Elektron mikroskopisi analizi sıklıkla karmaşıktır. Protokolümüzün EM verilerinin büyük numune yüzeyinden ve orta hacimden işlenmesini ve edinimini kolaylaştırdığına inanıyoruz. Protokolümüz seri bölümlerde hedef yapıları bulmaya yardımcı olur.
Veri kaydı gerekli olanla sınırlıdır. Tam doku bloklarında veri toplama ile karşılaştırıldığında, kayıt süresi azalır ve veri analizi daha kolaydır. Yaklaşımın genel kolaylığı göz önüne alındığında, sadece bilimsel soruları değil, aynı zamanda bir tanı aracı olarak da kullanılabileceğine inanıyoruz.
Analiz için bir dizi oluşturmak için, önce numuneyi bir ultramikrotom tutucuya kelepçeleyin ve reçineyi numunenin etrafına kabaca kırpmak için bir jilet kullanın. Numuneyi ince kırpmak için bir elmas kırpma aracı kullanın ve bloğun üst ve alt yüzeylerinin bıçağın kesme kenarına paralel olduğundan emin olmak için 20 veya 90 derecelik eğimli kesme bıçakları kullanın. Ksilen ve tutkalları 3:1 oranında karıştırın ve karışımı kesilmiş bloğun üst ve alt kenarlarına uygulamak için kürdana bağlı bir kirpik kullanın.
Karışım kururken, bir gofret parçasını analiz için uygun boyuta kesmek için bir gofret sıkma aracı kullanın. Herhangi bir döküntünü durulamak için gofretleri damıtılmış suda temizleyin ve gofret kurudıktan sonra yüzeyi plazma ile temizleyin. Bir dizi tomografi bıçağı hazırlamak için, bir histo jumbo bıçağın altına bir iğne takmak için köpüklü yapışkan bant kullanın ve bıçağı ultra mikrotom tutucuya sıfır derecede yerleştirin.
Bıçağın kenarını blok yüzeyine paralel olarak ayarlayın ve kesilmiş bloğu kesit için hazır bir konumda bıçağın kenarına getirin. Temiz gofreti bıçak havzasına yerleştirin ve havzayı bıçak kenarı ile aynı seviyeye kadar suyla doldurun, ardından bıçağın elmas kenarının gerektiği gibi su eklemek veya çekmek için ekli şırınnayı kullanarak düzgün bir şekilde nemlendirmesine izin verin. Dizi bölümleme için mikrotomeyi 50 ila 100 nanometre kesme aralığına ve saniyede 6 ila 1 milimetre kesme hızına ayarlayın ve hedeflenen bir Z hacmini kaplayacak kadar uzun bir şerit elde etmek için bölümlere başlayın.
Blok boyutuna, dokunun homojenliğine ve reçine türüne bağlı olarak, şerit yaklaşık olarak düz olacaktır. Şeritleri bıçak kenarından ayırmak için kirpiğin temiz, yapışkan olmayan bir ucunu kullanın. Şeridi destek ortamının ortasına hafifçe taşımak için kirpik kullanın.
Gerekirse bölümü germek için kloroform veya ısıtma kalemi kullanılabilir. Gerdikten sonra, suyu boşaltmaya başlamak için şırınnayı geri çek. Daha hassas şeritler veya daha yavaş bir su geri çekilmesi için şırınnayı hortumdan ayırarak suyun damlamasını sağlar.
Su seviyesi gofret seviyesine ulaştığında, şeridi yavaşça havzanın ortasına itin ve kalan suyun tamamı havzadan tamamen çıkarılana kadar tahliyeye devam edin. Gofret temiz bir ortamda kurusun. Kurutma yaklaşık 30 dakika sürer.
Numune tamamen kuruduğunda, kir kirlenmesinden korumak için diziyi sıkıca kapatılan bir kutuya aktarın. Ve kutuyu en az 30 dakika boyunca 60 santigrat derecelik bir fırına yerleştirin. Gofretteki bölüm konumlarını gösteren SEM görüntülerinin genel bir haritasını elde etmek için, bölümler şeridini kapsayan bir SEM görüntüsü elde etmek için yerleşik optik kamerayı kullanın.
Mozaik oluşturmak için, örneğin kamera görüntüsünü tıklatıp sürükleyin ve otomatik alımı başlatın. Hedef yapıları bulmak için daha yüksek çözünürlükte genel bakışlar alın. Yalnızca birkaç bölümün görüntülenmesi gerekiyorsa, edinilen görüntüleri orijinal konumlarında görüntülemek için yakınlaştırılabilir görüntüleyiciyi kullanın.
Yüksek çözünürlükte görüntülenmesi gereken bir bölüm belirlendikten sonra, görüntüleme bölgesi oluşturmak için tıklatın ve sürükleyin, ardından Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Ayarları'nı seçin ve ayarları bir şablonda depolayın Özellikle küçük veya tespit edilmesi zor nadir olayları bulmak için, her 10. Ardından görüntüleri gözden geçirin ve ilgi çekici bölgeyi içeren bölümleri işaretleyin. 10'dan fazla ardışık bölüm elde etmek için, tüm bölümleri otomatik olarak bulmak için bölüm bulucuyu kullanın.
Genel bakış görüntüleri net ilgi alanları göstermiyorsa, bölümlerin daha yüksek çözünürlüklü görüntülerini alıp görüntüleri otomatik olarak oluşturmak ve almak için bölüm önizleme işlevini kullanın. En uygun görüntüleme ayarlarını belirlemek için mikroskop kontrol yazılımındaki canlı görüntülemeyi etkinleştirin ve ilgi çekici bir bölgeye gidin, ardından görüntüler net ilgi alanları gösterene kadar görüntüleme ayarlarını ayarlayın, ancak üreticinin yönergelerine göre aşırı uzun bir görüntü alımı olmadan. Görüntüleme bölgelerinin ardışık bölümlerdeki konumunu en iyi duruma getirmek için, ilgi alanı görüntüsüne yakınlaştırın ve kayıtlı bölüm konumlarının duyarlılığını artırmak için Konum İyileştirmeyi Başlat'ı tıklatın.
Görüntüleme bölgesi tanımlamak için, Alt tuşunu basılı tutarken herhangi bir bölümü tıklatıp sürükleyin ve açılır bağlam menüsünden Döşeme Kümesi Dizisi Oluştur'u seçin. Yazılım, bulunan veya daha önce işaretlenmiş tüm bölümlerde aynı göreli konumda görüntüleme bölgeleri oluşturur. Ardından her görüntü serisinde gerektiğinde piksel sayısı, piksel boyutu, döşeme düzeni ve piksel durma süresini ayarlayın.
Otomatik işlevi yapılandırmak için, gösterildiği gibi otomatik işlevler için ayrı bir görüntü serisi oluşturun ve görüntü serisini bölümde yüksek karşıtlık yapıları içeren bir konuma taşıyın. Görüntü serisini 1024 x 884 piksel olarak ayarlayın ve görüntü serisinde kullanılan en yüksek çözünürlüğe karşılık gelen bir piksel boyutu seçin. Otomatik işlevler listesinde Otomatik odaklama ve Otomatik damgalamayı kontrol edin.
Edinme sırası denetimlerinde İki Bölüm'ü seçin ve otomatik işlevin görüntüsünün listedeki ilk öğe olduğunu onaylayın, ardından görüntü alımını başlatmak için Tümlerini Al'ı tıklatın. Tüm görüntüleme serileri oluşturulduğunda ve ayarlandığında, seri bir iş kuyruğunda listelenir. Düşük çözünürlüklü alım, tek veya mozaik görüntüleme kullanılarak bölümün seçilen kısımlarına veya tüm bölüme manuel veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir ve ardından dikiş atılabilir.
Seçilen alandan görüntüler daha sonra mitokondri, çekirdek ve mikrovilliyi görselleştirmek için yüksek çözünürlüklü parametreler kullanılarak elde edilebilir, örneğin, çözümlenmiş mozaik haritaların otomatik olarak alınması seçildikten sonra, birkaç ilgi alanı kırpılabilir veya bölgeler içinde ek yerel görüntüleme alanları tanımlamak için kullanılabilir. Drosophila bağırsağındaki farklı özel hücre tipleri rastgele dağıtılsa da, görüntüleri tek bölümlerden veya seri görüntüler topluluğu olarak yüksek çözünürlüklü parametreler kullanarak taradıktan sonra görsel olarak ayırt edilebilirler. Hizalamadan sonra, yığınlar farklı yazılım çözümleri kullanılarak işlenebilir.
Dizi tomografi analizi, tek gofret üzerinde birçok sıralı bölüm oluşturulmasına ve genel ilgi alanlarını yerelleştirmek için düşük çözünürlüklü parametreler kullanılarak taranmasını sağlar. Bu alanlar, gelişmiş alım parametreleri kullanılarak daha fazla analiz için hedeflenebilir. Örneğin, notumdaki mitotik bölünmelerin ultra yapısal düzeyde lokalize etmesi kolay değildir, çünkü hücreler çekimser bölgeye göre nispeten büyüktür.
Ancak bu yöntem kullanılarak, 20 ila 40 bölümlük sıçramaların otomatik orta çözünürlüklü genel bakış görüntüleri, bölünen hücreleri yerelleştirmek için kullanılabilir. Dizi tomografi prosedürü daha basit bir elektron mikroskopisi veri analizi sağlar. İzleyicileri yenilenmede ustalaşmaya ve haritalarla ilgili iş akışına aşina olmaya yatırım yapmaya teşvik ediyoruz Deneyimlerimize göre, çok az araştırma konusu tüm hayvanların veya tüm organların ultra yapısal analizini gerektirir.
Yöntemimiz, hücrelerin ve dokulardaki etkileşim ortaklarının hızlı lokalizasyonuna yardımcı olur.
