ADH ve FAD, farklı uyarma ve emisyon dalga boylarında otofloresan sergileyen endojen moleküllerdir. Metabolik reaksiyonların ko-enzimleri olarak kullanılmaları nedeniyle, otofloresan mikroskobu hücresel metabolizmayı değerlendirebilir. NADH ve FAD'nin otofloresan görüntülemesi eksojen etiketler gerektirmez ve hücre altı çözünürlükte tahribatsız bir yöntemdir.
Otofloresan mikroskopisi canlı örneklerde ve zaman kursu çalışmalarında kullanılabilir. Otofloresan görüntüleme, herhangi bir canlı hücreye veya dokuya geniş çapta uygulanabilir. Otofloresan görüntüleme nöron, kanser hücresi, tümör, in-vivo, kök hücre ve bağışıklık hücrelerinde kullanılmıştır.
Prosedürü gösteren, Texas A & M Üniversitesi'ndeki Kantitatif Optik Görüntüleme Laboratuvarı'ndan yüksek lisans öğrencisi olan Linghao Hu olacak. Lazer kaynağı ve dedektörler de dahil olmak üzere çoklu foton floresan ömür boyu mikroskobunun tüm bileşenlerini açarak deneye başlayın. Numune yerleştirmeden önce, parlak alan lambasını açın ve ışığın göz merceğinin içine girdiğinden emin olun.
Ardından, hücre görüntüleme için bir hedef seçin. Bir hava hedefi kullanmıyorsanız, hedefin üzerine uygun daldırma ortamından bir damla uygulayın. Cam tabanlı kabı mikroskop aşamasındaki numune tutucuya yerleştirin.
Ardından, X/Y aşama kontrolünü kullanarak numuneyi hedefle ortalayın Numunenin güvenli olduğundan ve görüntüleme sırasında hareket etmeyeceğinden emin olun. İşiniz bittiğinde, göz merceğine bakın ve hücrelere odaklanmak için hedefi yukarı doğru hareket ettirin. Mikroskop bir mahfaza içindeyse, ışık kutusu kapağını kapatın.
Ardından, görüntü alma yazılımını açın ve çoklu foton görüntüleme parametrelerini makalede açıklandığı gibi ayarlamak için Çoklu Foton Görüntüleme sekmesine tıklayın. Dedektörün kazancını, floresan ömrü görüntüleme veya FILM için en uygun değere ayarlayın. Ardından, numunenin her pikselindeki lazer harcamasının bekleme süresini istenen değere değiştirin.
Nikotinamid adenin fosfat dinükleotid veya NADPH için, çoklu foton lazeri 750 nanometreye ayarlayın. Ardından, lazerin güç kontrolünün sıfıra ayarlandığını onaylayın, böylece lazer üzerindeki deklanşör açıldığında hücreler zarar görmez. Bir emisyon filtresini 400 ila 500 nanometreye ayarlayın.
Parametreler ayarlandığında, görüntü ayarlarını optimize etmek için odaklama veya canlı görüntü biçiminde görüntülemeye başlayın. Hücrelerin odaklandığından emin olurken lazer gücünü yavaşça üç ila sekiz miliwatt artırın. Ayarlandıktan sonra, kullanılan maksimum gücü kaydedin.
Petri kabının diğer segmentlerinde görüntüleme için kaydedilen maksimum güç ayarını kullanın. Görüntü entegrasyon süresi 60 saniye olan bir NADPH-FILM görüntüsü toplayın ve görüntünün, floresan ömrü bozunma eğrisi içindeki bir sitoplazma pikseli için 100 fotonun zirvesi gibi yeterli sayıda fotona sahip olup olmadığını kontrol edin. Foton sayısı çok düşükse, lazer gücünü veya görüntü alma süresini artırın.
Flavin adenin dinükleotid veya FAD, görüntüleme için, çoklu foton lazeri 890 nanometreye ayarlayın ve lazerin yeni dalga boyunda mod kilitlemesini bekleyin. Lazer için güç kontrolünün başlangıçta sıfıra ayarlandığından emin olun. Bir emisyon filtresini 500 ila 600 nanometre olarak ayarlayın.
Görüntü ayarlarını optimize etmek için, lazer gücünü 5 ila 10 miliwatt'a çıkararak ve kullanılan maksimum gücü kaydederek odaklama veya canlı görüntü şeklinde görüntülemeye başlayın. Sonraki görüş alanlarının FAD görüntülemesi için aynı güç ayarını kullanın. FAD-FILM görüntüsünü 60 saniyelik bir görüntü entegrasyon süresiyle toplayın ve görüntünün floresan ömrü bozunma eğrisi içinde yeterli foton olup olmadığını kontrol edin.
Foton sayısı çok düşükse, lazer gücünü veya görüntü alma süresini artırın ve görüntülemeyi, her görüntü iki FOV uzağında aralıklı olarak dört ila beş görüş alanı veya FOV için tekrarlayın. 80 milimolar sodyum siyanür çözeltisi yapmak için, 25 mililitre PBS içinde 130.24 miligram sodyum siyanür çözün. Kültür kabından, çanakta dört milimolar bir siyanür konsantrasyonu elde etmek için 100 mikrolitre sodyum siyanür çözeltisi ile değiştirmek üzere 100 mikrolitre kültür ortamını aspire edin.
Hücrelerin siyanür çözeltisi ile reaksiyona girmesine izin vermek için hücreleri beş dakika boyunca bir inkübatöre koyun. Siyanür maruziyetinden sonra, daha önce açıklandığı gibi hücrelerin NADPH ve FAD görüntülerini elde edin. Çalışma, üreden ölçülen cihaz yanıt fonksiyonunu veya IRF'yi kullanarak floresan ömür boyu parametrelerini hesapladı.
Parametrelerin, segmentasyon için kullanılan her hücrenin sitoplazmasının pikselleri boyunca ortalaması alındı. Arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için tek tek hücreler tanımlandı ve maskelendi. Daha sonra, çekirdek tanımlandı ve hücre maskesine yansıtıldı.
Ayrıca, hücreler, tipik hücrelerin boyutuna uymayan maskeli alanları çıkarmak için filtrelendi. NADPH ve FAD'ın çoklu foton floresan ömür boyu görüntülemesi, siyanür tedavisinden önce ve sonra hücre morfolojisinin ve metabolizmasının görselleştirilmesine izin verdi. Siyanür tedavisi ile NADPH ömrünün azaldığı, siyanür tedavisi sonrası FAD ömrünün arttığı gözlenmiştir.
Temsili kutu grafiği, MCF7 hücrelerinin optik redoks oranının siyanür işleminden sonra azaldığını göstermiştir. Siyanür maruziyeti, MCF7 hücrelerinin genlik ağırlıklı NADPH ömrünü azalttı. Kısa ve uzun ömürler NADPH için azaldı, ancak NADPH alfa biri için arttı.
FAD için, MCF7 hücrelerinin genlik ağırlıklı ömrü, siyanür maruziyetinden sonra artmıştır. Hem kısa hem de uzun ömürler FAD için arttı, ancak FAD alfa için azaldı. Numunelere giden yeterli lazer gücüne sahip olmak önemlidir, ancak unutmayın, çok fazla güç hücrelere zarar verebilir.
Otofloresan görüntüleme hücrelere zarar vermediğinden, aynı numunelerde sonraki biyokimyasal testler kullanılabilir.
