Bu protokol, melanom metastazının aday düzenleyicilerinin in vivo etkilerini ve aynı zamanda diğer solid malignitelerin metastazını değerlendirmek için kullanılabilecek sürekli bir iş akışı içindeki bir dizi tekniği açıklamaktadır. Sistematik iş akışımızın temel avantajı, sağlam ve standartlaştırılmış in vivo modeller ve teknikler sayesinde verilerin tekrarlanabilirliğinin artmasıdır. Bu boru hattı, Omics verilerinden veya in vitro tahlillerden çıkarılan adayları in vivo bir ortamda test ederek hedef keşfi ve terapi geliştirme için bir yol sunar.
Bu protokolde sunulan tekniklerle ilişkili öğrenme eğrisi, sağlanan materyaller kullanılarak ve adımları uygularken ayrıntılı açıklama izlenerek kısaltılır. Prosedürün gösterilmesine yardımcı olmak, Preklinik Görüntüleme Çekirdeği'nde bir araştırma bilimcisi olan Orlando Aristizabal ve laboratuvarımda bir eğitmen olan Ran Moubarak olacak. İntradermal enjeksiyonlar için, aseptik koşulları korurken biyogüvenlik kabini içinde sekiz ila 10 haftalık bir fareyi anestezi altına alın ve tıraş edin.
Daha sonra cildi iğne bıçağının yörüngesine karşı geriye doğru kavrayın ve geri çekin ve altı milimetre uzunluğunda, 31 gauge insülin şırınga iğnesi kullanarak, eğim yukarı bakacak şekilde cildi keskin bir açıyla hafifçe delin. Kubbe şeklinde bir tekerlek gözlenene kadar tümör hücresi süspansiyonunun 30 mikrolitresini yavaşça enjekte edin. Tümör büyümesinin, kilo kaybının ve genel sağlık durumunun ilerlemesini izleyin.
Bu izleme seansları sırasında, kaliperlerle ölçümler yapın ve hacmi hesaplamak için tümörün uzunluk ve genişlik boyutlarını kullanın. İntrakardiyak enjeksiyonlar için, anestezi uygulanmış bir fareyi ultrason makinesinin ısıtılmış platformuna aktarın. Daha sonra hipoalerjenik bant kullanarak, fareyi burun konisine sabitleyin.
Toraksı düz bir tıraş bıçağı veya neşter bıçağı ile tıraş edin, 30 derecelik bir açıyla eğin ve prosedür alanının etrafındaki cildi% 10 povidon iyot ile temizleyin. Ardından, sol ventrikülün kesitsel bir görünümünü elde etmek için yönlendirilmiş yatay bir pencere yakalamak için ultrason probunu farenin sol tarafındaki toraksın ortasına yerleştirin. Probun uzun ekseni yukarı bakacak şekilde, probu 50 derecelik bir açıyla ve ısıtılmış platformu 20 derecelik bir açıyla sabitleyin, ardından probu ve destek çerçevesini pozisyonda kilitleyin.
Güvenlik kabininin içinde çalışırken, hücre süspansiyonunu 30 gauge bir inç iğne ile bir mililitrelik bir tüberkülin şırıngasında hazırlayın. Şırıngada bulunan hava kabarcıklarını çıkarın. Şırıngayı stereotaktik enjektöre kilitleyin.
Daha sonra ultrason rehberliğinde, iğneyi torasik duvardan kalbin sol ventrikülüne ilerletin ve tümör hücresi süspansiyonunun 100 ila 250 mikrolitresini yavaşça enjekte edin. Aşamalı hayatta kalma ameliyatı için, anestezi uygulanan fareyi ısınma pedine yerleştirin ve% 10'luk bir povidon iyot çözeltisi ile prosedür alanının etrafındaki cildi temizleyin. Steril kişisel koruma ekipmanı ve eldiven giydikten sonra, hayvanın vücudunun üzerine steril bir örtü koyun.
Daha sonra, İris makası veya neşter kullanarak, tümörün kenarından beş ila yedi milimetrelik bir rezeksiyon marjını koruyarak cildi kesin. İntradermal tümörler durumunda, tümörü çevresel cilt ile birlikte rezeke edin. Subkutan tümörler için, tümörü deri altında disseke edin ve çıkarın.
Tümör rezeksiyonundan sonra, yarayı dokuz milimetrelik zımbalama cihazıyla kapatın. İn vivo görüntüleme için, bir mililitre insülin şırıngası ve 28 gauge iğne ile intraperitoneal enjeksiyon yoluyla fareye d-luciferin substratı uygulayın, ardından fareyi uyuşturun ve biyolüminesans görüntüleme tarayıcısının içindeki bir burun konisine yerleştirin. Başlat'a basarak cihazı başlatın ve pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın.
Arka plan çıkarma için boş bir görüntü yakalamak üzere, edin'i tıklatın ve alma sırası tamamlandıktan sonra görüntüyü kaydedin. Veri analizi ve aynı in vivo görüntüleme yazılımı için, görüntülerin kaydedildiği klasöre gidin ve tek bir deneyden tüm farelerin görüntülerini açın. Birimleri ışımaya ayarlayın ve bireysel sinyalin gruplar arasında normalleşmesini engelleyeceğinden ilgili onay kutusunun işaretli olmadığından emin olun.
Daha sonra, ilgi alanı veya ROI çizim aracını kullanarak, beyin bölgesi için dairesel ROI'ler ve vücut için dikdörtgen ROI'ler çizin, beyin YG'sindeki kulakları ve burnu hariç tutun, çünkü spesifik olmayan parlaklık yayma eğilimindedirler. Önyargıyı en aza indirmek için, ışıldayan sinyal üst üste bindirilmemiş farelerin fotoğraflarına YG'ler çizin, ardından sinyali ölçmek ve verileri bir elektronik tabloya aktarmak için YG'leri ölç'ü seçin. İlgilenilen vücut bölgelerindeki toplam ışıldayan akıyı çizerek gruplar arasındaki farklılıkları analiz edin.
Yazılım kullanarak bir NuMA boyamasından sonra, diğer organ parankimi ve boş alanlar hariç, organ dokusundaki tüm NuMA boyalı hücreleri içerecek şekilde bir ROI çizin. Her organ için uygun pozitif ve negatif denetimleri kullanırken NuMA pozitif ve NuMA negatif hücrelerini kategorilere ayırmak için ayarları yapın. Her örnek için NuMA pozitif hücrelerinin toplam yüzdesi sayısını ölçmek için yerleşik bir yazılım algoritması kullanın.
Biyolüminesans, parlak alan, ex vivo floresan ve hematoksilin ve eozin boyama görüntüleri, aday genlerin melanom metastazı üzerindeki etkilerinin analizinde çok yönlü yaklaşımı göstermektedir. Fukoziltransferaz susturulması, melanom hücrelerinin metastatik yayılımını bozmuştur. Kontrol Linda virüsü ile enfekte olmuş melanom hücrelerinin NuMA lekeli akciğer bölümleri ve Linda virüsünü eksprese eden bir metastaz baskılayıcı ile burada gösterilmiştir.
Metastatik melanom hücreleri yeşil olarak etiketlenir ve organ alanı yeşil kapaklı bir çizgi ile sınırlandırılır. İntradermal enjeksiyonlar yaparken ciltte uygun gerginliği korumak, şırıngalar hazırlarken hava embolisinden kaçınmak ve hayvanın hareketine müdahale etmemesi veya yara komplikasyonlarına yatkın hale getirmemesi gereken yeterli rezeksiyon marjları elde etmek, başarı oranını ve tekrarlanabilirliği artırmaya yardımcı olur. İmmün filtrasyonu incelemek için multipleks görüntülemenin daha fazla kullanılması, gen ekspresyon analizi için tek hücreli RNA dizilimi ve mekansal transkriptomiklerin tümü, intratümöral heterojenliği incelemek için ücretsiz yollar sağlayabilir.
Bu protokolde açıklanan tekniklerin kombinasyonu, melanom beyin metastazında, melanom salgılanan amiloid beta'nın nöroinflamasyonu baskılamadaki ve beyin metastazını teşvik etmedeki rolü gibi yeni düzenleyicileri tanımlamamıza yardımcı oldu.
