Bu protokol, tek molekül düzeyinde ve diğer enzimatik sistemlerde flep enonuklease 1 ile Holliday kavşağının etkileşim dinamiklerini ve çözünürlüğünü izlememizi sağlar. Eh, bazı moleküler nüfus boyunca ortalama olacak ya da altta yatan bireysel mekanistik adımları güvenli ve var. Tek moleküllü yöntemler, tek tek moleküllerin gerçek zamanlı davranışlarını izleyerek bu ayrıntıları sağlar.
Tek moleküllü yöntemler, piko ve nanomolar aralıktaki biyomoleküler etkileşimleri yüksek özgüllükte verimli bir şekilde algılayabilir. Tanılama, genom dizilimi ve algılama da birçok pratik çözüm için kullanışlıdır. Optik ve zorunlu ölçüm tek moleküllü yöntemler fizik, kimya ve biyoloji de yaygın olarak uygulanır ve diğer yöntemlerle erişilemez asil gözlemler sağladığı kanıtlanmıştır.
İlk kez kullananlara tavsiyem, bu protokolde belirtilen ayrıntılı adımları yakından takip etmektir. Bu protokolün uygulamalı prosedürünün görsel çizimleri tekniğin başarılı bir şekilde uygulanmasına yol açacaktır. Tek kanalakış hücresini hazırlamak için, 50 ila 20 milimetrelik kuvars kaydırağının orta kısmında, 37 milimetre arayla ve kaydıraktan 6,5 milimetre uzakta iki adet 1,22 milimetre çapında delik açarak başlayın.
41'i 2,25 milimetrelik bir kanalı 50'ye 20 milimetrelik çift yapışkanlı bir levhaya kesmek ve koruyucu kapağın plastik tarafını soymak için elektronik bir kesici kullanın. Parçanın kenarlarını kuvars kaydırağının kenarlarıyla hizalayın ve hapsedilmiş hava kabarcıklarını nazikçe çıkarmak için bir çift politetrafloroetilen cımbız kullanın. Yapışkan parçanın kağıt tarafını soyun ve parçayı bir kapak fişinin işlevselleştirilmiş yüzeyine monte edin.
Daha sonra, giriş için 11 santimetre uzunluğunda 11 santimetre uzunluğunda 1.22 milimetre iç çapı ile polietilen boru bir parça ve çıkış için 25 santimetre boru bir parça kesti. Daha sonra tüpleri akış hücresi için giriş ve çıkış tüpleri olarak daha önce delinmiş deliklere yerleştirin. Ve giriş ve çıkış tüpleri kuvars kapak kayma arayüzü kenarları mühür için beş dakika epoksi tutkal kullanın.
Hücre kuruduğunda, pbs mililitre konsantrasyonu avidin başına 0,03 miligram filtre0.03 mikrometre sifon için 1 milimetreş kullanın tampon tek başına profüzyon sonunda herhangi bir aşırı avidin yıkamak için tek başına dolu ikinci bir şırınga kullanarak. Tek renkli bir FRET deneyi gerçekleştirmek için, ilk olarak bir damla daldırma yağını toplam iç yansıma floresan hedefine uygulayın ve arka plana sinyali optimize etmek ve doygunluğu önlemek için fotoelektronların çip teki çarpımını uygun bir kazanç elde etmek için ayarlayın. Akış hücresini numune tutucunun üzerine dikkatlice yerleştirin ve yağ kapak kaymasına değene kadar hedefi kademeli olarak yükseltmek için rota ayarlamasını kullanın.
532 nanometre lazeri açın ve hedefin ince ayar moduna geçin. Monitördeki görüntüyü gözlemlemek ve kapağın işlevselleştirilmiş yüzeyi netleşene ve monitörde gözlemlenene kadar hedefin yüksekliğini ayarlamak için emisyonu kamera portuna yönlendirin. Kapak fişlerinin işlevselleştirilmiş yüzeyinden arka planın floresan etiketli HJ'de akmadan önce birkaç noktayı aşmadığını kontrol edin. Sistem 0,2 ila 0,5 mikrolitre de hazır olduğunda, oksijen atma sistemi ile 120 mikrolitre görüntüleme tamponuna seyreltilmiş ilgi nin mikrolitresi 0,5 mililitrelik bir tüpe bağlanır ve yavaş hücrenin çıkışını şırınga pompasına bağlar.
Giriş tüpünü 1,5 mililitrelik tüpe takın ve çözeltiyi tüpten çekmek için şırınga pompasını dakikada 30 ila 50 mikrolitreden başlatın. Sık sık homojen olarak dağıtılan, iyi aralıklı substrat 100 ila 300 parçacıklar ile hücrenin iyi bir kapsama onaylamak için yeşil lazer ile kısa bir süre yüzey görüntü. Akış hücresi yüzeyi yeterince kapalıise, herhangi bir bağlı HJ yıkamak için dakikada 30 ila 50 mikrolitre görüntüleme tampon başka bir 120 mikrolitre floş ve oksijen scavaging sistemi çözünmüş oksijen tüketmek için izin akış hücresi 5 dakika oturup izin.
Pozlama süresini yaklaşık 60 milisaniye olarak ayarlayın. Döngü süresi, veri aktarım hızına bağlı olarak yazılım tarafından otomatik olarak ayarlanır. İstenilen döngü sayısını veya kare sayısını yaklaşık 400'e belirtin.
Donör ve kabul eden floroporlardan kaynaklanan emisyon, görüntü ayırıcı cihaz tarafından renk kanallarına bölünür. Yüzeyde uygun bir alan seçin, görüntüyü odaklamak ve kaydetmek ve filmi 16 bit tiff formatında kaydetmek için hedefin yüksekliğini ayarlayın. Sonra yeni bir alana taşıyın.
Dakikada 30 mikrolitre akış hızında, bir seferde bir konsantrasyonda GEN1'in belirtilen konsantrasyonları ile desteklenen 120 mikrolitre görüntüleme tamponu ile hücreyi temizleyin. HJ dekolte deneyinin çözümünde, akış hızını dakikada 110 mikrolitreye ayarlayın ve enzimin akış hücresine girişinden 5 ila 10 saniye önce kaydı başlatın. enzimin akış hücresine girişinden 5 ila 10 saniye önce başlayacak görüntüleme olay sayısını en üst düzeye çıkaracaktır.
Tüm konsantrasyonlar test edildiğinde, görüntü bölme cihazında donör ve kabul eden parçacıkları birbirine haritalamak için sabit floresan boncuk kaydırağı kullanın. Dönüşüm matrisi oluşturmak için uygun yazılım paketini yükledikten sonra, kaydedilen boncuk slayt filmini açın ve bağışçı ve kabul eden kanallardaki tek tek boncukların konumlarını seçin. Sabit boncuk slaytından matris oluşturulduğunda TFORM Yükle'yi tıklatın ve dönüşüm matrisdosyasını seçin.
Kanal filtresi açılır menüsünde, hem donör hem de kabul edenle etiketlenmiş parçacıklar için d&a seçeneğini tıklatın. Daha sonra, her molekül için zaman izlerini oluşturmak için kılavuzda belirtildiği gibi plotTimetraceCW girin. ALEX FRET deneyini gerçekleştirmek için, yeşil ve kırmızı lazerlerle doğrudan uyarmalarla arka arkaya donör ve kabul edici emisyonlardan oluşan bir film kaydedin.
Edinilmiş ALEX filmlerini açın ve donör uyarma, donör uyarma nedeniyle kabul veya emisyon ve doğrudan uyarma kanalları nedeniyle kabul veya emisyon nedeniyle donör emisyon her biri için yaklaşık 300 uygun algılama eşiği ayarlayın. Hem donör hem de kabul veren partikülleri seçmek için uygun kanal filtrelerini uygulayın ve üç kanalın her birinde 200 ila 300 partikül bağla. Histogram'ın işlevlerine farklı zirveler sığdıran ALEX histogramları oluşturmak için plotHistALEX MATLAB kodunu kullanın ve her popülasyon için eğrinin altındaki alanın yüzdesini belirlemek için uygun bir grafik ve analiz programı kullanın.
Daha sonra fret ve doğrudan uyarma nedeniyle kabul edici emisyonlarda doğrudan uyarma ile donör emisyon gösteren her molekül için bir zaman izi oluşturmak için plotTimetraceALEX MATLAB kodunu kullanın. Bitişik etiket X-0 bu temsili uyarma FRET histogram daha bol ve daha az bol izomerleri değiş tokuş karşılık gelen iki zirvegösterir. İzomerlerin Dwell zaman histogramlarından elde edilen izomerizasyon oranları daha önce bildirilenlerle tutarlıdır.
ALEX tarafından elde edilen farklı GEN1 konsantrasyonlarında bitişik etiket X-0 kavşak tek molekül FRET histogramları, düşük FRET zirvesinden daha az bol izomer katkısı çıkarıldıktan sonra bağlı HJ popülasyonuna karşılık gelen serbest yüksek FRET izomerve bir tepe karşılık gelen bir tepe ortaya koymaktadır. Doyuryan GEN1 konsantrasyonunda, X-0'ın FRET histogramı, model tarafından öngörüldüğü gibi HJ'nin her iki izomerine bağlı gen1'e karşılık gelen tek bir düşük FRET tepe noktasına sahiptir. GEN1 monomerinin HJ'ye bağlanması ve ardından dimer oluşumu, çözeltide dimerik formda bulunan prokaryotik resolvases ile karşılaştırıldığında ökaryotik HJ resolvase GEN1'in eşsiz bir özelliğidir.
GEN1 monomer bağlanır ve HJ bozar diğer kanıtlar düşük GEN1 konsantrasyonlarında magnezyum varlığında istikrarlı bir düşük FRET durumu ile amcaaved parçacıkların izleri önemli sayıda gözlem. Bir ara ortaya çıkmadan oluşan çözülmüş X-0 izlerinde istikrarlı bir düşük FRET durumundan sonra donör ve kabul edenin aynı anda ayrılması, GEN1 HJ kompleksinin ömrü boyunca tam bir çözünürlüğün oluştuğunu gösterir. İşlevselcam yüzeyden arka plan birkaç noktalar aşmamalıdır ve eşit dağılmış parçacıklar iyi sonuçlar elde etmek için gerekli olduğunu unutmayın.
Serileştirme resmini hazırlarken her zaman kişisel koruyucu ekipman ve duman başlığı kullanın. Lazerlerle çalışırken dalga boylarına özgü koruyucu gözlük taktığından emin olun. Kriyo ap, nükleer manyetik rezonans gibi diğer yöntemler, atomik düzeyde yapısal ayrıntılar sağlayabilir.
Bu bilgiler, tek moleküllü FRET deneylerinin tasarımı ve yorumlanması için ayrılmaz bir parçasıdır. Tek moleküllü FRET, DNA replikasyonu alanında yeni görünümler açarak, helicase'lerin ve nükleazların hareket mekanizmalarının daha derin anlaşılmasını sağlar.
