Bu araştırma, Ulusal Savunma Tıp Koleji'nden ve Japonya Sağlık, Çalışma ve Refah Bakanlığı'nın inatçı hastalıklarla ilgili araştırmalar için sağlık ve çalışma bilimleri araştırma hibesi ile desteklendi.

Deneysel protokol, Ulusal Savunma Tıp Koleji Hayvan Araştırma Komitesi (no. 16058) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar standart laboratuvar yemeklerinde (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japonya) muhafaza edildi. Laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygun olarak tedavi edildi.
1. Lenfositlerin toplanması ve ayrılması
NOT: Lenfositler taze olması ve depolanamaması gerektiğinden, her deney için sıçanlardan toplanmalıdır. Ek olarak, bağırsak-tropik lenfositler doğrudan dolaştıkları torasik kanaldan toplanmalıdır. Tüm prosedürlerin 6 saat içinde tamamlanması beklenir ve tüm aletler, eldivenler ve yüzeyler temizdir. Hayvanları fizyolojik olarak stabil bir durumda tutmak için, deneyde kullanılan tüm tuzlu su ve diğer sıvılar sıcak tutulmalıdır.
<ol><li>Sıcak suya (yaklaşık 80-90 °C) batırdıktan sonra heparin eğrisi (yaklaşık 5 mm yarıçapı) gibi bir kavis tüpü (1 mm çapında) oluşturur ve birkaç saat önceden yapışkan bant kullanarak plastik bir tahtaya sabitleyin.</li>
	<li>Midazolam (2mg/kg), Domitor (0.15mg/kg) ve Betulphar (2.5mg/kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile erkek bir Wistar sıçanını (8-12 hafta) uyuşturun ve bir saç kesme makinesi kullanarak karnın vücut kıllarını kesin. Tıraş olduktan sonra saçları sıkıca çıkarın, böylece saç karın boşluğuna girmez.</li>
	<li>İşlem için gerekli olan sabit anestezi derinliğinin parmak sıkışması ile elde edildiğini doğruladıktan sonra orta çizgiden sol altkozal bölgeye yatay olarak cerrahi makasla bir kesi yapın. Işık altındaki damarları izleyerek parietal peritondaki kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin.</li>
	<li>Mideyi ıslak gazlı bezle sarın ve retroperitoneal organları ortaya çıkarmak için mideyi hafifçe vücudun dışına doğru hareket ettirin. Cerrahi makas kullanarak omurganın erektör kasları ile yağ dokusu arasına bir çentik yerleştirin ve parmaklarla açıkça ayırın.</li>
	<li>Torasik kanalın etrafındaki bağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Fazla bağ dokusu yaşla birlikte artar. Torasik kanalın 20 mm uzunluğu görünene kadar diyaframın sol haçlarının hemen altından kaudally olarak ortaya çıkın. Hassas cımbız veya ıslak pamuklu çubuklar kullanarak torasik kanal ve aort arasındaki yapışıklıkları hafifçe ayırın.<ol>
<li>Bu işlemi dikkatlice gerçekleştirin, çünkü bazı sıçanlar, lenf pleksusunun (örümcek ağları gibi yayılan küçük torasik kanallar) daha yüksek bir konumu nedeniyle torasik kanal veya kısa bir torasik kanal üzerinden geçen karın arterinden dallanma arteriküllerine sahiptir. Ödemi önlemek için torasik kanala gereksiz temastan kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diyaframın sol haçlarının hemen altındaki torasik kanala bir dize (3-0 ipek) ile bir bağ uygulayın. Kaudal torasik kanal distended olur.</li>
	<li>Cerrahi makasın kesme kenarını bıçaklayarak karın duvarında bir delik (5 mm çapında) yapın, saç tokası kavisli kavis tüpünü geçirin ve tüpü bir noktada iliopsoas kasında lige edin. Kanülasyon tüpünü 10 U/mL heparin içeren normal salin ile doldurun.</li>
	<li>Distended torasik kanalın altına bir ip (3-0 ipek) yerleştirdikten sonra, torasik kanalı bir kanülasyon tüpünün keskin bir şekilde kesilmiş kenarıyla bıçaklayın, kuyruğa doğru yaklaşık 5 mm'lik bir şekilde kanülasyona doğru kanülat ve sabitleme için torasik kanalı kanülasyon tüpü ile kesin.</li>
	<li>Dehidrasyonu önlemek için salin sağlamak için, hassas cımbız kullanarak mide karıncalanmasının ön duvarında bir delik (3 mm çapında) oluşturun ve silikon tüpü (2 mm çapında) pirorik halkadan duodenuma geçirin. Bir yarayı diktikten ve Bollman'ın kafeslerindeki hayvanların bakımını yaptıktan sonra, silikon tüpten her sıçanın duodenumuna 3 mL / s akış hızında şeker yüklü salin aşılamaya başlayın. Tüm kafesi sıcak tutmak için bir kağıt havlu ile örtün.</li>
	<li>Kanülasyon tüpünü, 6 U/mL heparin, %10 fetal sığır serumu ve RPMI 1640 ortamı (pH 7.4; malzeme tablosuna bakın) içeren buz üzerindeki 50 mL'lik konik tüpün kapağının ortasındaki deliğe sabitlayın ve buz üzerinde torasik kanal lenfositleri (TDL' ler) toplayın. Tüpün içindeki fibrin pıhtı oluşumuna bağlı olarak kanüle edilmiş tüp tıkanıklığını önlemek için tüpün ucunu konik tüpün duvarına temas etmemeye dikkat edin. Yaklaşık 1.0 x 10 8 ~109lenfosit içeren lenf sıvısı (yaklaşık20 mL) 6 saat içinde elde edilebilir. Lenfositleri tam anestezi altında elde etmek için anestezi düzlemi izlenir ve lenf akışı uygun şekilde gözlenir. Aynı anestezikler, sıçanlar Ballman'ın kafesine konduktan yaklaşık 3 saat sonra 6 saat boyunca sürekli derin anestezi elde etmek için aynı dozda eklenir.</li>
</ol>2. Karboksifluorescein diasetat succinimidyl ester (CFDSE) ile lenfosit etiketleme
<ol><li>CFDSE'yi(Malzeme Masası)dimetil sülfit (DMSO) ile 15,6 mM (60 μL DMSO'da çözünmüş 500 μg CFDSE) ile çözün.</li>
	<li>Daha önce açıklandığı gibi 37 °C'de 30 dakika boyunca50 μLCFDSE çözeltisi ile 50 mL RPMI 1640'ta inkübte lenfositler (1 x 108~10 9).</li>
</ol>3. Mikrovasküler çalışmalar için deneysel kurulum
<ol><li>Alıcı sıçanları (8-12 hafta) Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) ve Betulphar (2,5mg/kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun ve anestezinin derinliğini parmak sıkışması ile onaylayın. Saç kirlenmesini en aza indirmek için kürkü tımar etmeden önce karnı ıslatın. Daha sonra alıcı Wister sıçanının karnını orta çizgi kesiğiyle açın.</li>
	<li>Merkezin etrafında cam bir slaytla (24 x 50 mm) kaplı dikdörtgen deliği olan taşınabilir paslanmaz çelik bir plakaya (yaklaşık 120 x 300 mm) bir sıçan koyun. Gözlem için PP'ler de dahil olmak üzere ileal segmentin yaklaşık 10 cm'sini seçin.</li>
	<li>Bağırsağı mümkün olduğunca sıcak tutun ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile 37 °C'ye ısıtılır. İnce bağırsağı PBS ile örtmek için kullanılan gazlı bezi ıslatın.</li>
	<li>% 2 izofluran ile sürekli anestezi verirken (bkz. malzeme tablosu), slaytı mikroskop sahnesine koyun ve bazı HEV'lerin serosadan geçtiği PP'lerde mikroskrkülasyonun gözlemlenmesi için uygun alanları seçin. PEN'lerin boyut aralığı; daha büyük olanlar CLSM kullanarak mikroskrkülasyonun gözlemlenmesi için uygundur. İnce bağırsak yerlerde düz değildir; herhangi bir gerginlik olmadan en az 2 cm uzunluğunda düz bir segment gözlem için uygundur.</li>
	<li>Bitişik bağırsak segmentini ve mezentery'yi PBS ile ıslatılmış emici pamukla örtün. Bağırsak segmentini iki yuvarlanmış pamuk topu arasına yerleştirin ve sıçanın kalp atışı ve solunumu tarafından titreşmesini önlemek için sıçanın vücudundan mümkün olduğunca uzağa yerleştirin.</li>
	<li>1 mL şırıng kullanarak, alıcı sıçanların şahdamarına cfse etiketli TDL'leri (1 x10 8 hücre) yavaşça enjekte edin. Hızlı bir intravenöz enjeksiyon sistemik dolaşımı etkileyebilir.</li>
</ol>4. Lenfositlerin mikrositülasyonu
<ol><li>CLSM kullanarak PP'lerin mikrovaskülatındaki TDL'leri sürekli izleyin ve 30 s aralıklarla hızlandırılmış fotoğrafçılık kullanarak bir bilgisayarda 3 saat boyunca kayıt yaptırın. Serosadan PP'lerin HEV'sine kadar olan derinlik yaklaşık 25 μm'dir ve stroma ve kılcal lenf damarlarının 30 μm derinliğe kadar gözlemlenmesine olanak tanır.</li>
	<li>Kan dolaşımını lekelamak için her alıcı sıçanın şahdamarına Texas Red-dektran (25 mg/kg) ve hücre çekirdeğini lekelamak için Hoechest 33342 (5 mg/kg) enjekte edin.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Lenfosit dinamiklerini ölçmek için, HEV'lere bağlı kalan lenfositleri 30 saniyeden fazla "yapışkan lenfositler" ve HEV'lerden stroma'ya göç eden lenfositleri ''lenfositler' olarak tanımlayın. Daha sonra görme alanı başına ortalama göç yüzdesini (göç eden lenfositler / yapışkan lenfositler + göç eden lenfositler) hesaplayın (yaklaşık 0,3 mm2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver,+small+intestine,+or+thoracic+duct+of+the+rat.">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li><li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada naif gut-tropik lenfositlerin toplanması ve sıçan PP'lerinde göçlerinin gözlemlenmesi için bir protokol tanımladık. Bu prosedürler, lenfositlerin PP'lerin mikrovaskülürinde nasıl hareket ettiğini ortaya getirebilir ve dinamiklerini normal veya ilaçlı bir durum altında görsel olarak karşılaştırmayı mümkün kılabilir. Gözlem süresi sadece birkaç saatle sınırlı olmasına rağmen, bu dinamiklerin doğrudan gözlemlenmesi, bazı ilaçlar tarafından immünolojik modifikasyon için bir ipu...

Peyer'in yamaları (PP'ler) ince bağırsağın lamina propriasında yüzlerce lenfoid folikülden oluşur. PP'ler foliküllere, foliküller bölgeye ve lenfositlerin antijen sunumu ile uyarıldığı foliküllerin alt kısmında bulunan germinal merkezlere ayrılır. Farklı lenfatik damarlar yoktur ve antijenler epitel hücre tabakası yoluyla bağırsak lümeninden lamina propriasını istila eder. Lenfoid folikülleri kapsayan epitel bölgesine, özel serpiştirilmiş M hücrelerinin mukozal antijenleri aldığı folikül ilişkili epitel denir. M hücreleri luminal taraftan antijenleri alır ve antijenler daha sonra dendritik hücreler tarafından yakalanır ve yüksek endotel venules (HEV' ler) endotel yoluyla PP'lere akan naif lenfositlere doğru sunulur1. PP'ler bağırsak bağışıklığında önemli bir rol oynar ve iltihabın erken evresi ile ilgilidir. Birçok moleküler etkileşim, lenfositlerin yapışma molekülleri, kemokinler 2,3ve sphingosine-1-fosfat4dahil olmak üzereikincil lenfoid organlara (SLO' lar) girişini içerir; bu nedenle, beklenen birçok terapötik hedef vardır. Bu nedenle, PP'lerdeki lenfosit dinamiklerini gözlemlemek, iltihabın çok erken aşamasına bir göz atmamızı ve umut verici birkaç ilacın yararlılığını incelememizi sağlar.
Buradaki yöntem, PP'lerde lenfositlerin göçüne odaklanır, bu da çeşitli prosedürleri içerir (torasik kanal5'e öykünme ve lenfositlerin toplanması ve toplanan lenfositlere enjeksiyondan sonra uzun süreli gözlem). Bu prosedürler karmaşık olduğundan ve önceki raporlarda her prosedürün tam olarak nasıl yapıldığını görmek zor olduğundan, başarılı bir gözlem elde etmek için burada bazı ipuçlarından bahsettik. Örneğin, tüplerin torasik kanala girebilmesi çok zordu ve ilk başarı oranı% 50'den azdı. Bununla birlikte, yöntemi geliştirdik ve% 80'i aşan bir başarı oranı elde ettik. Bu yazıda, lenfositlerin transendotelit göçünün çeşitli koşullar altında nicel olarak değerlendirilmesini sağlamak için başarılı gözlem için gerekli olan diğer bazı ipuçlarından bahsetmiştir.
Önceki raporlarda, PPs6'nındamar yapısını leke etmek için Hindistan mürekkebinin intravenöz enjeksiyonu veya mikroskop monofokal7gibi zamandaki üç boyutlu değişiklikleri anlamak zordu. Son yıllarda, Kaede fareleri gibi bazı foto-dönüşümlü floresan protein transgenik hayvanlar kullanılarak gözlemsel bir yöntem, sistematik hücresel hareketleri netleştirdi vivo8. Diğer çalışma, CD69 lenfosit çıkışlarının PPs9'danbağımsız olarak kapatılmasını açıklığa kavuşturdu. Yüksek analitik özelliği nedeniyle konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) kullandık. Artık yüksek çözünürlüklü görüntüleri kolayca elde edebilir ve lenfosit dinamiklerini analiz etmek için kullanabiliriz.
Bu olguda PP'lerde lenfosit göçünün değerlendirilmesi için bir dizi yöntem gösterilmiştir. İlk olarak, lenfositleri toplamak için torasik kanal cannülasyonunun rafine yöntemlerini gösterdik. İkinci olarak, gözlemsel yöntemleri mikroskobik gözlem altında mümkün olduğunda objektif organları korumak için çeşitli şekillerde geliştirdik ve 3 saat boyunca yüksek kaliteli görüntüler elde etmemizi sağladık. Üçüncü olarak, bazı ilaçların etkilerini değerlendirmek için lenfosit göçünün hücresel hareketlerini ölçtük. Bu değiştirilmiş protokoller mukozal immünoloji değerlendirmelerinin geliştirilmesine katkıda bulunacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:913px;" width="913">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">A1R+</td>
			<td style="width:213px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:265px;">Comfocal Laser Scanning Microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechest 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Texas Red&#8211;dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

Naif lenfositler fizyolojik durum altında kandan lenfoid dokulara sirkülasyon yapar ve genellikle bağırsak bağışıklığında önemli bir fenomen olarak kabul edilir. Peyer yamaları (PP'ler) veya mezenterik lenf düğümleri gibi ikincil lenfoid organların stroma'sı, naif lenfositlerin antijenleri algıladığı yerdir. Naif lenfositler, PP'lere giriş portalı olan yüksek endotel venule'lere ulaşmak için kan dolaşımında dolaşır. Bazı immünomodülatörlerin lenfosit göçini etkilediği tahmin edilmektedir, ancak mikrositülasyon dinamiklerinin kesin olarak değerlendirilmesi çok zordur ve lenfosit göçini in vivo olarak gözlemlemek için bir yöntem oluşturmak kesin mekanizmaların netleşmesine katkıda bulunabilir. Lenf kanalından lenfosit toplama ve sıçan PP'lerindeki bağırsak-tropik lenfositlerin ayrıntılı dinamiklerini gözlemleme yöntemini iyileştirdik. Fare PP'lerini in vivo olarak gözlemlemek için konfokal lazer tarama mikroskopisini seçtik ve zaman atlamalı fotoğrafçılık kullanarak kaydettik. Artık lenfosit dinamiklerinin analizine katkıda bulunabilecek net görüntüler elde edebiliriz.

Lenfositlerin lenfositlerden toplanması Sıçanı torasik kanal cannülasyonuna hazırlamak için, Şekil 1'de gösterildiği gibi gergin torasik kanala bir kesi yapın ve daha sonra sıçanı Şekil 2'degösterildiği gibi bir Bollman'ın kafesinde muhafaza edin.
Lenfositler iyi toplandığında, yaklaşık 107~ 10 8 / mL lenfosit içeren yaklaşık 20 mL /6h lenf sıvısı elde edebiliriz. ...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches at JoVE.com

Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Burada, torasik kanal lenfositlerinin toplanması ve sıçan Peyer'in yamalarında bağırsak-tropik lenfositlerin zaman atlamalı fotoğrafçılığı kullanarak 3 saat boyunca göç ettiğini gözlemlemek için kesin bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik, lenfositlerin dinamiklerinin enflamatuar koşullar altında nasıl etkilendiğini netleştirebilir.

Sıçan Peyer Yamalarında Lenfosit Dinamiği Mikroskobik Gözlemi

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

microscopic-observation-of-lymphocyte-dynamics-in-rat-peyer-s-patches

Research

JoVE Journal

Medicine

3.9K Görüntüleme.  National Defense Medical College. Burada, torasik kanal lenfositlerinin toplanması ve sıçan Peyer'in yamalarında bağırsak-tropik lenfositlerin zaman atlamalı fotoğrafçılığı kullanarak 3 saat boyunca göç ettiğini gözlemlemek için kesin bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik, lenfositlerin dinamiklerinin enflamatuar koşullar altında nasıl etkilendiğini netleştirebilir.

Video: Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Ivacaftor, büyük metabolitleri ve Lumacaftor Kistik fibrozis hastalarının biyolojik sıvı içinde klinik örnekler yüksek üretilen iş analizi için en iyi duruma getirilmiş LC-MS/MS yöntemi

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Tıp

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss of relevant amounts of heart muscle mass can lead to the heart failure. Besides heart transplantation, there is no curative treatment option for the end-stage heart failure. In times of organ donor shortage, organ independent treatment modalities are needed. Left-ventricular assist devices are a promising therapy option, however, especially as destination therapy, limited by its side-effects like stroke, infections and bleedings. In recent years, several cardiac repair strategies including stem cell injection, cardiac progenitors or myocardial tissue engineering have been investigated. Recent improvements in cell biology allow for the differentiation of large amounts of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC). One of the cardiac repair strategies currently under evaluation is to transplant artificial heart tissue. Engineered heart tissue (EHT) is a three-dimensional in vitro created cardiomyocyte network, with functional properties of native heart tissue. We have created EHT-patches from hiPSC derived cardiomyocytes. Here we present a protocol for the induction of left ventricular myocardial cryoinjury in a guinea pig, followed by implantation of hiPSC derived EHT on the left ventricular wall.

Here we present a protocol for the induction of left ventricular cryoinjury followed by the implantation of a cardiac muscle patch, derived from human iPS-cell cardiomyocytes in a guinea pig model.

HiPSC elde edilen kalp kası yamalar implantasyonu eskiden şiling şimdi domuz modelinde miyokardiyal yaralanma sonra

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Periadventitial Terapötik Uygulama ile Sıçan Karotis Arter Basınç Kontrollü Segmental Balon Yaralanması

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is currently the only treatment for life-threatening ventricular fibrillation. However, defibrillation may have side-effects, including intolerable pain, tissue damage, and worsening of prognosis, indicating a significant medical need for the development of more gentle cardiac rhythm management strategies. Besides energy-reducing electrical approaches, cardiac optogenetics was introduced as a powerful tool to influence cardiac activity using light-sensitive membrane ion channels and light pulses. In the present study, a robust and valid method for successful photostimulation of Langendorff perfused intact murine hearts will be described based on multi-site pacing applying a 3 x 3 array of micro light-emitting diodes (micro-LED). Simultaneous optical mapping of epicardial membrane voltage waves allows the investigation of the effects of region-specific stimulation and evaluates the newly induced cardiac activity directly on-site. The obtained results show that the efficacy of defibrillation is strongly dependent on the parameters chosen for photostimulation during a cardiac arrhythmia. It will be demonstrated that the illuminated area of the heart plays a crucial role for termination success as well as how the targeted control of cardiac activity during illumination for modifying arrhythmia patterns can be achieved. In summary, this technique provides a possibility to optimize the on-site mechanism manipulation on the way to real-time feedback control of cardiac rhythm and, regarding the region specificity, new approaches in reducing the potential harm to the cardiac system compared to the usage of non-specific electrical shock applications.

This work reports a method for controlling the cardiac rhythm of intact murine hearts of transgenic channelrhodopsin-2 (ChR2) mice using local photostimulation with a micro-LED array and simultaneous optical mapping of epicardial membrane potential.

Murin Kalplerde Optogenetik Çok Bölgeli Fotostimülasyon Uygulayarak İleri Kardiyak Ritim Yönetimi

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

The Microscopic Transcanal Approach in Stapes Surgery Revisited

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the external auditory canal, the middle ear, and epitympanon. Such an approach avoids a retroauricular or endaural skin incision; however, working through a narrow space needs angled microsurgical instruments and specific training in otologic surgery. The transcanal approach restricts the working space; however, it offers a binocular microscopic vision into the middle ear without extended skin incisions and thus, reducing post-operative pain and bleeding. In addition, this minimally invasive approach avoids scar tissue complications, hypoesthesia of the auricle, and potential protrusion of the pinna. Despite its numerous advantages, this method is still not routinely performed by otologic surgeons. Since this minimally invasive technique is more challenging, there is a need for extensive training in order for it to be widely adopted by otologic surgeons. This article provides step-by-step surgical instructions for stapes surgery and reports possible indications, pitfalls, and limitations using this microscopic transcanal technique.

This article describes the microscopic transcanal technique for stapes surgery, providing step-by-step surgical instructions for familiarizing surgeons with this approach.

Stapes Cerrahisinde Mikroskobik Transkanal Yaklaşımı Yeniden Gözden Geçirildi

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the ...

Microscopic Replantation of Penile Glans Amputation Due to Circumcision

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans amputation, which is a very rare iatrogenic genital injury. Such complication is conventionally treated by simple hemostasis to achieve self-healing, early gross replantation, or delayed plastic surgery. However, these may lead to obvious unfavorable outcomes such as amputated glans loss, necrosis, malformation healing, or urethral orifice stenosis. In the present study, we adopted microscopic replantation as an emergency approach to achieve the precise anastomoses and anatomic reconstruction of penile glans. The goal of this protocol is to present a detailed emergency management strategy with meticulous surgical skills for the penile glans amputation. The postoperative results showed that the original shape of the glans was perfectly restored with satisfactory cosmetic appearance. The micturition function was completely restored to normal without any obvious complications. There was also no significant reduction in the sensation of amputated glans area. Hence, early meticulous microscopic replantation as soon as possible is an ideal emergency management strategy for the penile glans amputation due to circumcision.

The present protocol describes the emergency management of microscopic replantation of penile glans amputation due to circumcision.

Sünnete Bağlı Penil Glans Amputasyonunun Mikroskobik Replantasyonu

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans ...

Microscopic Cyst Resection for the Treatment of Patients Diagnosed with Epididymal Cyst

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative asoedema, hematoma, sustaining pain, and seminal tract obstruction in patients who have undertaken nonmicroscopic epididymal cyst resection or epididymal resection. Nonmicroscopic epididymal cyst surgery is suggested for patients with childbirth plans as a precaution. The treatment of male epididymal cysts via microtechnology is obviously a beneficial option; we took the lead in carrying out microscopic epididymal exploration and cyst resection surgery in China. From September 2017 to April 2021, 41 young and middle-aged male patients diagnosed with epididymal cysts underwent microtechnology treatment in a program titled &#34;microscopic epididymal exploration and cystectomy&#34;. The postoperative follow-up lasted for 3-50 months. The results confirmed that, as microscopic manipulation largely improved visualization of the subtle tissue structures of the epididymis, the cyst could be clearly dissected apart and completely removed intact under the microscope. Bleeding during the operation was significantly reduced (2-3 mL) and wound drainage was not required. According to follow-up data, microscopic treatment significantly reduced the incidence of postoperative scrotal hematoma, edema, and long-term postoperative pain, thereby promising a higher surgical success rate as well as recurrence prevention. Besides, preliminary experience and reflection suggest that microscopic epididymal exploration and cystectomy provide efficient preservation of the epididymal patency through refined treatment, while a better prognosis can be achieved. We recommend that surgery be carried out before the epididymal cyst develops to 0.8 cm in diameter, for fear that a larger epididymal cyst (&#62;0.9 cm in diameter) could cause the complete destruction of all tubules of the ipsilateral epididymis - a more severe case with damage to the testicular output network.

Here, we present a protocol to treat patients diagnosed with an epididymal cyst using microscopic cyst resection. Based on microscopic manipulation, a largely improved visualization of the subtle tissue structures of the epididymis was obtained, so the cyst could be clearly dissected apart and completely removed intact.

Epididim Kisti Tanısı Alan Hastaların Tedavisinde Mikroskobik Kist Rezeksiyonu

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative ...

Microscopic Electric Rotary Grinding of Plaques Combined with Graft Repair in the Management of Peyronie's Disease

Peyronie's Disease (PD) is clinically characterized by the development of localized fibrous plaques, primarily on the tunica albuginea, especially on the dorsal area of the penis. These plaques are the hallmark feature of this condition, resulting in penile curvature, deformity, and painful erections for affected individuals. Although various nonsurgical treatment options exist, their overall effectiveness is limited. As a result, surgical intervention has become the ultimate choice for patients with severe penile curvature deformities and associated erectile dysfunction. Our research team has successfully employed a combined approach involving microscopic electric rotary grinding of the fibrous plaques and the use of tunica vaginalis or bovine pericardium as graft materials for the repairing of the defects of tunica albuginea in the treatment of PD. This approach has consistently yielded highly satisfactory results regarding the restoration of penile shape, with excellent cosmetic results and significantly improved sexual satisfaction. 
This protocol aims to present a comprehensive surgical management strategy utilizing electric rotary grinding of the plaques and repairing the defects of tunica albuginea by using the tunica vaginalis, which represents an optimal surgical strategy for treating PD.

The presented protocol describes a microscopic surgical method for the treatment of Peyronie's disease by using electric rotary grinding of the plaques followed by using the tunica vaginalis or bovine pericardium as a graft for the repairing of the defects of the tunica albuginea.

Peyronie Hastalığının Tedavisinde Greft Onarımı ile Kombine Plakların Mikroskobik Elektrikli Döner Öğütülmesi

Peyronie's Disease (PD) is clinically characterized by the development of localized fibrous plaques, primarily on the tunica albuginea, especially on the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Gastrointestinal Dinamikleri ve İlaçların Motilite Üzerindeki Etkilerini İnceleme Protokolü

Using An In Vitro Tissue Perfusion System to Detect the Functional Activities of Isolated Intestinal Tubes in Real Time

Gastrointestinal diseases, which have a high incidence, pose considerable challenges for humans. The small intestine is integral to food and drug digestion and absorption and plays a crucial role in treating these diseases. The intestinal tube movement experiment, a common and essential in vitro method, is utilized to study gastrointestinal dynamics. This includes the preparation of the isolated intestinal tube, as well as the suspension of the prepared intestinal tube in the bath and its connection to a signal detector. This is followed by the recording and analysis of a series of parameters, such as tension, which can be used to assess intestinal motor function, as well as considerations for keeping the intestinal tube active in vitro. The standardized program from sampling to data collection greatly improves the repeatability of the experimental data and ensures the authenticity of the recording of intestinal tension after physiological, pathological, and drug intervention. Here we present the key problems in experimental operation and a valuable reference experimental protocol for studying drugs that regulate gastrointestinal motility.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Sıçan Bağırsak Tüpleri Üzerindeki İlaç Etkisinin Güvenilir ve Tekrarlanabilir İn Vitro Değerlendirmesi

We present a method for isolating rat intestinal tubes and assessing the impact of drugs on their tension, frequency, and amplitude in vitro. This method offers a valuable approach for researchers investigating intestinal tubes.