Neovaskülarizasyon, yeni kan damarlarının üretilmesi hem normal hem de patolojik olaylarda son derece düzenlenmiş bir süreçtir. Neovaskülarizasyonu daha iyi anlamak için, süreci doğal hücresel mikroçevrici in vitro olarak yeniden oluşturmak önemlidir. Mikroakışkan bir çip ve otomatik kontrol geliştirdik.
Yüksek verimli dolaşımlar perfüzyon mikro tüpleri oluşturmak ve yeni vaskülerizasyonun ilk olayına geri dönmek için proteini kullanmak için simüle etmek için yapılır. Mikroakışkan filizlenen çip üç kanaldan oluşuyordu. Endotel hücre kültürü kanalı ile sıvı kanal geniş bir merkezi hidrojel kanal ile ayrıldı.
Mikroakışkan kontrol sistemi bir mikrosyringe pompası ve elektromanyetik sıkıştırma vanası idi. Kabarcık tuzak çipi, mikroakışkan filizlenen çip, mikro-peristaltik pompa ve kültür orta rezervuarı. Mikroakışkan bir sistemle endotel hücreleri, yüksek ışıklı kesme stresi, transendotelyal akışın fizyolojik düzeyi ve çeşitli vasküler endotel büyüme faktörü dağılımları ile aynı anda uyarılabilir.
Hücre kültürü kanalının bir ortam enjeksiyon portuna fibronektin mililitresi başına 125 mikrogram pipet 20 mikrolitre. Hücre kültürü kanalının bağlantı noktasına makasla uyacak şekilde bir pipet ucu kesin. Pipet ucunu hücre kültürü kanalının diğer ortam ekleme bağlantı noktasına yerleştirin.
Daha sonra, fibronektin ile doldurmak için hücre kültürü kanalından hava boru. Cipsleri bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Hücre tohumlamadan önce, pipet her ortam enjeksiyon portuna 20 mikroliter endotel hücre ortamı ve cipsleri 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Ardından, tüm medya enjeksiyon bağlantı noktalarındaki tüm medyayı pipetle dışarı atın. Daha sonra, hücre kültürü kanalının bir ortam enjeksiyon bağlantı noktasına beş mikroliter hücre süspansiyonu pipet. Daha sonra endotel hücreleri diferansiyel hidrostatik basınç altında hızla tüm kanala yayılır.
Hidrostatik basıncı ayarlamak ve hücrenin hareket etmesini durdurmak için diğer bağlantı noktasına yaklaşık dört ila altı mikroliter ECM ortamı ekleyin. Çipleri hücre inkübatörüne uzaktan kumanda edin. Daha sonra, endotel hücreleri hücre kültürü kanalının iç yüzeyini kaplayana kadar her 30 dakikada bir çipleri ters çevirin, iki saat sonra.
Enjeksiyon bağlantı noktalarındaki ekli hücreleri çok dikkatli bir şekilde çıkarmak için pipet ucu kullanın. Ardından, ortam enjeksiyon bağlantı noktalarına dört dikenli dişi Luer adaptörü yerleştirin ve ECM ortamıyla doldurun. Çipleri hücre inkübatörüne çıkarın, ECM medyasını ve Luer adaptörlerini her 12 saatte bir değiştirin.
Mikroakışkan kontrol sistemini monte etmek için iki politetrafloroetilen tüp, iki kısa silikon tüp, üç uzun silikon tüp, bir dikenli dişi Luer adaptörü, bir Y tipi konektör ve ardından üç L tipi konektör hazırlayın. Şırınnayı önceden ısıtılmış 10 mililitre ECM ortamı ile doldurun. Dikenli dişi bir Luer adaptörü ile şırındağa bir politetrafloroetilen tüpü bağlayın.
Ardından, politetrafloroetilen tüpün diğer ucunu bir Y tipi konektöre bağlayın. Ardından, iki uzun silikon tüpü Y tipi konektörün diğer iki ucuna bağlayın. Rezervuara bağlanmak için bir tüp ve kabarcık tuzak çipine bağlanmak için diğer tüpü kullanıyoruz.
Rezervuara başka bir uzun silikon tüp bağlayın. Daha sonra, kabarcık tuzak çipinin üst katmanındaki tüm giriş ve çıkış deliklerini bağlamak için iki kısa silikon tüp kullanın. Çipin arka ucuna bir politetrafloroetilen tüpü bağlayın.
Ardından, bir şırıngayı mikrosyringe pompasına sabitlayın. Elektromanyetik sıkıştırma vanasına iki uzun silikon tüp takın. Ardından, şırıngam ve rezervuar arasındaki boru hattını açmak için elektromanyetik sıkıştırma vanasını değiştirin.
Tüpteki havayı tüketmek için mikrosyringe pompası kullanarak rezervuara ortam enjekte edin. Ardından, şırınna ve kabarcık tuzak çipi arasındaki boru hattını açmak için vanayı tekrar değiştirin. Kabarcık tuzak çipinin sıvı odasını ve arka uç tüpünü doldurmak için ortam enjekte edin.
Endotel filizlenen çipleri hücre inkübatöründen çıkarın, ardından hücre kültürü tarafındaki Luer adaptörlerini çıkarın. Mikroakışkan filizlenen çipin hidrojel enjeksiyon portlarına iki boru fişi yerleştirin. Kabarcık tuzak çipinin arka uç tüpünü hücre kültürü kanalının bir bağlantı noktasına bağlayın.
Diğer bağlantı noktasına bir T tipi konektör takın ve rezervuara bağlı uzun silikon tüpe bağlayın. Uzun silikon tüpü mikro peristaltik pompaya kırpın. Ardından, rezervuara bir hava filtresi yerleştirin.
Ardından, mikroakışkan filizlenen çipi sahne üstü inkübatöre monte edin. Ardından, vakum pompasını bir TPU tüpü ile kabarcık tuzak çipinin alt tabakasındaki deliklere bağlayın. Mikrosyringe pompasını ve elektromanyetik sıkıştırma vanasını aynı anda kontrol eden özel programda karşıt sirkülasyon hacmi ve bir akış hızı ayarlayın.
Ardından, mikro peristaltik pompanın akış hızını ayarlayın. Mikrosyringe pompasını açın. Daha sonra sirkülasyon kontrol sistemi kurulur.
Modelimizdeki bazı mikro damarların bariyer fonksiyonunu 40 kDa F-I-T-C dekstrin difüzyonal geçirgenlik katsayısını ölçerek test ediyoruz. Şekilde gösterildiği gibi, hücre astarlı statik kültür çipinin difüzyonal geçirgenlik katsayısı saniyede 0,1 artı veya eksi 0,3 mikrometredir. Ve hücre astarı olmayan boş kanalın difüzyonal geçirgenlik katsayısı saniyede 5,4 artı veya eksi 0,7 mikrometredir.
Endotel filizlenme tahlili, endotel hücrelerinin 24 saatlik statik kültlemeden sonra büyük ölçüde merkezi hidrojel içine filizlendiğini, ışıklı kesme stresinin artmasıyla filizlenme derecesinin önemli ölçüde azaldığını göstermiştir. Nicel olarak, luminal kesme stresi, filizlenme alanı, ortalama filizlenme uzunluğu ve en uzun filiz uzunluğu açısından endotel filizlenmesini önemli ölçüde azalttı. Sistemimizle, endotel hücreleri üzerindeki kesme stresi, transendotelyal akış fizyolojik düzeyde kalırken, deney sırasında isteğe bağlı olarak herhangi bir zamanda değiştirilebilir.
Bu in vitro 3D biyomimetik model doğrudan neovasularizasyon mekanizmasının çalışmasına uygulanabilir ve ilaç taraması ve toksikoloji uygulamaları için düşük maliyetli bir platform olarak potansiyel sözü tutar.
