Bu protokol, kullanıcıların bağışıklık sisteminin patojenlere veya kommensal mikroplara karşı nasıl antikor ürettiğini incelemelerini sağlar. Ek olarak, immünoglobulin gen çeşitlendirmeyi düzenleyen moleküler yollar genetik olarak tasarlanmış fareler kullanılarak incelenebilir. Protokol, PCR ve Sanger dizilemesi de dahil olmak üzere yaygın moleküler biyoloji tekniklerinin bir kombinasyonunu kullanır ve tek hücre sıralama veya derin sıralama gerektirmez.
Peyer Yamaları çevredeki yağ dokusu ile kolayca karıştırılabilir. Bu nedenle, bu yöntemin görsel gösterimi, bu organa aşina olmayanların yerini belirlemelerine ve diseksiyonunu gözlemlemelerine yardımcı olabilir. Fareyi karın açıktayken diseksiyon pedi üzerine koyarak başlayın.
Diseksiyon alanını sterilize etmek için herhangi bir kesi yapmadan önce farenin gövdesini% 70 etanol ile cömertçe püskürtün. Karın boyunca cilde bir kesi yapın ve kesiğin her iki tarafına aynı anda parmaklar veya forsepslerle çekin. Daha sonra iç organları açığa çıkarmak için periton boşluğunu makasla kesin.
İnce bağırsağı bulun ve midenin altında ve cecum'un üstünde keserek çıkarın. İnce bağırsağın kıvrımlarını birbirine bağlayan bağ dokusunu ve yağı çıkarın. İnce bir yarı saydam epitel hücrelerinin altında beyaz görünen küçük oval şekilli yapılar olan Peyer Yamaları için ince bağırsağın dış yüzeyini inceleyin.
Tüm görünür Peyer Yamalarını makasla dikkatlice çıkarın ve buz üzerinde bir mililitre FACS tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne toplayın. Toplanan doku tüpün dibine batarsa, aslında yağ dokusu değil, Peyer'in yamasıdır. Bir mililitre soğuk FACS tamponu ile altı kuyu kabına 40 mikro metre filtre yerleştirin, ardından Peyer'in Yamalarını 1,5 mililitrelik tüpten filtreye dökün.
Sadece bağ dokusu kalana kadar Filtredeki Peyer Yamalarını ezmek için bir mililitre şırıngamdan pistonun düz ucunun haşere olarak kullanılmasını kullanın. Hücreleri altı kuyu kabına bırakmak için filtreyi ve pistonu bir mililitre soğuk FACS tamponu ile yıkayın. Hücreleri toplayın ve 40 mikrometre süzgeç kapağı FACS tüpünden filtreleyin.
Daha sonra süzgeç kapağını bir mililitre soğuk FACS tamponu ile yıkayın. Hücreleri beş dakika boyunca dört santigrat derecede 600G'de santrifüj ederek peletleyin. Daha sonra süpernatantı dekante edin ve hücreleri FC bloğu ile 0,4 mililitre soğuk FACS tamponunda yeniden depolar.
Örnekleri 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın, sonra hücreleri yıkayın ve peletleyin. Germinal center B hücrelerini veya GCBC'leri boyamak için vahşi tip hücreleri 80 mikrolitre FACS arabelleğine yeniden biriktirin. Her boyama kontrolü için Peyer's Patches vahşi tipinden 10 mikrolitre hücre çıkarın.
Deneysel örnekler için hücre süspansiyonunun 40 mikrolitresini bırakıyor. Alternatif olarak, boyama kontrolleri için kompanzasyon boncukları kullanın. Deneysel örneklerin her birini 500 mikrolitre soğuk FACS tamponunda 2,5 mikrolitre PNA Biotin ile buzda 15 dakika lekeleyin.
Daha sonra PNA leke hücrelerini yıkayın. Her numuneyi karanlıkta ve buzda 15 dakika boyunca 500 mikrolitre GCBC kokteyli ile lekeleyin, böylece hücrelerin kokteylde tamamen yeniden diriltildiklerinden emin olun. Kompanzasyon matrisi için tek leke kontrollerini hazırlamak için, metinde belirtilen seyreltmeyi kullanarak hücreleri 500 mikrolitre soğuk FACS tamponunda lekeleyin.
Lekeleme kontrollerini 15 dakika boyunca buz üzerinde karanlıkta kuluçkaya yatırın. Tüm leke örneklerini ve kontrollerini yıkamak için iki mililitre soğuk FACS tamponu ekleyin. Hücreleri peletle ve hücreleri sitometrede çalıştırmak için 500 mikrolitre soğuk FACS tamponunun son hacminde yeniden canlandırmadan önce süpernatantı atın.
Ardından, her lekeli deneysel örnekten B220 pozitif PNA yüksek hücrelerini toplamak için bir hücre sıralayıcısı kullanın. DNA'yı Germinal merkezi B hücrelerinden veya GCB'lerden çıkarmak için, hücreleri 500 mikrolitre DNA ekstraksiyon tamponunda ve beş mikrolitre Proteinaz K.'de yeniden biriktirin. Ve tüpü 5-6 kez ters çevirerek iyice karıştırın.
Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırdıktan sonra, 21, 000G ve 25 santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatant atın ve DNA peletini% 70 etanol mililitresi ile yıkayın. DNA'yı 21.000G'de 10 dakika santrifüjleyin, ardından etanolleri çıkarın ve peletin havayla beş ila 10 dakika kurutun.
DNA'yı 30 mikrolitre TE arabelleğine yeniden koyun ve 56 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya bırakın. JH4 Intron için iç içe PCR gerçekleştirin. İlk PCR'de kullanılan toplam genomik DNA miktarının en az konsantre numuneye normalleştirilmesi.
PCR ürünlerini bir jel üzerinde çalıştırdıktan sonra, amplicon'u excise edin ve jel çıkarma kiti ile arındırın. Daha sonra amplicon'ı bir plazmid haline sokun ve iki mikrolitre ligasyon reaksiyonu ile elektro yetkin bakteri hücrelerini dönüştürün. Hücreleri 1,65 kilovolt'ta elektroporatlayın ve 225 RPM'de titreyen bir inkübatörde 37 santigrat derecede bir saat boyunca 600 mikrolitre SOC ortamında kurtarın.
Dönüştürülen bakterilerin 100 mikrolitresini ampisilinle desteklenmiş LB agar plakalarına koyun ve plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bakteri kolonilerinden plazma DNA'sını sıralayın ve clustal Omega yazılımı kullanarak her PCR için elde edilen dizileri JH4 Intron referans dizisiyle hizalayın. Referans dizisinden farklılıkları mutasyon olarak tanımlayın.
Germinal merkez B hücreleri, B220 reseptörünün ekspresyolü ve Peanut aglutinin bağlanması ile tanımlanmıştır. Vahşi tip Peyer'in yamaları fare başına ortalama 4 milyon hücre içeriyordu. Ve hücrelerin yaklaşık% 8'i B220 pozitif PNA yüksekliğindeydi, bu da AID nakavt farelerinde gözlenenin yarısıdır.
Vahşi tip Germinal merkez B hücrelerinden elde edilen 105 benzersiz diziden toplam 226 mutasyon bulundu. Mutasyon spektrumunun analizi, baz çifti başına negatif üçüncü mutasyonlara dört çarpı 10 oranında bir dizi geçiş ve trans versiyon gösterdi. 113 AID nakavt sekansında sadece iki mutasyon tespit edildi.
Ek olarak, vahşi tip Germinal merkez B hücrelerinden elde edilen her JH4 PCR ürünü, bir dizide sıklıkla bulunan birden fazla mutasyona sahip bir ila 25 mutasyon içeriyordu. Bu protokolü denerken, hücre canlılığını korumak için hücreleri buzda tutmayı unutmayın. Hücreleri lekeledikten sonra, floroforların fotobleaching önlemek için hücreleri karanlıkta tutun.
Somatik hipermütasyonu antikor benzeşimi olgunlaşması ile ilişkilendirmek için, bir bağışıklama protokolü kullanmanızı ve antijene özgü antikor titreleri ve V bölgesi mutasyonları için test etmenizi öneririz.
