Bu çalışma, Avustralya Araştırma Konseyi Hibe DP0986937 tarafından desteklenmiştir.

Uygun kontrol maya suşları seçme Tahlil görsel maya vakuol kırmızı floresan birikimi değerlendiren deneyci dayanmaktadır. Bu testin öznel ve uygun kontrol suşları ve büyüme koşulları seçimi dayanmaktadır. Vahşi tip kontrol otofaji normalde beklenen düzeyde göstermek için kullanılır. Negatif kontrol olarak çekirdek otofaji genler (örneğin, ATG3) bir ifade için bir yük boş uygundur; bu suşları vakuol (örneğin, mitokondri, çekirdek) malzemenin teslim edemez 1. Plazmid DNA ile maya hücreleri Dönüşüm Maya hücreleri kolayca dönüşümü için yetkili LiAcetate ile tedavi yapılabilir. Ticari kitleri satın alınan (örneğin, EasyComp, Invitrogen) ve yayınlanan protokolleri mevcuttur 13 olabilir. Bu protokolde, vahşi tip suşu BY4741 (MAT his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) ve türetilen silme mutant (örneğin, atg3 Δ), zorunlu olmayan farklı bir genin her eksik ifade kapsamlı bir kütüphane bazı üyeleri kullanın . Silme suşu kütüphane Rosella tabanlı sensörler kullanılarak otofaji araştırmak için değerli bir araç temsil eder. Mt-Rosella 12: Bu protokol çalışan muhabir pAS1NB tarafından kodlanan mitokondri için mt-Rosella (Şekil 2A). Aşağıdaki adımları EasyComp Dönüşüm Kiti ve rahat kullanım için -80 ° C arasında dondurulup saklanan yetkili yapılan hücrelerin kullanımı dayanmaktadır. <ol><li> Çözüm III (EasyComp Dönüşüm Kiti) 30 dakika maya hücreleri eklemeden önce oda sıcaklığına kadar dengeye. </li><li> 2-2.5 ul: muhabiri kodlayan plazmid DNA (mt-Rosella pAS1NB) (~ 100 ng / ml), 1.7 ml steril bir ek kapaklı plastik mikrosantrifüj tüp ekleyin. </li><li> Yetkili maya hücreleri ve nazik bir pipetleme karışım taze çözülmüş süspansiyon 5 ul ekleyin. </li><li> 50 Solution III ul (EasyComp Dönüşüm Kiti) ve karıştırmak için vorteks ekleyin. 1.5), 28-30 ° C&#39;de 1 saat süreyle kuvvetli veya parmak ile el tüp Flicking tarafından her 15 dakikada bir vorteks karıştırıcı kullanılarak karıştırma dönüşüm reaksiyonları inkübe. </li><li> Dikkatli bir şekilde tek bir YMM agar büyüme metionin histidin ile takviye plakası ve urasil dönüşüm karışımı transferi ve hafifçe agar yüzeyine steril bir cam dağıtıcı ile çevresindeki hücreleri dağıtmak. Maya hücreleri bu aşamada kırılgan ve yumuşak taşıma transformants verimi artırabilir. </li><li> Büyüme plaklarının 28-30 ° C&#39;de 2 ila 4 gün veya koloniler, yaklaşık 2-3 mm çapında görüntülenir kadar inkübe edin. </li></ol> 2. Maya hücreleri Rosella ifade Onaylanması Ayrıntılı deneyler başlamadan önce, doğru yerelleştirme ve verimli bir şekilde ifade Rosella teyit edilmelidir. <ol><li> Steril kürdan kullanarak, her bir suş 5 ayrı steril 1,7 ml ek kapaklı plastik mikrosantrifüj tüp içinde steril su 50 ul dönüşüm plaka ve tekrar süspansiyon hücreleri tek koloniler için seçin. </li><li> 10 ayrı etiketli cam mikroskop slayt (76 x 26 mm) üzerine bir kare lamel (22 x 22 mm) ile her hücre süspansiyonu ul ve hücre süspansiyonu kapsamaz. </li><li> Hemen bir floresan mikroskop kullanılarak (örneğin, Olympus Fluoview FV500) floresans emisyon hücreleri inceler. Güçlü, yeşil ve kırmızı floresan ve mitokondriyal lokalizasyonu (Şekil 2B ve 2C) tipik etiketleme arayın. </li><li> Floresan Bu şekilde incelenen her koloninin kalan taze bir YMM büyüme plağı üzerine inoküle edilmelidir. </li><li> 2 gün boyunca 28-30 ° C&#39;de inkübe plakaları koloni kadar çapı yaklaşık 2-3 mm. </li></ol> 3. Hücre büyümesi ve otofaji indüksiyonu Otofaji sabit faz, karbon kaynağı, rapamisinin yönetim, ya da azot açlık değişim içine giriş de dahil olmak üzere farklı deneysel koşullar altında, bir numarasını kullanarak indüklenen olabilir. Biz rutin olarak azot açlık mitophagy ikna etmek için bir yöntem olarak kullanın. <ol><li> Büyüme orta ve uygun auxotrophic takviyeleri etanol içeren 10 ml tek bir koloni İnokülasyon. </li><li> Maya kültürleri, yaklaşık 48 saat boyunca yörünge sallayarak (200 rpm) 28-30 ° C&#39;de inkübe edin. Hücreler orta-log büyüme aşamasında olmalıdır. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 2.000 xg&#39;de santrifüj 1.7 ml steril ek kapaklı plastik santrifüj tüplerine yinelenen 1ml kültür örneklerinden Pelet hücreleri. Hücre pelletini bozmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. </li><li> Hücrelerin kalan m kaldırmak için santrifüj yoluyla takip tabanda 1 ml steril distile su ile üç kere yıkayınedium. </li><li> Üçüncü yıkama büyüme orta veya azot açlık orta 100 ml hücreleri tekrar süspansiyon sonra. </li><li> 10 ml taze büyüme orta veya 10 ml azot açlık orta içine yeniden süspanse hücreleri yeniden aşılamak. Mitophagy indüksiyonu izin 6-12 saat yörünge sallayarak inkübe edin. Sonra açlık floresan mikroskobu ile görüntülemek için hücreleri hazırlarlar. </li></ol> Not: CMAC-Arg vakuol Etiketleme Testin ilk kurarken vakuol Rosella, floresan mikroskop teslim altında onaylamak için yararlıdır. Maya vakuol büyük bir organel olan konumu genellikle vakuol parçalanmış ve bulmak zor olabilir, maya bazı suşları ve bazı büyüme koşulları altında iletilen ışık görüntü, referans kolayca tespit edilebilir olmasına rağmen. Vakuol kolayca CMAC-Arg (7-amino-4-chloromethylcoumarin, L-arjinin amid) gibi kumarin tabanlı bir vakuol boya kullanarak etiketli olabilir. Vakuol parlak mavi floresan etiketleme boya sonuçları vakuoler proteazların eylem. Mavi emisyon Rosella 11, kırmızı ve yeşil emisyon kolayca ayırt edilebilir. CMAC-Arg Etiketleme rutin olması gerekmez, ama maya vakuol konumunu ve görünümünü aşina olmayanlar için tavsiye edilir. 4. CMAC-Arg vakuol Etiketleme <ol><li> Önce görüntüleme büyüyor veya azot-starved hücrelerin CMAC-Arg (100 mM son konsantrasyon) ekleyin. CMAC-Arg çözümü önceden hazırlanmış, ancak çözüm ışığa duyarlı olduğu gibi ışığa maruz kalmaktan korunması gerekir. </li><li> 28-30 ° C&#39;de 30 dakika süreyle (200 rpm) ile yörünge sallayarak inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 2.000 xg&#39;de santrifüj Pelet hücreleri. </li><li> Süpernatantı atın. </li><li> Steril distile su ile hücreler üç kez yıkayın, artık orta ve aşırı CMAC Arg boya kaldırmak için santrifüj yoluyla takip tabanda. </li><li> Aşağıda anlatıldığı gibi görüntüleme için hücreler monte edin. </li></ol> 5. Konfokal lazer tarama mikroskopisi için Montaj canlı maya hücreleri (CLSM) <ol><li> 70 ° C&#39;de inkübe büyüme orta ve azot açlık orta ayrı 1 ml alikotları 2 mg düşük erime noktası agaroz eritin Erimiş agaroz 70 korunur ° C </li><li> Yavaşça pelet oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 2.000 xg&#39;de santrifüj hücre ve her hücre kültürü 1 ml alikotları süpernatantlar atmak. </li><li> Hücreler adım 5.2 &#39;de tabanda ve santrifüj 1 ml steril distile su ile üç kez yıkayın. </li><li> 100 ul steril distile su ile yıkanmış hücreleri tekrar </li><li> Erimiş agaroz hücreleri nokta 20 ul etiketli cam mikroskop lamı (76 x 26 mm) üzerine monte etmek için. </li><li> Hemen agaroz yatağa yıkanmış hücre süspansiyonu 10 nokta ul. </li><li> Agaroz yatak lamel (22 x 22 mm) ile kaplayın. Hücreler lamel altında agaroz yüzeyine yayılmış. </li><li> Lamel dehidrasyon ve görüntüleme sırasında hareket etmesini önlemek için dikkatle oje ince bir film tabakası ile lamel kenarlarında mühür. </li><li> Oje tamamen kuru olduğunda (10 dk) slayt floresan mikroskopi sakının görüntülemek için hazırdır: oje mikroskop hedeflerine zarar verebilir. </li><li> Hücreler, bu tekniği kullanarak montaj sonrasında 1 saat kadar görülebilir monte edilebilir. </li></ol> 6. CLSM kullanarak görselleştirme otofaji Hücrelerden oluşan bir nüfus otofaji düzeyi rutin olarak önce kırmızı vakuoler floresan gösteren hücrelerin sayısını belirleyerek ve otofaji indüksiyonundan sonra değerlendirilir. İdeal otofaji ilerlemesini otofaji indüksiyon (Şekil 3) seçilen zaman noktalarında izlenir. Bu en iyi mikroskop dürbün aracılığıyla görselleştirme yapılır. Bu doğru kontroller istihdam (örneğin, Δ atg3 mutant) ve mikroskop ayarları farklı örnekleri (örneğin, nötral yoğunluk filtreleri, filtre seçimi kullanımı) gözlemleyerek arasında değişmeden kalması olduğunu önemlidir. GFP ve / veya pHluorin (yeşil floresan emisyon) (FITC filtresi) ve DsRed.T3 (kırmızı ayrı bir görünüm için uygun uyarma / emisyon filtresi ile donatılmış kaliteli bir floresan mikroskobu (örneğin, Olympus Fluoview FV500) gerektiren maya hücreleri nispeten küçük floresans emisyon) (TRITC filtre). <ol><li> Dönüşümlü FITC ve TRITC filtreleri kullanarak non-starved vahşi tip hücrelerin 60x su objektif bir bakış açısı kullanma. Vahşi tip hücrelerin mitokondri hem de kırmızı ve yeşil floresan gösteren hücrelerin çevresindeki tipik bir hücresel dağılımı göstermelidir. Mitokondri bu dağıtım pinh bağımlı olduğunu unutmayınkonfokal mikroskop ole ayarı. Biz genellikle sadece mitokondri, vakuol 12 gizlenmiş değildir hücre periferinde lokalize (Şekil 2C) nokta bir dizi olarak dikkat edilmesi gereken, 125 mm, daha düşük bir iğne deliği değer kullanın. Yüksek bir iğne deliği değeri (200 mm) ise, bu tipik ipliksi mitokondriyal ağ 11 uyulması gereken (ve uğrar değişiklikleri) hücre boyunca dağıtılan sağlar. Hücre yok diğer yapılar floresan ile işaretlenmiş olmalıdır. </li><li> Sırayla açlık orta transfer her zaman puan hücreleri görmek. Yeşil ve kırmızı emisyon filtreleri kullanarak dönüşümlü olarak gözünüzde canlandırın. 6 saat açlık süresi noktası kırmızı floresan, ancak hiçbir karşılık gelen yeşil emisyon vakuol ayırt edilebilir olmalıdır. Vakuoler yerelleştirme ayrı CMAC-Arg (Şekil 2C) kullanarak teyit edilebilir. View ~ 200 hücre ve vakuol (yani mitokondri vakuoler alımı) sadece kırmızı floresan gösteren sayısını. </li><li> &gt; 200 hücre ve sonra arsa vakuoler birikimi gösteren hücrelerin yüzde gözlemleyerek tüm zaman noktalarında vakuoler birikimi güvenin. </li><li> Mt-Rosella ifade açlıktan önce ve 6 saat açlık otofaji-negatif kontrol hücreleri inceleyin. </li></ol> 7. Temsilcisi sonuçları: Burada, vahşi tip ve Δatg3 mutant hücreler ifade mt-Rosella kullanarak elde edilen sonuçlar göstermektedir. Karbon kaynağı olarak etanol ile büyüyen koşullar altında, vahşi tip ve Δatg3 mutant hücreler hem hücresel tipik bir floresan maya hücreleri mitokondri (kırmızı ve yeşil) bir dağılım göstermesi. Kırmızı ve yeşil floresan emisyon vakuol (Şekil 2B ve 2C) tespit değildir. 6 saat ve azot açlığa maruz kaldığında (Şekil 2B; Şekil 3) sonra ötesinde, mitokondri ile ilgili kırmızı ve yeşil floresan ek, vahşi tip hücrelerin de kırmızı birikimi sergilemek, ama vakuolar lümen yeşil floresan . Ancak, Δatg3 mutant hücreler ne kırmızı ne de yeşil floresan vakuolar lümen (Şekil 3 Şekil 2C) birikir. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Top, maya hücre organelleri ve bölmeler şeması. Alt, bir maya hücresidir bir vakuol-merkezli bir bakış, farklı organelleri ve bölmeler otofajik bozulması belirten sunulmaktadır. Otofaji (örneğin, mitophagy, nucleophagy) çeşitli organel belirli türleri arasındaki bazı farklılıkları yuttu içeriğinin özgüllüğü (kargo seçim), çeşitli hücre içi ihtiyaçlarını ve ekstrasellüler ipuçları (örneğin, açlık, hasar), belirli sinyaller, ATG genler ve zaman bağımlılık. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2a.jpg" alt="Şekil 2a" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2b.jpg" alt="Şekil 2b" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2c.jpg" alt="Şekil 2c" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2d.jpg" alt="Şekil 2d" /> Şekil 2. (A) mt-Rosella şematik gösterimi. Mitokondriyal lideri dizisi (sitrat sentaz Bu durumda) mitokondrial matriks Rosella biyosensör hedef kullanılır. Uyarma ve kırmızı floresan proteini (DsRed.T3) ve yeşil floresan protein (pHluorin) için emisyon maxima gösterilir. Yüksek pH (mitokondriyal pH ~ 8.2) biyosensör sadece kırmızı fluoresces düşük pH (vakuolar pH ~ 5.5), ancak, kırmızı ve yeşil fluoresces ifade vahşi tip ve Δ atg3 mutant hücreler beklenen sonuçlarla (B) şematik mt-Rosella (C) yabani yetişen altında tipi hücreleri ve azot açlık koşulları CLSM tarafından Gerçek sonuçlar elde edilmiştir. Soldan sağa: DIC (kontrast farkı), TTT (DsRed.T3) floresans emisyon, GFP (pHluorin) floresans emisyon CMAC-Arg floresans ve birleştirme görüntü (D) Gerçek sonuçlar altında Datg3 mutant hücreler için floresan mikroskobu ile elde büyüyen ve azot açlık koşulları. Soldan sağa: DIC (kontrast farkı), RFP (DsRed.T3) floresans emisyon, GFP (pHluorin) floresans emisyon CMAC-Arg floresan ve birleştirme görüntü. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3, 48 saatlik bir süre boyunca vakuol kırmızı floresan gösteren mt-Rosella ifade ve azot açlık altında yetişen vahşi türü ve Δ atg3 mutant hücreler, yüzdesi . Kırmızı floresan birikimi vakuol gösteren hücrelerin yüzde 0, 6, 12, 24 ve 48 saat azot açlık başlamadan sonra kaydedildi.

<ol>
	<li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease.">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+mechanisms+and+signaling+pathways+of+autophagy.">Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).</li><li>Kroemer, G., Mari&#241;o, G., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+the+integrated+stress+response.">Autophagy and the integrated stress response.</a> Mol Cell. 40, 280-293 (2010).</li><li>Camougrand, N., Kissov&#225;, I., Salin, B., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+mitophagy+in+yeast.">Monitoring mitophagy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).</li><li>Yen, W. L., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+live+long+and+prosper:+autophagy,+mitochondria,+and+aging.">How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging.</a> Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).</li><li>Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy.">Mitophagy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).</li><li>Bhatia-Kissov&#225;, I., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+in+yeast:+actors+and+physiological+roles.">Mitophagy in yeast: actors and physiological roles.</a> FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).</li><li>Kanki, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+mitochondria+autophagy+in+yeast.">The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast.</a> Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).</li><li>Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm38+protein+depletion+causes+loss+of+mitochondrial+K+/H++exchange+activity,+osmotic+swelling+and+mitophagy.">Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy.</a> Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).</li><li>Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+organelle+turnover+in+yeast+using+fluorescent+protein+tags.">Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags.</a> Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).</li><li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosella:+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast.">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4, 205-213 (2008).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li></ol>

Şekil sunulan temsili görüntüler. 2B ve 2C açıkça organel özel floresan gazetecilere ve floresan mikroskobu kullanımı, büyüyen ve azot hasret hücreler hem de mitokondriyal yerelleştirme / dağıtım kanıt sağlar ve görüntülenebilmekte mitophagy sağlar olduğu görülebilir . Bu yöntem aşağıdaki mitophagy sınırlı olmadığını vurguladı olmaktır. Diğer hücre bileşenleri ya da organelleri (örneğin, ribozom, lipid damlacıkları, peroksizomlara, endoplazmik retikulum ve çekirdek) otofaji uygun etiketleme ile izlenebilir. Rosella biyosensör yapısı, hücre kültürü koşullarında ve çekirdeğin cirosu (nucleophagy) için tipik sonuçlar yöntemin geniş bir uygulama gösteren 11,12 bildirilmiştir. Izleme otofaji organel özel floresan gazetecilere kullanımı, yapı tasarımı bazı noktalar akılda tutulmalıdır gerektirir. Bunlar: (1) organel özel hedefleme ulaşmak için uygun bir hedef sinyal seçimi ve füzyon; uygun bir floresan protein (ler) (2) seçim (3) güçlü floresans emisyon; (4) doğru organel yerelleştirme ve / veya hücre içinde dağılımı. (3) sonra organel özel muhabiri başarıyla düşünceler haline ikinci bir grup zorlanma seçilen maya konak ifade edilmiştir: (2) hücre numune hazırlama (1) maya büyüme koşulları görüntüleme parametreleri parametreleri seçtiği önemlidir. CLSM (örneğin, lazer yoğunluğu, tarama hızı ve modu, iğne deliği değeri, zoom değeri, kullanılan hedefleri veya CCD kamera için pozlama kontrolü (büyüyen hücreleri) ve açlıktan örnekleri arasında karşılaştırmalar yapılabilir emin bir deney boyunca devam); ( 3) vakuol içine muhabir otofaji indüksiyon ve başarılı teslimat. Genel olarak, bu floresan mikroskopi yöntemi nispeten hızlı, kolay ve düzenliyor veya otofaji modüle genler için yeni ilaçlar geliştirmek veya inhibe otofaji ve yüksek verimlilik tarama için potansiyel uygulama.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Saccharomyces cerevisiae EasyComp Dönüşüm Kiti </td><td> Invitrogen </td><td> K5050-01 </td></tr><tr><td> Maya azot temel amino asitler ve amonyum sülfat olmadan </td><td> BD Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Düşük erime agaroz </td><td> Progen Biosciences </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Mikroskop slaytlar (76 x 26 mm) </td><td> Menzel-Gläser </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop lamelleri (22 x 22 mm) </td><td> Menzel-Gläser </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu Fluoview FV500 </td><td> Olympus </td><td></td></tr><tr><td> CMAC-Arg </td><td> Moleular Problar-Invitrogen </td><td> Y-7531 </td></tr></tbody></table> Aksi belirtilmedikçe verilen tüm konsantrasyonlarda, w / v. Maya minimal orta (YMM):% 0.67 maya azot temel amino asitler,% 2 glukoz,% 1.5 agar (yalnızca katı ortam yaparken eklendi) ve istenilen auxotrophic takviyeleri (% 0.01)] olmadan. Saccharomyces Tuzlar (SS): (NH 4) 2 S0 4,% 0.12; KH 2 PO 4,% 0,10; MgC1 2 .6 H2O,% 0.07; NaC1,% 0.05; CaCl2,% 0.01, FeC1 3, 0.0005%. Büyüme orta: SS ve% 2 etanol (v / v) ve uygun auxotrophic takviyeleri. Azot açlık orta:% 0.17 maya azot temel amino asitler ve amonyum sülfat (Difco),% 2 etanol (v / v) olmadan.

a fluorescence microscopy assay for monitoring mitophagy in the yeast saccharomyces cerevisiae

Otofaji bir dizi farklı koşullar altında hücresel bileşenleri ciro için önemlidir. Bu, önemli bir homeostatik fonksiyonunun yanı sıra, hedef ve seçici organelles1-4 olmak üzere hücresel malzeme düşürebilir bir kalite kontrol mekanizması hizmet vermektedir. Örneğin, hasarlı veya mitokondri gereksiz (Şekil 1), otofaji, hücresel homeostaz ve hücre sağkalım için bir tehdit temsil edebilir atılmazsa. Maya, Saccharomyces cerevisiae, besin yoksunluk (örneğin, azot açlık) ya da hasar mitophagy 5-9 olarak adlandırılan bir süreç otofaji mitokondri seçici ciro teşvik edebilir. Otofaji değerlendirmek için basit bir floresan mikroskopi yaklaşım açıklar. Netlik için yaklaşım, maya hücreleri mitophagy izlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için buraya açıklamasına kısıtlamak. Tahlil, pH-duyarlı yeşil flüoresan protein bağlantılı bir pH-kararlı kırmızı floresan proteini içeren bir çift emisyon biyosensör bir floresan muhabiri, Rosella, yararlanır. Bu muhabir operasyon, canlı hücrelerde vakuol (pH ~~ 5.0-5.5) ve mitokondri (pH ~ 8.2) arasında pH farklılıkları dayanmaktadır. Büyüyen koşullar altında, vahşi tip hücrelerin mitokondri bir şekilde karakteristik dağıtılan iki kırmızı ve yeşil floresan sergilerler. Floresans emisyon vakuol ile ilişkili değildir. Azot açlık, kırmızı ve yeşil floresan mitokondri etiketleme yanı sıra, mitophagy indükler bir durum tabi, hücrelerin mitokondri, vakuol teslim temsil asidik vakuoler lümen, kırmızı birikimi sergiler, ancak yeşil olmayan floresan. Kırmızı hücrelerin puanlama, ancak yeşil olmayan floresan Vakuollerin, hücrelerin 5,10-12 mitophagic aktivitesinin bir ölçüsü olarak kullanılabilir .

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Bozulma ve geri dönüşüm için maya vakuol asidik lümen organelleri teslim izlemek için sağlam bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış çift emisyon floresan pH biyosensör ve floresan mikroskobu kullanarak tek tek hücrelerin görselleştirme hedef organellerin özel etiketleme dayanmaktadır.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

a-fluorescence-microscopy-assay-for-monitoring-mitophagy-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

25.3K Görüntüleme.  Monash University. Bozulma ve geri dönüşüm için maya vakuol asidik lümen organelleri teslim izlemek için sağlam bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış çift emisyon floresan pH biyosensör ve floresan mikroskobu kullanarak tek tek hücrelerin görselleştirme hedef organellerin özel etiketleme dayanmaktadır.

Video: A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Diseksiyonu Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biyoloji

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).