Burada, bu tür hassas filmlerin işlenmesini kolaylaştıran yeni bir yüzdürme bloğu kullanarak destek filmleriyle kriyo-EM örnekleri hazırlamak için geliştirilmiş protokoller sunuyoruz. Bu yöntemin en önemli avantajı, numunenin denatürasyon gibi zarar verici etkilerin ortaya çıkabileceği hava suyu arayüzünden korunmasıdır. Burada sunulan protokollerden biri, grafik hidrofilik hale getirmek için her türlü pahalı tedaviden kaçınır, bu nedenle tüm EM topluluğuna erişilebilirliğini artırır.
Küçük yüzdürme cihazları, iyi hazırlık için elektro mikroskopi tarafından henüz yaygın olarak kullanılmamaktadır. Bu nedenle, bu görsel gösteriler kullanımları için bir ölçüt sağlayabilir. Başlamak için, TEM ızgaralarını çift damıtılmış su ve ethel asetat ve ardından plazma temizliği ile yıkayın.
Daha sonra numunenin 10 ila 12 mikrolitresini tampon değişimi kuyusuna, yüzdürme bloğunu ve 10 ila 12 mikrolitre%2 pisuar asetat çözeltisini negatif boyama için bitişik tamponsuz değişim kuyusuna ekleyin. Leke ile çalışırken uygun güvenlik önlemlerini almak esastır. Üzerine önceden pozlanmış karbon film ile iki küçük mika parçasını dikkatlice kesin.
Mika parçalarının kuyuya sığacak kadar geniş ve kuyu uzunluğundan daha uzun olduğundan emin olun, böylece parça karbon yüzerken kuyuya oturabilir ve parçayı cımbızla işlemek için yeterli alan vardır. Mikayı, kuyunun rampasına oturana ve sıvı numunenin yüzeyinde karbon tabakası gözleninceye kadar yaklaşık 45 derecelik bir açıyla kuyuya daldırın. Karbonun numune ile inkübe edildikten sonra, karbon filmi kurtarmak ve artık visküs numunesi tutmasını en aza indirmek için mika tabakasını çok yavaşça çekin.
Fazla sıvıyı çıkarmak için karbon olmayan alt yüzeye bir filtre kağıdı ile dokunarak mikayı dikkatlice lekeleyin ve karbon tabakasını negatif leke ile değiştirmek için mika parçasını% 2 pisuar asetat çözeltisi içeren karşı kuyuya daldırin. Yıkanmış ve plazma temizlenmiş EM ızgarasının kutsal karbon kaplı tarafı ile yüzen karbon tabakasını geri kazan. Daha sonra ızgaraları TEM'de görüntülemeye kadar hava kurumaya bırakın, tercihen havadaki kirlenmeyi önlemek için örtün.
Daha önce gösterildiği gibi TEM ızgaralarını temizledikten sonra, kullanımdan hemen önce grafen oksit süspansiyonunu ve girdabı iyice hazırlayın. Daha sonra tampon olmayan dört değişim kuyusuna 10 ila 12 mikrolitre grafen oksit süspansiyonu ekleyin. yüzdürme bloğu boyunca.
Bloğun kalan dört tampon değişim kuyusuna 10 ila 12 mikrolitre çift damıtılmış su veya ultra saf su ekleyin. Her kuyunun grafen oksit süspansiyonuna dört ızgarayı hafifçe bırakın ve kutsal karbon kaplı tarafın çözeltiyle temas etmesini sağlamak için bir dakika kuluçkaya yatırın. Bir dakika sonra, cımbızları tampon olmayan her değişimin cımbız oluğuna iyice kaydırarak her ızgarayı dikkatlice kurtarın.
Her ızgaranın karbonsuz bakır kaplı tarafını, ızgarada su damlası görünene kadar bitişik kuyuda çift damıtılmış su ile hafifçe ve kısa bir süre iteleme. Daha sonra ızgara suyu damlasını bir filtre kağıdı parçasına karşı dikkatlice basılı tutun. Izgaraları örtün ve cımbızda kurumaya bırakın.
Cam bir slaytta biriken bakır bir grafik levhasının üzerine dört yıkama ızgarası yerleştirin ve monolayer grafen ile ızgara arasında yakın temas sağlamak için her ızgarayı bir damla izopropanol ile örtün. İzopropanolün tamamen buharlaşmasından sonra, bakır grafen levhayı ızgaralarla cam Petri kabındaki ferrik klorür çözeltisine yüzdürün. Daha sonra havadaki kirlenmeyi önlemek için kabı örtün ve gece boyunca oda sıcaklığında kazınmaya bırakın.
Grafen monolayer üzerinde yüzen ızgaraları çıkarmak için TEM ızgara boyutundan daha büyük çapa sahip bir döngü kullanın ve bunları yıkamak için çift damıtılmış su içeren cam bir Petri kabına dikkatlice aktarın. Izgaraları suda iki kez yıkayın ve ızgaraları numune hazırlığına ve dondurucuya dalana kadar numune tamponu içeren bir Petri kabına aktarın. Yüzdürme bloğunun bir kuyusuna numunenin 10 ila 12 mikrolitresini ekleyin.
Numune blokta hazır olduğunda, bir çift temiz cımbız kullanarak tampon çözeltisinden grafen kaplı ızgarayı seçin ve numunenin iyi içeren yüzeyine yerleştirin. Uygun bir kuluçka döneminden sonra, ızgarayı bir çift temiz dondurucu cımbızla alın ve şişkinlik ve vitrifikasyona devam edin. Destek yüzdürme bloğu ile hazırlanan negatif lekeli ızgaralar tipik olarak tüm ızgara yüzeyinde amorf karbonla kaplıdır.
Karbon filmin kırılması bazı durumlarda meydana gelirken, çok sayıda ızgara karesi bozulmamış ve bu nedenle negatif boyama amaçları için geçerlidir. Benzer şekilde, grafen oksit protokolü kullanılarak tüm ızgarada düzenli olarak iyi film kapsama alanı elde edilir. Grafen oksit ızgaraları hammaddelerden hızlı bir şekilde hazırlanabilir ve numunenin son derece koruyucudur.
Dondurmadan hemen önce grafen ıslak ve numune uygulamasını yerinde tutmak, kriyo-EM için uygun buz katmanları oluşturmak için yeterlidir. Bu protokol, grafen hidrofilik işlemek için ekipman gerektirmez ve numune geri kazanımı için bir avantaj sağlar. Destek yüzdürme bloğu, her kuyunun yerinde, gliserol gradyanlarından elde edilen numuneler için çok yararlı olan C2'de tampon uzatmaya izin veren iki iğne bağlantı noktasına sahiptir.
Yüzdürme bloğu, küçük hacimlerin kontrol edilebilir tampon akışının yanı sıra işlevselleştirilmiş destek filmlerini kullanarak şebeke benzeşimi saflaştırma yöntemlerinin araştırılmasını sağlamıştır.
