Bu protokol, DamID dizilimini kullanmak yerine nükleoiskelete olan ekleri değerlendirmek için kullanılabilir ve tek bir hücre testidir. Bu yöntemi kullanmanın temel avantajı, uygun maliyetli ve kolay erişilebilir olmasıdır. Genler ve kromozomlar arasındaki normalde diğer görselleştirme teknikleriyle ortaya çıkmayabilecek fonksiyonel farklılıkları vurgulayabilir.
Tedavi edilen kanser ve progeria hücrelerinde genom içindeki mekansal ve fonksiyonel organizasyonlar ve yaşlanan hücrelerdeki genomik davranış farklılıkları bu protokol kullanılarak değerlendirilebilir. Bu yöntem, yaşam süresi boyunca ve herhangi bir hastalığın herhangi bir hücre veya doku tipine uygulanabilir. Ayrıca probların mevcut olduğu model organizmalarda da kullanılabilir.
Başlamak için, 500 mililitre% 10 hidroklorik asit hazırlayın ve büyük bir beher içine dökün. Mikroskop slaytlarını ayrı ayrı aside bırakın ve iki G.Decant'a ayarlanmış bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin ve slaytları musluk suyunda 10 kez yıkayın. Sonra deiyonize suda 10 kez daha.
Slaytları metanol içinde iki kez durulayın ve sterilizasyona kadar metanol içinde tutun. Slaytları kurutmak için bir kağıt havluya dökün ve otoklav veya sıcak fırında sterilizasyon için folyoya sarın. Hücreleri uygun ortamda serum ile en az 48 saat boyunca 37 santigrat derecede büyütün ve% 5 karbondioksit ile% 60 ila% 70 akıcılığa ulaşılıncaya kadar.
Her hücre tipini toplayın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Slayt başına 10 mililitre ortamda beş hücreye bir kez 10 kez tohumlayın. Slaytları ve ekli hücreleri içeren kültür kabını inkübatörden çıkarın.
Ortamı atın ve slaytları kurşun kalem kullanarak etiketleyin. Daha sonra bunları 50 mililitre buz gibi soğuk sitoiskelet tamponu içeren bir coplin kavanoza yerleştirin. Kavanozu buz üzerinde 15 dakika veya dört santigrat derecede inkübe edin.
Hücre iskeleti tamponunu atın ve slaytları tamponla birlikte bir coplin kavanoza batırarak 50 mililitre tek seferlik DNA halo tamponunda üç kez hızlı bir şekilde durulayın. Slaytları 50 mililitre ekstraksiyon tamponu içeren bir coplin kavanoza aktarın ve oda sıcaklığında dört dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra slaytları art arda 50 mililitrede 10 kez, beş kez, iki kez ve her biri bir dakika boyunca bir kez DNA halo tamponunda inkübe edin.
İşiniz bittiğinde, slaytları %10, 30, 70 ve %95 etanolden oluşan sıralı bir etanol serisine batırın. Slaytları, her biri beş dakika boyunca sıralı 50 mililitrelik bir etanol serisi olan 70, 90 ve% 100 etanol boyunca alın. Onları bir ısıtma plakasında hava ile kurutun.
Sonra 70 santigrat derece fırında beş dakika pişirin. Slaytları, 70 santigrat derecede iki dakika boyunca% 70 formamid iki kez SSC çözeltisine yerleştirerek denatüre edin. Denatüre edilmiş slaytları beş dakika boyunca 50 mililitre buz gibi soğuk% 70 etanol içine yerleştirin.
Daha sonra bunları oda sıcaklığında% 90, 95 ve% 100'lük bir etanol serisinden her biri beş dakika boyunca hareket ettirin. İşiniz bittiğinde, slaytları bir ısıtma plakasında hava ile kurutun. DNA problarını sıcak bir blok veya su banyosunda 10 dakika boyunca 75 santigrat derecede denatüre edin.
Ardından, uygun slayta 10 mikrolitre pipetlemeden önce 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Probu 21 x 21 milimetrelik bir kapak kayması ile kaplayın ve kauçuk çimento ile kapatın. Slaytları nemlendirilmiş bir hibridizasyon odasında 37 santigrat derecede en az 18 saat boyunca inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, kauçuk çimentoyu forseps ile dikkatlice çıkarın. Daha sonra slaytları, üç beş dakikalık inkübasyon için 45 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış pH yedide 50 mililitre% 50 formamid iki kez SSC çözeltisinde inkübe edin. Daha sonra, slaytları 60 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış, ancak 45 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirilmiş 50 mililitre 0.1 kat SSC çözeltisine yerleştirin.
Beş dakika boyunca inkübe edin ve beş dakikalık inkübasyonlar için tamponu iki kez değiştirin. Slaytları oda sıcaklığında 50 mililitre dört kez SSC çözeltisi içeren bir coplin kavanoza yerleştirin ve üç tampon değişimi ile 15 dakika boyunca inkübe edin. Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için, her slayta dört kez SSC çözeltisi için 100 mikrolitre% 4 BSA çözeltisi uygulayın ve bir parça parafin film ile kaplayın.
Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, etiketli probu tespit etmek için slaytları oda sıcaklığında bir saat boyunca 200'de bir kez seyreltilmiş 100 mikrolitre streptavidin Cy3 ile inkübe edin. Slaytları oda sıcaklığında 50 mililitre dört kez SSC çözeltisi içeren bir coplin kavanoza yerleştirin ve üç tampon değişimi ile 15 dakika boyunca inkübe edin.
Kızakları, DAPI içeren bir montaj çözeltisinin 20 mikrolitresine monte edin ve 22 x 50 milimetrelik bir kapak kayması ile bindirin. DNA halelerini ve kromozom bölgelerini, 100X yağ hedefine sahip bir epifloresan mikroskobu kullanarak görselleştirin. DNA halo preparasyonu, artık çekirdeğin kenarını, artık çekirdek içinde kalan DNA'yı ve çevreye biriken bağlanmamış DNA'yı görmeyi mümkün kılar.
Proliferasyon yapan insan dermal fibroblastlarının DNA haleleri, BRDU içeren hücrelerden oluşturuldu ve daha sonra anti-BRDU antikoru ile boyandı. Proliferasyon yapan hücreler BRDU ve anti-pKi-67 için pozitifti. Bu protokol, DNA haleleri içindeki kromozom bölgelerini görselleştirmek için kullanıldı.
Bireysel kromozomlar, kromozom 1, 13, 17 ve 18 için spesifik tam kol kromozomu boyama probları ile etiketlendi. Anti-pKi-67, çoğalan hücreleri ve aynı kültürdeki yokluğunu işaretlemek için kullanıldı. Yeşil telomerli DNA halo preparatları burada gösterilmiştir.
DNA halesindeki telomerlerin oranını, özellikle deney iki görüntüsünde gözlemlemek mümkündür. Sessiz hücrelerde ortalama telomerlerin yüzdesi yaklaşık% 17 idi. Kromozom bağlanmasındaki farklılıklar, primer kontrol fibroblastlarında ve tipik ve atipik Hutchinson-Gilford progeria sendromlu hastalıklı hücrelerde, farklı bir Sun1 izoformu eksprese eden ve Lamin A mutasyonu olmayan tespit edildi.
Kromozom bir ve 13, kontrollü DNA halelerine kıyasla, artık çekirdekler içindeki bağlanmalarında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermektedir. Tüm kromozom bölgesinin konumu artık çekirdek ve DNA halesi ile ilişkiliydi. Bu protokolü denerken, hücrelerin doğru yoğunlukta tohumlandığından ve doğru zamanda çıkarıldığından emin olun.
Bu işlemi takiben dolaylı immünofloresan ve RNA FISH yapılabilir.
