Sharlene Murdoch'a ve Babraham Enstitüsü Tesisleri'ne destekleri için teşekkür ederiz. JLP Wellcome Trust (093970/Z/10/Z) ve OC ERC 638426 ve BBSRC [BBS/E/B000C0426] tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells.">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biology. 4 (10), 309 (2006).</li><li>Semrau, S., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+lineage+decision-making+in+vitro:+emerging+concepts+and+novel+tools.">Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools.</a> Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).</li><li>Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+epigenomics:+Recording+the+past+and+predicting+the+future.">Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future.</a> Science. 358 (6359), 69-75 (2017).</li><li>Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+measuring+and+understanding+biological+noise.">Challenges in measuring and understanding biological noise.</a> Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).</li><li>Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression:+from+single+molecules+to+the+proteome.">Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 17 (2), 107-112 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , (2015).</li><li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans.">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li><li>Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance.">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).</li><li>Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+age+generates+phenotypic+variation+in+Caenorhabditis+elegans.">Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).</li><li>Serra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adapting+the+Smart-seq2+Protocol+for+Robust+Single+Worm+RNA-seq.">Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq.</a> Bio-protocol. 8 (4), 2729 (2018).</li><li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+adult+Caenorhabditis+elegans+cells+reveals+tissue-specific+gene+and+isoform+expression.">Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression.</a> PLoS Biology. 14 (8), 1007559 (2018).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single-cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+and+analytical+challenges+in+single-cell+transcriptomics.">Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics.</a> Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).</li><li>St&#229;hlberg, A., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+workflow+of+single-cell+expression+profiling+using+quantitative+real-time+PCR.">The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).</li><li>Livak, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+qPCR+gene+expression+profiling+applied+to+1440+lymphoblastoid+single+cells.">Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells.</a> Methods. 59 (1), 71-79 (2013).</li><li>Fluidigm. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Time PCR Analysis User Guide. , (2018).</li><li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+digital+MIQE+guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments.">The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li><li>. U. S. National Library of Reference. Primer Blast Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/</a> (2020)</li><li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+(RT-PCR):+trends+and+problems.">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).</li><li>Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).</li><li>Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+analysis+of+real-time+PCR+data.">Statistical analysis of real-time PCR data.</a> BMC Bioinformatics. 22 (7), 85 (2006).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+RNA+Extraction+from+C.+elegans.">Total RNA Extraction from C. elegans.</a> Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).</li><li>Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-Type+Cyclin+CYL-1+and+the+Heat-Shock-Factor+HSF-1+Are+Required+for+Heat-Shock-Induced+Protein+Expression+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).</li><li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+Signals+from+Neural+HSF-1+Separate+Thermotolerance+from+Longevity.">Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity.</a> Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).</li><li>Zhang, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dbl-1+a+TGF-beta+is+essential+for+C.+elegans+aversive+olfactory+learning.">Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).</li><li>S&#248;rensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+and+Misuse+of+the+Coefficient+of+Variation+in+Organizational+Demography+Research.">The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research.</a> Sociological Methods &amp; Research. 30 (4), 475-491 (2002).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).</li><li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments.">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li><li>Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+RNA+analysis+of+individual+Caenorhabditis+elegans.">Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans.</a> MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu yazıda, Worm-to-CT protokolünün, RNA'yı tek solucanlardan veya küçük bir solucan havuzundan çıkarmak için hızlı ve verimli bir yöntem olduğu gösterilmiştir. Nanoakışkan sistemin sunduğu yüksek verim, onu bireyler arası değişkenlik ölçümlerinin ölçülmesi için ideal hale getirir. Ayrıca, bu yöntemin yüksek duyarlılığı, tek solucanlı RNA-seq teknolojileri9kullanırken algılamanın altına düşen düşük seviyelerde ifade edilen genlerin algılanmasını sağlar.
Tek solucanlardan cDNA hazırlamak için yöntem seçimini düşünürken. Ly ve ark.29, kütikül sindirimi için proteinaz K'ye dayanan bir protokolü optimize etti. Manikül, moleküllerin solucanlardan izolesi için büyük bir engeldir ve proteinaz K onu kırmak için etkili bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, proteinaz K'nin ters transkripsiyon için enzim kullanabilmesi için ısı inaktive edilmesi gerekir. Ly ve arkadaşları 96 °C'ye 10 dk maruz kalma kullanırken, RNA kolayca bozulabilir olduğu için bu protokolde bu adımdan kaçınılmıştır. Kütikülün kırılması için proteinaz K kullanmak yerine tekrarlanan donma-çözülme döngüleri kullanılmıştır. Donma-çözülme, kütikülleri kırmak için etkili bir yöntemdir, çünkü solucan başına daha fazla RNA izole edilebilir. Ly ve ark. solucan başına çıkarılan toplam RNA'nın proteinaz K kullanılarak 35 ng olduğunu bildirirken, bu protokol solucan başına 51,75 ng ± toplam RNA 6,74 SEM elde eder. Önamplifikasyon adımlarıyla birlikte ısıya maruz kalmanın önlenmesi, görünüşe göre Worm-to-CT'nin dinamik algılama aralığını standart protokollere kıyasla genişletiyor. Ly ve ark. ısı şoku sonrası hsp-70 için hsp-16.2 ve 22.8 ± 0.17 için 21.1 ± 0.15 mutlak Ct değerlerini bildirin. Aynı ısı şoku koşullarını (30 °C'de 1 saat) kullanan bu protokol, hsp-16.2 için 17.93 ± 0.57 ve hsp-70 için 21.13 ±0.33 mutlak Ct değerleri elde eder. Bu, dondurarak çözülme liziz yönteminin daha yüksek RNA verimi sağladığını ve düşük eksprese transkriptler için daha uygun olduğunu gösterir.
Nanoakışkan sistemler, belirli bir hedef transkript kümesini ve deneyin ölçeğine adaptasyona izin veren daha küçük (çok dizili çip) veya daha büyük (tek dizili çip) sayıda numunenin kullanımını araştırırken idealdir. Tek bir solucanda ifade edilen tüm transkriptlerin tarafsız bir resmini elde etmek için, bariz seçim RNA dizilimini kullanmaktır. Bununla birlikte, deneyin odak noktası daha küçük ama yine de nispeten büyük bir hedef gen kümesi ise, araştırmacının bir nanoakışkan PCR makinesine erişimi olması koşuluyla bu protokolü kullanmak daha uygun maliyetlidir. Nanoakışkan sistem reaktiflerinin ve tek dizili çipin maliyeti solucan başına yaklaşık 13 £ olarak tahmin edilirken, tek solucan dizilimi için reaktiflerin maliyetleri, sıralama maliyetleri dahil olmak üzere solucan başına yaklaşık 60 £ olacaktır.
Hangi PCR platformunun kullanılacağı düşünüldüğünde, nanoakışkan qPCR ile birleştirilen Worm-to-CT yöntemi zaman ve aktarım hızı açısından avantajlar sunar. Yaklaşık 2 günlük çalışmada 9.216 RT-qPCR sonucu elde etmek mümkündür, ancak standart bir qPCR platformu kullanarak aynı sayıda hedefin amplifikasyonu, günde dört plaka çalıştıran 96 kuyu plakası tahlilleri kullanılarak yaklaşık 5 çalışma haftası sürer. Ancak, test edilecek hedef sayısı daha küçükse, standart bir qPCR makinesiyle birlikte Worm-to-CT kullanmak daha uygun maliyetlidir. Tek dizili yongalar yeniden çalıştırılamaz, bu nedenle boş kuyuların çalıştırılması maliyet verimliliğini azaltır.
Yöntemin bir sınırlaması, çoklama adımı sırasında astar-primer dimerlerin potansiyel oluşumudur, ancak bu vakaların% 1'inden daha azında gerçekleşir. Solucandan CT'ye protokol verimli olmasına ve tek solucanlara uygulandığında güvenilir sonuçlar sağlamasına rağmen, yaklaşık% 5'lik bir arıza oranı vardır, bu da solucanın hasat adımı sırasında kapakta veya tüpün üstünde sıkışıp kaldığı durumlara karşılık gelir.
Birlikte, bu çok yönlü ve güvenilir yöntem, daha standart tekniklere kıyasla daha yüksek verim ve hassasiyet sunar. Bu yöntem, yüksek verimli ekranların doğrulanması için çok yararlı olabilir ve tek solucan gen ifade düzeylerini izlemek veya doğrulamak için mükemmel bir seçimdir. Bu yöntem, izole dokulardan gen ekspresyonunun niceliği gibi diğer zorlu tekniklere uygulanabilir. Örneğin, bağırsak, gonadlar veya CBC'ler tarafından izole edilen hücreler gibi tam dokuların izolasyonu, RNA dizileme deneyleri yapmak için yeterli malzeme sağlar. Bununla birlikte, sınırlı miktarda malzeme genellikle nadir transkriptlerin nicelliğini önleyen yinelenen okumalara yol açar. Bu senaryoda, nanoakışkan tabanlı teknolojinin kullanılması, araştırmacıların bu dokulardaki veya hücrelerdeki tüm transkriptlerin yalnızca bir alt kümesini izlemeleri gerekiyorsa, deneylere ek duyarlılık sağlamalı ve maliyet verimliliğini artırmalıdır.

Tek hücreli RNA diziliminin ve qPCR'nin optimizasyonu, transkripsiyonel darbelerin veya patlamaların hücre başına RNA moleküllerinin sayısında büyük farklılıklara yol açabileceğini ortaya koydu1. Ayrıca, bu teknolojiler daha önce standart toplu transkriptomik ölçümler tarafından kaçırılan önemli hücresel heterojenliği ortaya çıkardı. Bağlama bağlı olarak, bazı tek hücreli transkripsiyonal değişkenlik dokuların karışık hücresel bileşimden kaynaklanır. Bununla birlikte, aynı ortamda yetişen izojenik hücre popülasyonlarında bile yaygın transkripsiyonal heterojenlikvardır 2,3. Bu 'biyolojik değişkenlik', bakterilerden insana kadar hücresel ağların her yerde bulunan bir özelliği olarak giderek daha fazla tanımlanmaktadır. Bazı durumlarda, gelişim, kanser ilerlemesi, HIV gecikmesi ve kemoterapiye yanıtta fenotipik sonuçlar doğurabilir4,5.
Nematod Caenorhabditis elegans, bireyler arasındaki biyolojik değişkenliğin nedenlerini ve sonuçlarını incelemek için ideal özelliklere sahip benzersiz bir model organizmadır. Bu nematodlar 959 hücreden oluşan basit bir model organizmadır ve şeffaf lütikülleri onları in vivo görüntüleme çalışmaları için uygun hale getirir6. C. elegans, ağırlıklı olarak kendi kendini dölleme yoluyla üreyen hermafroditik bir türdür; bu izojenik laboratuvar suşları ile sonuçlandı. İzojenikliğe ve kontrollü kültür koşullarına rağmen, birçok fenotip ve transkript bireyler arasında değişkendir, bu da stokastik veya mikroçevronmental farklılıkların bireyler arasında heterojenliğe katkıda bulunduğunu göstermektedir7,8. Gen ekspresyonunda bu tür değişkenlik, mutasyonların penetrancesinde değişkenlik, sağkalım, gelişimsel zamanlama ve doğurganlık 7,8 ,9dahil olmak üzere birden fazla fitness sonucuna sahiptir. Bu özellikler nedeniyle, tek solucan çalışmaları tüm bir organizmada biyolojik değişkenliği incelemek için eşi görülmemiş bir fırsat sağlar.
Transkriptlerin tek solucan düzeyinde doğru tespiti için teknolojilerin geliştirilmesi ve optimize edilmesi için sahada temel bir ihtiyaç vardır. Tek solucanlı RNA dizilimi10,izole dokulardan RNA dizilimi11ve tek hücreli sıralama12 gibi yeni teknolojiler artık C. elegansiçin kullanılabilir. Bununla birlikte, ana bir zorluk devam etmektedir: interindividuality izlerken, zayıf ifade edilen genler genellikle tespit edilebilir seviyelerin altına düşer13. Bu, özellikle küçük miktarlardaki başlangıç malzemesinden izole edilmiş nadir transkriptler için geçerlidir, çünkü ortalama ifade ve teknik varyans arasında köklü, ters bir ilişki vardır ve genellikle nadir transkriptlerin istatistiksel kesintilerin altına düşmesine neden olur13. Yüksek verimli çok katlı qPCR teknolojilerinin optimizasyonu, özellikle nadir transkriptlerin ekspresyonunu incelerken memeli tek hücreli çalışmalar için yararlı olduğu kanıtlanmıştır14,15. Bu teknoloji, diğer tek solucan teknolojilerinin kıyaslama ve doğrulama amaçları için de kullanılabilir.
Solucandan BT'ye, hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılan bir kitten, tek solucanlı cDNA hazırlama için uyarlanmış hızlı ve sağlam bir yöntemdir. Bu yöntemle elde edilen cDNA, çok katlı nanoakışkan qPCR teknolojisi ile birleştiğinde, daha yüksek deneysel aktarım hızı, daha geniş bir dinamik algılama aralığı sağladığı ve tek hücreli amaçlar için doğrulandığı için seçilmiştir14,15. Açıklanan cDNA hazırlığı standart PCR teknolojileriyle kullanım için de geçerlidir. Verim iki şekilde artırılır: İlk olarak, cDNA hazırlığı geleneksel guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyondan daha hızlı ve daha güvenilirdir, çünkü solucanlar doğrudan lizis tamponuna eklenir ve kolayca bozulabilir RNA'nın doğrudan izolasyonunu atlar. İkincisi, nanoakışkan teknolojilerin kullanılması, aynı anda çalıştırılabilen numune ve hedef sayısını önemli ölçüde artırır. Bu makalede, iki yonga karşılaştırılmıştır: tek dizili bir çip ve çok dizili bir çip. Tek dizili bir çip, 96 tek solucan ve 96 astar seti çalıştırabilir ve bu da deney başına 9.216 reaksiyona neden olur. Standart qPCR teknolojilerini kullanarak benzer bir aktarım hızı elde etmek için 96 kuyu plakası kullanarak 96 ayrı qPCR denemesi gerekir. Daha küçük ve daha esnek çok dizili yonga, 864 reaksiyonla sonuçlanan altı 12 x 12 diziden oluşur. Yöntemin üstün güvenilirliği ve duyarlılığı nanoakışkan teknoloji ve bir önamplifikasyon adımının devreye girmesiyle artırılmıştır. Bu makalede sunulan yöntem, biyolojik varyansı çıkarmak için son teknoloji istatistiksel algoritma ile birlikte kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Bu makalede, hem tek solucan hem de toplu solucan örnekleri için hızlı cDNA hazırlama ve yüksek verimli qPCR protokolü sunulmaktadır; algoritma başka bir yerde yayınlanacaktır. Bu protokol için, her çipin organizasyonu deneyden önce hazırlanmalıdır. Tablo 1 ve Tablo 2, sırasıyla çok dizili ve tek dizili yonga için bu planların örneklerini gösterir. Şekil 1'de ayrıntılı olarak açıklanan ve Şekil 2'deçok dizili ve tek dizili yongaları çalıştıran Solucandan CT'ye protokolüne genel bakışlar da vardır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100&#181;M stock primers for genes of interest.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X DNA Binding Dye</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7609</td>
			<td>for 96.96 chip (Single-Array Chip)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Assay Loading Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-strip PCR tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ice block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96.96 Dynamic Array IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>BMK-M-96.96</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;Single-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well sealing tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark &#38; EP1 Software</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>101-6793</td>
			<td>Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMark or BioMark HD system</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2451 K1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics thermocycler&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>89000021</td>
			<td>Referenced throughout manuscript as &#34;control line fluid&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Suspension buffer</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>domed PCR caps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0293L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I reaction buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix DELTAgene Sample Reagent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-7673</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;sample reagent&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEXsix Gene Expression IFC</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6308</td>
			<td>referenced throughout manuscript as &#34;Multi-Array Chip&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000088</td>
			<td>This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controller MX</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>68000112 I1</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as &#34;nanofluidics PCR priming machine&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFC Controllers SOFTWEAR</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-2297</td>
			<td>Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen in dewar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>C1301B-230V</td>
			<td>Used to spin down PCR tube strips in the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate spinner</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>K4050725</td>
			<td>mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as &#34;tabletop plate spinner&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green Cells-to-Ct kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>4402955</td>
			<td>This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20&#176;C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR&#174;Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreAmp Master Mix</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-5580, 100-5581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription Master Mix&#8212;480 reactions</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>100-6299</td>
			<td>One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Free water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>172-5211</td>
			<td>referenced throughout the manuscript as &#34;fluorescent probe supermix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 96 and 384-well Thermal Cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>T0224</td>
			<td>Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000031</td>
			<td>Referenced throughout the text as &#34;thermal mixer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referenced through the protocol as &#34;guanidium thiocyanate-phenol-chloroform&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warm water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative rt-pcr in single and bulk c. elegans samples using nanofluidic technology

Bu makale, caenorhabditis elegans için hızlı, sağlam ve son derece hassas olan yüksek verimli ters transkripsiyon nicel PCR (RT-qPCR) testini sürmektedir. Bu protokol, tek solucanlardan veya toplu örneklerden gen ekspresyonunun hassas ölçümlerini elde eder. Burada sunulan protokol, nanoakışkan rt-qPCR platformuna bağlı olarak tamamlayıcı DNA (cDNA) hazırlama için mevcut yöntemlerin yeni bir uyarlamasını sağlar. 'Worm-to-CT' adı verilen bu protokolün ilk bölümü, önceden mRNA izolasyonu gerek kalmadan doğrudan nematodlardan cDNA üretimine izin verir. 3,5 saat içinde 96 solucandan cDNA hazırlanmasına izin vererek deneysel verimi arttırır. Protokolün ikinci bölümü, cDNA'da yüksek verimli RT-qPCR çalıştırmak için mevcut nanoakışkan teknolojiyi kullanır. Bu makale iki farklı nanoakışkan çipi değerlendirir: ilki 96 örnek ve 96 hedef çalıştırır ve yaklaşık 1,5 günlük tezgah çalışmasında 9.216 reaksiyonla sonuçlanır. İkinci yonga türü altı 12 x 12 diziden oluşur ve 864 reaksiyonla sonuçlanır. Burada, Worm-to-CT yöntemi, tek solucanlardan ve toplu örneklerden ısı şok proteinlerini kodlayan genlerin mRNA seviyelerinin ölçülmesi ile gösterilmiştir. Sağlanan, C. elegans genomunda kodlanan genlerin çoğu için işlenmiş RNA'yı güçlendirmek için tasarlanmış astarların geniş bir listesidir.

Worm-to-CT'nin cDNA hazırlama yöntemi olarak doğrulanması
Worm-to-CT protokolünün geçerli bir cDNA ekstraksiyon yöntemi olup olmadığını test etmek için standart guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemleri ile karşılaştırıldı. Sonuçlar, cDNA'nın standart guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyon teknikleri22 kullanılarak ortalama ~1.000 solucandan ve Solucandan CT'ye yöntemi kullanılarak 30 solucandan hazırlandığı Şekil3'te gösterilmiştir. Numuneler aynı anda ısı şokuna uğradı (34 °C'de 30 dk). Küresel olarak, toplam RNA'nın 100 ng'si başına hsp-70 mRNA ifade düzeyleri her iki yöntem kullanılarak karşılaştırılabilirdi. Bununla birlikte, en yüksek hsp-70 ekspresyozunda (yani ısı şokunun ardından N2'de) Worm-to-CT yöntemi ile ekspresyon seviyeleri daha yüksekti ve bu da hassasiyetin arttığını gösteriyordu.
Hsf-1(sy441)23'te hsp ifadesinde beklenen bir azalma olup olmadığını belirlemek için, moleküler refakatçilerin 23,24'ün ana transkripsiyonel regülatöründeki bir mutasyon çoğaltılabilir, kısa bir ısı şokunu takiben transkripsiyonel refakatçi indüksiyonu karşılaştırıldı. Her iki yöntemde de hsf-1(sy441) hayvanlarında hsp-70 indüksiyonunda azalma tespit edildi. Bu bekleniyordu, çünkü mutant hsf-1 (sy441) hayvanları, HSF-1'in transaktivasyon etki alanındaki bir kesilme nedeniyle refakatçileri teşvik etme yeteneğinin azaldığını gösteriyor. Guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu için hsp70, kontrollere göre %82,7, solucandan CT'ye ise vahşi tip hayvanlara göre %92,3 azaldı (Şekil 3). Sonuçlar her iki yöntem arasında karşılaştırılabilir ve önceki raporlarda karşılaştırılabilir23. Bu sonuçlar Worm-to-CT yönteminin standart cDNA sentez tekniklerine geçerli bir alternatif olduğunu göstermektedir.
mRNA hedeflerini güçlendirmek için kullanılan nanoakışkan PCR platformunun doğrulanması
Transkript amplifikasyonu için nanoakışik qPCR kullanarak sonuçların tutarlılığını test etmek için, Worm-to-CT bulk yönteminden elde edilen PCR sonuçları hem standart bir qPCR sisteminde(Malzeme Tablosu)hem de çok dizili bir çip kullanan nanoakışkan bir qPCR sisteminde karşılaştırıldı. DBL-1 (dbl-1(nk3) ) 25'te boş bir alele taşıyan hayvanlarda, vahşi tip benzerlerine kıyasla sma-3 ( Şekil 4A ), sma-10 (Şekil 4B) ve dnj-26 olmak üzere üç farklıgeninifadesindeki kat değişimi izlendi. Dbl-1, Kemik Morfogenetik Protein (BMP) sinyal yolunun tek ligandını kodlar. sma-3 ve sma-10, BMP sinyal basamaklamanın temel bileşenleri olan SMAD ortologlarını kodlayan genlerdir. Dnj-26, BMP sinyalinin hedefi olan moleküler bir refakatçiyi kodlar. Bu sonuçlar, iki yöntemin sonuçlarını karşılaştıran kat değişiminde çok az fark gösterir ve sırasıyla sma-3 , sma-10 ve dnj-26 için 0.3113, 0.2635ve 0.3481'deönemli P değerlerine neden olmaz. Tamamen, bu sonuçlar toplu örneklere uygulanan Worm-to-CT yönteminin birkaç solucandan RNA çıkarmanın etkili ve hızlı bir yolu olduğunu ve standart PCR sistemleri veya yüksek verimli nanoakışkan tabanlı qPCR platformları ile birleştiğinde güvenilir veriler sağladığını göstermektedir.
Toplu numunelerle elde edilen ifade düzeyleri ile tek solucanlardan elde edilen ortalamalar arasında karşılaştırma
Göreli ifade düzeyleri, toplu örneklerden (25 solucan) veya ortalama 36 tek solucan örneğinden elde edilen cDNA kullanılarak hesaplanmıştır (Şekil 5). Her iki CDNA da Worm-to-CT yöntemi kullanılarak elde edildi ve nanoakışkanlar PCR teknolojisi kullanılarak güçlendirildi. Şekil 5A–C'de gözlemlendiği gibi, test edilen tüm refakatçiler için (örneğin, hsp16.1, F44E5.4, hsp-70),yöntemler karşılaştırılabilir ifade düzeylerini algıladı. Bu sonuçlar, tek solucanlardan elde edilen parametrelerin güvenilir olduğunu göstermektedir.
Tek solucan gen ekspresyon parametrelerini tahmin etmek için nanoakışkanlar teknolojisine bağlı Worm-to-CT uygulaması
Tek dizili çip, 96 ayrı örnekte 96'ya kadar hedef transkriptin izlenmesine izin verdiğinden, bu nedenle tek solucanlar arasındaki transkript ifadesinde bireysel değişkenliği izlemek için uygundur. Şekil 6A, kısa bir ısı şokunun ardından tek solucanlardan birden fazla hsp transkriptinin ortalama ifadesini gösteren temsili bir sonuç sunar. Şekilde gözlendiği gibi, transkriptlerin ifadesindeki değişkenlik farklı genler arasında önemli ölçüde farklılık gösterdi (Şekil 6A). Daha fazla içgörü elde etmek için, standart sapmanın ifade düzeylerinin ortalaması26 (Şekil 6B)ile bölünmesiyle varyasyon katsayısı (CV) hesaplanmıştır. CV değerleri daha önce alternatif yöntemlerle tahmin edilen üç gen izlendi (yayınlanmamış veriler). İki kararlı transkript (ife-1 ve Y45F10D.4) ve bir değişken (nlp-2927) beklenen değişkenliklerini gösterdi. Grafik ayrıca değişkenlik değerleri ile ifade düzeyleri26 (Şekil 6B) arasındaki iyi bilinen ters ilişkiyi de açıkça göstermektedir.
Toplu numuneler kullanırken tekrarlanabilirliği sağlamak için teknik çoğaltmalar çok önemlidir. Ancak, bu mutlaka tek hücreli deneyler için durum değildir14,15,28. Tek solucan örnekleri kullanılırken parametre tahmini için teknik çoğaltmaların kullanılmasının gerekli olup olmadığını belirlemek için, kısa bir ısı şokundan sonra 28 ayrı solucan hasat edildi ve teknik triplicates kullanılarak işlendi. Üç ayda bir elde edilen tek solucan verilerinden hesaplanan CV değerleri (Şekil 7'dekimavi noktalar , teknik CV) ile bireysel solucanlardan elde edilen her transkript için hesaplananlar (Şekil 7'dekikırmızı noktalar , biyolojik değişkenlik) karşılaştırıldı. Test edilen her transkript için, teknik CV'ler biyolojik CV'lerden daha düşüktü, bu da parametre tahmini için teknik triplikatların gerekli olmadığını gösteriyordu. Teknik çoğaltmaların gerekli olmaması, kaliteden ödün vermeden deneyin verimini artırır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig01.jpg"> Şekil 1: Solucandan CT'ye İletişim Kuralına Genel Bakış. Bu şekilde, solucanları Solucandan CT'ye iletişim kuralı aracılığıyla çalıştırmak için gereken farklı adımlara kısa bir genel bakış gösterilmiştir. Ters transkripsiyon adımı için iki isteğe bağlı yöntem gösterilir; bunlar her iki yonga türü için de değiştirilebilir yöntemlerdir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig02.jpg"> Şekil 2: Nanoakışkan qPCR'nin hazırlanmasına ve çalıştırıcısına genel bakış. Bu şekil, nanoakışkan qPCR sistemini çok dizili bir çip ve tek dizili bir çip kullanarak çalıştırma hazırlıklarını tasvir eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig03.jpg"> Şekil 3: Toplu numunelerde solucandan CT'ye protokol güvenilir sonuçlar sağladı. Worm-to-CT protokolünün, dökme numunelerde düzenli guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu22 ile karşılaştırılması. Önceki bulgularla tutarlı olarak, hsf-1(sy441) mutantlarda23, ısı şokuna yanıt olarak hsp transkriptlerinin seviyeleri azaldı. Yukarıdaki histogramlar, 34 °C'de 30 dakikalık kısa bir ısı şokunun yokluğunda (-) veya ardından (+) hsp-70'in indüksiyonunu tasvir eder. CDNA, 1.000 solucana (solda) uygulanan guanidium tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu veya 30 havuzlu solucana uygulanan Worm-to-CT yöntemi kullanılarak elde edildi (sağda). Her yöntemle elde edilen toplam RNA'nın 100 ng'si başına hsp-70 ifade düzeyleri karşılaştırıldı. Beklendiği gibi, hsf-1'de (sy441) ısı şokuna yanıt olarak hsp-70'in transkripsiyonel indüksiyonu guanidiyum tiyosiyanat-fenol-kloroform kullanılarak % 82.7 ve Worm-to-CT yöntemi kullanılarak% 92.3 azaldı. Hedef genlerden elde edilen mRNA seviyeleri, cdc-42, pmp-3ve ire-1olmak üzere üç temizlik geninin ortalamasına göre normalleştirildi. Her nokta biyolojik bir kopyayı temsil eder. Veriler, parametrik analiz için gerekli kuralları karşılamadığı için istatistiksel analiz için günlüğe dönüştürüldü. İstatistiksel analiz, Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi kullanılarak RM-One-way ANOVA kullanılarak yapıldı. Vahşi tür = N2, hsf-1 = hsf-1(sy441). Çubuklar ortalamanın standart hatasını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig04.jpg"> Şekil 4: İfade desenleri standart qPCR ve nanoakışkan qPCR sistemleri arasında tutarlıydı. (A) Sma-3 (A), sma-10 (B) veya dnj-26 (C) mRNA'nın ekspresyon seviyesi, Worm-to CT aracılığıyla vahşi tip suşu (N2) ve dbl-1(nk3) nakavt suşu25'tenoluşturulan üç biyolojik cDNA çoğaltmasından normal qPCR ve nanoakışik qPCR (çok dizili çip) ile belirlendi. Delta-Ct yöntemi21kullanılarak her suş için göreli mRNA ekspresyon düzeyleri belirlenmiştir. Kat değişimi daha sonra dbl-1(nk3) solucanlarında elde edilen ekspresyon seviyelerinin N2 suşundaki karşılık gelen mRNA seviyelerine bölünmesiyle belirlendi. Panel A'da gösterildiği gibi, desenler her bir biyolojik yinelemedeki her iki yöntem için de tutarlıydı. (B) ve (C) sırasıyla sma-10 ve dnj-26 mRNA düzeyleri için (A) ile aynıdır. Hedef mRNA seviyeleri cdc-42 ve pmp-3temizlik genlerine karşı normalleştirildi. Her gen için istatistiksel analiz, standart qPCR ile üretilen üç biyolojik kopyanın ve nanoakışkan qPCR ile üretilenlerin sonuçlarını karşılaştıran eşleştirilmiş bir t testi kullanılarak hesaplanmıştır. Bu karşılaştırmaların P değerleri sırasıyla sma-3 , sma-10 ve dnj-26 için 0.3113, 0.2635ve 0.3481'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig5v2.jpg"> Şekil 5: Toplu numunelerde veya tek solucanlarda Worm-to-CT yönteminin kullanılması, solucan başına normalleştirildiğinde benzer ifade düzeyleri sağlamıştır. (A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4 ve (C) hsp-70 (C12C8.1) ifade düzeyleri, ısı şoku yokluğunda genç yetişkin hayvanlarda ya 25 hayvanda Worm-to-CT yaparak veya 36 tek bireyde analiz edildi. Veriler solucan başına normalleştirildiğinde, her iki yöntem kullanılarak her transkript için solucan başına elde edilen düzeyler arasında önemli bir fark yoktu. Hedef genlerden elde edilen mRNA seviyeleri cdc-42, pmp-3ve ire-1olmak üzere üç temizlik geninin ortalamasına göre normalleştirildi. Çubuklar ortalamanın standart hatasını temsil eder. İstatistikler = eşleştirilmiş t testi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig5v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig06.jpg"> Şekil 6: Worm-to-CT yöntemini kullanan tek solucanlarda yüksek verimli RT-qPCR, gen ekspresyonunda bireyler arası değişkenliği izleyebilir. (A) Kısa bir ısı şokuna maruz kalınca elde edilen 53 transkript için ortalama ifade seviyeleri (34 °C'de 30 dk). Boxplots, ortalama mRNA ekspresyonunun tek tek solucanlardan dağılımını temsil eder (bireysel solucan başına ortalama üç teknik çoğaltma kullanılmıştır). Noktalar, 28 ayrı solucandaki ifade düzeylerini temsil eder. Hedef genlerden elde edilen mRNA seviyeleri cdc-42, pmp-3ve ire-1olmak üzere üç temizlik geninin ortalamasına göre normalleştirildi. (B) Kısa bir ısı şokuna maruz kaldıktan sonra 53 transkript için ortalama mRNA ekspresyonunun bir fonksiyonu olarak varyasyon26 (CV) katsayısı 28 ayrı hayvandan hesaplanmıştır (Bpanelinde gösterilen ham veriler). Transkript kümesi, nlp-29 transkript27 değişkenini ve iki kararlı transkripti(ife-1 ve Y45F10D.4; yayınlanmamış verileri) içerir. CV, standart sapmanın ortalamaya oranıdır. Bu CV, bireysel solucanlar arasındaki transkript ifadesindeki bireyler arası değişkenliği tahmin etmek için kullanılmıştır. Beklendiği gibi, bireyler arası değişkenlik, azalan ortalama ifade düzeyleriyle ölçeklendirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61132/61132fig07.jpg"> Şekil 7: Nanoakışkan çip kullanılarak gen ifadesindeki bireyler arası değişkenlik analiz edildiğinde teknik çoğaltmalara gerek yoktu. Bu grafikte sunulan veriler, kısa bir ısı şoku (34 °C'de 30 dk) sonrasında 28 ayrı solucanda elde edilmiştir. Her kırmızı nokta, 28 ayrı solucan (bio CV) arasında test edilen bir transkript için ortalama transkript ifade seviyelerinin değişim katsayısını (CV) temsil eder. Her mavi nokta, test edilen transkript başına (teknik CV) tek bir solucandan elde edilen üç teknik çoğaltma arasındaki ifade düzeylerinin CV'sini temsil eder. Bu grafik, teknik değişkenliğin (teknik yinelemeler arasında) biyolojik değişkenlikten çok daha düşük olduğunu göstermektedir (bireysel solucanlar arasında), tek hücreli çalışmalara benzer şekilde, tek solucanlarda gen ekspresyonlarını test ederken nanoakışkan gen ekspresyon dizisinde teknik çoğaltmaların yapılması gerektiğini düşündürmektedir14,15,28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61132/61132fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Çok dizili bir yonga için plan düzeni. Yukarıdaki tabloda, çok dizili yonga çalıştırması planlarken kullanılabilecek basit bir düzen gösterilmiştir. Solda ilgi çekici astar hedefleri ile doldurulması gereken alanlar, sağda ise ilgi örnekleri ile doldurulması gereken boşluklar bulunmaktadır. Her test ve örnek dizi çip üzerinden sayı açısından eşleştirilir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 2: Tek dizili yonga için plan düzeni. Yukarıdaki tabloda, tek dizili yonga çalıştırması planlarken kullanılabilecek basit bir düzen gösterilmiştir. Solda ilgi çekici astar hedefleri ile doldurulması gereken boşluklar, sağda ise ilgi örnekleri ile doldurulması gereken boşluklar bulunmaktadır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_2.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 3: Bu çalışmada kullanılan RT-qPCR primerlerinin listesi. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_3.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Tablo 1: RT-qPCR primer veritabanından primerler. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61132/Table_S1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology at JoVE.com

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

Bu makalede, tek veya toplu C. elegans örneklerinde gen ekspresyon seviyelerinin hızlı ve güvenilir bir şekilde belirlenmesi için yüksek aktarım hızı protokolü açıklanmıştır. Bu protokol RNA yalıtımı gerektirmez ve doğrudan örneklerden cDNA üretir. Yüksek verimli çok katlı nanoakışkan gerçek zamanlı qPCR platformları ile birlikte kullanılabilir.

Nanoakışkan Teknoloji Kullanarak Tek ve Toplu C. elegans Örneklerinde Yüksek Verimli Nicel RT-PCR

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

high-throughput-quantitative-rt-pcr-single-bulk-c-elegans-samples

Research

JoVE Journal

Genetics

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

7.7K Görüntüleme.  Babraham Institute. Bu makalede, tek veya toplu C. elegans örneklerinde gen ekspresyon seviyelerinin hızlı ve güvenilir bir şekilde belirlenmesi için yüksek aktarım hızı protokolü açıklanmıştır. Bu protokol RNA yalıtımı gerektirmez ve doğrudan örneklerden cDNA üretir. Yüksek verimli çok katlı nanoakışkan gerçek zamanlı qPCR platformları ile birlikte kullanılabilir.

Video: High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Genetik

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on animal physiology and behavior. Recently, we showed that modulation of longevity in the nematode Caenorhabditis elegans by food abundance is more complex than previously recognized. The responsiveness of the lifespan to changes in food level is determined by specific genes that act by controlling information processing within a neural circuit. Our framework combines genetic analysis, high-throughput quantitative imaging and information theory. Here, we describe how these techniques can be used to characterize any gene that has a physiological relevance to broad-range dietary restriction. Specifically, this workflow is designed to reveal how a gene of interest regulates lifespan under broad-range dietary restriction; then to establish how the expression of the gene varies with food level; and finally, to provide an unbiased quantification of the amount of information conveyed by gene expression about food abundance in the environment. When several genes are examined simultaneously under the context of a neural circuit, this workflow can uncover the coding strategy employed by the circuit.

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Here, we present a framework to relate broad-range dietary restriction to gene expression and lifespan. We describe protocols for broad-range dietary restriction and for quantitative imaging of gene expression under this paradigm. We further outline computational analyses to reveal underlying information processing features of the genetic circuits involved in food-sensing.

C. elegans gen ifade seviyeleri sırasında ömrü modülasyon altında geniş menzilli diyet kısıtlama tarafından kodlanmış bilginin bir miktar

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

Sinerjik uyuşturucu kombinasyonları örtüşme2 yöntemi tarafından yüksek üretilen iş tanımlaması

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been co-opted as a powerful tool for precise eukaryotic genome engineering. Here, we present a rapid and simple method using chimeric single guide RNAs (sgRNA) and CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for the efficient and precise generation of genomic point mutations in C. elegans. We describe a pipeline for sgRNA target selection, homology-directed repair (HDR) template design, CRISPR-Cas9-RNP complexing and delivery, and a genotyping strategy that enables the robust and rapid identification of correctly edited animals. Our approach not only permits the facile generation and identification of desired genomic point mutant animals, but also facilitates the detection of other complex indel alleles in approximately 4 - 5 days with high efficiency and a reduced screening workload.

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Here, we present a method to engineer the genome of C. elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and homology dependent repair templates.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

Akustik Nanodispensing teknolojisini kullanarak yüksek verim DNA Plasmid multiplexing ve transfeksiyon

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring fitness phenotypes and improving our understanding of how genotypes are shaped by selection. Extensive recent efforts to develop and apply niche continuous culture devices have revealed the benefits of conducting new forms of cell culture control. This includes defining custom selection pressures and increasing throughput for studies ranging from long-term experimental evolution to genome-wide library selections and synthetic gene circuit characterization. The eVOLVER platform was recently developed to meet this growing demand: a continuous culture platform with a high degree of scalability, flexibility, and automation. eVOLVER provides a single standardizing platform that can be (re)-configured and scaled with minimal effort to perform many different types of high-throughput or multi-dimensional growth selection experiments. Here, a protocol is presented to provide users of the eVOLVER framework a description for configuring the system to conduct a custom, large-scale continuous growth experiment. Specifically, the protocol guides users on how to program the system to multiplex two selection pressures &#8212; temperature and osmolarity &#8212; across many eVOLVER vials in order to quantify fitness landscapes of Saccharomyces cerevisiae mutants at fine resolution. We show how the device can be configured both programmatically, through its open-source web-based software, and physically, by arranging fluidic and hardware layouts. The process of physically setting up the device, programming the culture routine, monitoring and interacting with the experiment in real-time over the internet, sampling vials for subsequent offline analysis, and post experiment data analysis are detailed. This should serve as a starting point for researchers across diverse disciplines to apply eVOLVER in the design of their own complex and high-throughput cell growth experiments to study and manipulate biological systems.

The eVOLVER framework enables high-throughput continuous microbial culture with high resolution and dynamic control over experimental parameters. This protocol demonstrates how to apply the system to conduct a complex fitness experiment, guiding users on programming automated control over many individual cultures, measuring, collecting, and interacting with experimental data in real-time.

EVOLVER kullanarak otomatik, yüksek verimlilik, sürekli hücre büyüme denemeleri tasarlama

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...