Teknik olarak zor veya maliyetli olan hastalık direnci, mineral içeriği gibi belirlenmesi zor veya maliyetli olan ıslah özellikleri için oldukça yararlı olacaktır. Oldukça basit, uygun maliyetli ve yüksek iş yapma tekniğidir. Başlamak için, 96 kuyulu BIR PCR plakanın her kuyuya dört yapraklı disk yerleştirin.
Her kuyuya 50 mililitre arabellek bir çözüm ekleyin. Tabağı eksi 80 derecelik dondurucuda 10 dakika dondurun. Daha sonra, oda sıcaklığında tabağı defreeze.
95 derecede 10 dakika kuluçkaya yat. Her kuyuya 50 mikrolitre tampon B ekleyin ve girdap yaparak iyice karıştırın. 1, 500 kez g bir dakika için plaka santrifüj.
PCR için DNA olarak supernatant toplamak. İlk olarak, dna supernatant yanı sıra PCR şablonu annealing sıcaklığı optimize etmek için kullanın. Her PCR kuyusuna reaktifler ve bir mikrolitre DNA süpernatant ekleyin.
PCR tüplerini degrade özellikli bir termal blota yerleştirin ve her hedef parça için en uygun tavlama sıcaklığını belirlemek için ısıtma programını el yazmasına göre ayarlayın. Amperonları incelemek için PCR ürünü için %1 agarose jelüzerinde elektroforez yapın. Hedef parçanın özel amplifikasyonuna olanak tanıyan en uygun tavlama sıcaklığını belirleyin.
HRM analizini gerçekleştirmek için, hrm uyumlu plakaların her kuyusunda 10 kez floresan boyanın bir mikrolitresi ve bir mikrolitre DNA süpernatantı dahil olmak üzere reaktifleri birleştirir. Her plaka, bir vahşi tip ebeveynli örnek ve DNA olmadan bir negatif kontrol içerir. Buharlaşmayı önlemek için her kuyuya bir damla mineral yağ ekleyin.
Daha sonra plakayı yapışkan filmle kapatın ve 1000 kez g'de bir dakika santrifüj edin. PcR'yi optimize edilmiş annealing sıcaklığını kullanarak çalıştırın. Şimdi, yapışkan filmi plakadan çıkarın ve plakayı bir HRM makinesine takın.
Yazılımda, dosya menüsünden Yeni Çalıştır'ı seçin veya ekranın üst kısmındaki Çalıştır düğmesine basın. Erimenin başlangıç ve bitiş sıcaklıklarını 55 ila 95 santigrat derece ye belirtin. Yüksek çözünürlüklü erime çözümlemesi için örnekleri seçin ve negatif denetime benzer örnekleri hariç tayın.
Aynı başlangıç ve floresan biten için erime eğrileri normalleştirin. Alt minimum ve daha düşük maksimum sıcaklık imleçlerinin eğrilerin bir bölgesinde olduğunu görsel olarak doğrulayın. Delta F,floresan farkı, 05 varsayılan ayarında düzeyi tutun.
Standartlar seçim listesinden, ortak karşı varyantı seçin ve normal duyarlılığı seçin. Denetim olarak vahşi türünü kullanmak için H12'yi seçin. Delta F değeri 05'ten büyük olan numuneler mutant bitki içerdiği kabul edilir.
Daha sonra, bir CTAB yöntemi kullanarak, erime eğrisi vahşi tip önemli ölçüde farklı mutant havuzundan dört bitkilerin her birinden DNA ayıklayın. Bir spektrofotometre kullanılarak sayısallaştırmadan sonra, NanoDrop 2000 ile DNA'yı mikrolitre başına yaklaşık 25 nanogramlık son konsantrasyona ayarlayın. PCR tüplerdeki DNA örneğine 0,4 mikrolitre PCR astar ekleyin, termal bir döngüye yerleştirin ve hedef parçayı yükseltmek için programı ayarlayın.
Ardından, PCR ürünlerini sıralama için bir şirkete gönderin. Sanger diziliminden sonra, M2 bitkisi ile yabani tip arasındaki dizileri karşılaştırarak moleküler lezyonu karşılaştırın. Bu çalışmada, OSLCT1 veya SPDT genlerinde mutasyonlar için M2 fidelerinin hrm taraması ve analizi, örneklerin çoğunun 05'ten az delta F ile yabani tipten önemli ölçüde farklı olmayan erime eğrileri olduğunu göstermiştir.
Mutantlar delta Fs 05'ten büyük 90 ila 92 santigrat derece ve 81,5 ila 83,5 santigrat derece sıcaklıklarda, sırasıyla önemli ölçüde farklı HRM eğrileri gösterdi. 4, 560 M2 fidesinin genlerdeki mutasyon tipi ve pozisyonu sıralanan kromatogramlar tarafından doğrulandı. 4'te G ile A mutasyonu olan heterozigot bir bölge, OsLCT1'in 304 baz çifti saptandı.
Tek nükleotid OsLCT1'in 4, 240 baz çiftinde bir nükleotit insersiyon, 5, 948-5, 950 baz spdt baz çifti pozisyonunda TTC trinükleotid delesiyonu gözlendi. HRM analizinden önce PCR'yi optimize ediyorum. Jel boya biraz zararlıdır.
Jeli çalıştırırken eldiven giymeyi unutmayın.
