO 2H ile kombine </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 5 mM </td><td> Bir zvitteryonik deterjanın 58 &lt;/ Sup&gt;; tipik olarak, NaCl ile birleştirildi. </td></tr><tr><td> Sarkosyl </td><td> 1 mM </td><td> Arka plan azaltır ve potansiyel olarak ikili bağlantı açığa kararlı kompleks bileşenler kapalı şerit olabilir anyonik deterjan 58; tipik olarak, NaCl ile birleştirildi. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Tris-CI </td><td> 20 mM </td><td rowspan="2"> pKa, 4 ° C, 25 ° C &#39;de 8.1 8.8. </td></tr><tr><td> (PH 8.0) içinde </td></tr><tr><td rowspan="2"> HEPES-Na </td><td> 20 mM </td><td rowspan="2"> pKa, 4 ° C, 25 ° C &#39;de 7.5 7.8&#39;e a. Veya NaOH KOH tuzuna bağlı olarak, pH dengeleme için (örneğin NaCl, KCI, veya CH3 CO2 K) özümleme kullanılır. </td></tr><tr><td> (PH 7.4) </td></tr></tbody></table> Tablo 1: protein kompleksleri saflaştırılması için önerilen bir kaç reaktifler yararlı. Bu tablo, lTavsiye edilen çalışma konsantrasyonlarda insan hücre çizgilerinden saflaştırılması protein kompleksleri için yararlı olan bazı reaktifler, ists. Tipik bir özütleyici formülasyon bir pH tamponu, bir tuz ve bir deterjan 1,11,24,45-48 içerir. En iyi uygulama istenen sonucu verir reaktiflerin az karmaşık kombinasyonunu tespit etmektir. <img alt="Şekil S1" src="/files/ftp_upload/54518/54518figS1.jpg" /> Şekil S1: Mix yanlış pozitiflerin saflaştırılması (harita görüntüleme) SILAC analizinden sonra. I. Şematik: Bu deneyde sırasıyla Ağır ve hafif etiketli HEK-293T hücreleri 7 saflaştırılmıştır (pLD401 eksprese) ORF2p protein kompleksleri 3xFLAG etiketli. Işık etiketli hücre ekstraktı rekabetçi inhibe ederek 3xFLAG etiketli ORF2p afinite yakalama önlemek için 3xFLAG peptid ile çivili edildi; Bu olmayan öz dirençli oluşabilir protein bağlanmasını bloke beklenmemektedirManyetik orta ya da antikorun olmayan paratopic yapılar ile otomatik. Manyetik boncuklardan yıkanmasından sonra, ağır ve hafif örnekleri karışık sonrası saflaştırma ve kantitatif MS ile analiz edildi numune ya da bağlantılı proteinler parçasını belirlemek için, (39-SILAC MAP); Tablo S1 bulunan başka metodolojik ayrıntı. II. Gümüş hafif ve ağır etiketli malzeme benzer sonuçlar (H L karşılaştırın) elde olduğunu gösteren jelini ve 3xFLAG başak in (II) varlığında gerçekleştirilir saflaştırma rekabetçi inhibe oldu. Aşağıda, Tablo S1 de tarif edildiği gibi, karışık H ve önceden jel bazlı proteomik analizi LI kısımları kapsayan Coomassie Mavi G-250 ile renklendirilmişlerdir jel yatağından. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/54518figS1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir sürümünü indirmek için buraya tıklayınız.</a> Tablo S1:MAP-SILAC. Bu levha Şekil S1 açıklanan MAP-SILAC deney yürütülmesi üzerine elde edilen veriler içeriyor. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54518/Table_S1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells at JoVE.com

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

protein-complex-affinity-capture-from-cryomilled-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.9K Görüntüleme.  The Rockefeller University.  Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder. 

Video: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Biyokimya

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein interactions in yeast. It allows analysis of a target region of interest without the need for prior knowledge about likely proteins bound to the target region. This, in theory, allows HyCCAPP to be used to analyze any genomic region of interest, and it provides sufficient flexibility to work in different cell systems. This method is not meant to study binding sites of known transcription factors, a task better suited for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-like methods. The strength of HyCCAPP lies in its ability to explore DNA regions for which there is limited or no knowledge about the proteins bound to it. It can also be a convenient method to avoid biases (present in ChIP-like methods) introduced by protein-based chromatin enrichment using antibodies. Potentially, HyCCAPP can be a powerful tool to uncover truly novel DNA-protein interactions. To date, the technology has been predominantly applied to yeast cells or to high copy repeat sequences in mammalian cells. In order to become the powerful tool we envision, HyCCAPP approaches need to be optimized to efficiently capture single-copy loci in mammalian cells. Here, we present our adaptation of the initial yeast HyCCAPP capture protocol to human cell lines, and show that single-copy chromatin regions can be efficiently isolated with this modified protocol.

This is a method to identify novel DNA-interacting proteins at specific target loci, relying on sequence-specific capture of crosslinked chromatin for subsequent proteomic analyses. No prior knowledge about potential binding proteins, nor cell modifications are required. Initially developed for yeast, the technology has now been adapted for mammalian cells.

Hibridizasyon uyarlaması yakalama kromatin ilişkili proteinlerin proteomik memeli hücreleri için

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Genetik

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Biyoloji

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the posttranslational modifications, microtubules can form complexes with various interacting proteins. These microtubule-protein complexes are often implicated in human diseases. Understanding the structure of such complexes is useful for elucidating their mechanisms of action and can be studied by cryo-electron microscopy (cryo-EM). To obtain such complexes for structural studies, it is important to extract microtubules containing or lacking specific posttranslational modifications. Here, we describe a simplified protocol to extract endogenous tubulin from genetically modified mammalian cells, involving microtubule polymerization, followed by sedimentation using ultracentrifugation. The extracted tubulin can then be used to prepare cryo-electron microscope grids with microtubules that are bound to a purified microtubule-binding protein of interest. As an example, we demonstrate the extraction of fully tyrosinated microtubules from cell lines engineered to lack the three known tubulin-detyrosinating enzymes. These microtubules are then used to make a protein complex with enzymatically inactive microtubule-associated tubulin detyrosinase on cryo-EM grids.

Here, we describe a protocol to extract endogenous tubulin from mammalian cells, which can lack or contain specific microtubule-modifying enzymes, to obtain microtubules enriched for a specific modification. We then describe how the extracted microtubules can be decorated with purified microtubule-binding proteins to prepare grids for cryo-electron microscopy.

Kriyo-Elektron Mikroskobu ile Mikrotübül Protein Komplekslerini İncelemek için Memeli Hücrelerinden Modifiye Mikrotübüllerin Çıkarılması

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...