Bu yöntem, glikojen parçacıklarının yapısal organizasyonlarının daha iyi anlaşılmasını sağlar. Bu önemli bir konudur, çünkü zincir uzunluğu dağılımı olarak adlandırılan Glukan zincirlerinin popülasyonu, glikojen parçacıklarının fiziksel kimyasal özelliklerini belirler. Suda çözünürlük gibi.
Bu tekniğin en büyük avantajlarından biri, floresanın Glukan zincir uzunluğuna bakılmaksızın sabit olmasıdır. Glukan tarafından bağlanan sadece bir APTS molekülü vardır. Bu nedenle, floresan yoğunluğu, Glukan zincirlerinin sayısı ile doğru orantılıdır.
Yardımcı kılcal elektroforez alanı, glikojen metabolize edici enzimlerin tıbbi mekanizmasını çözmek için uygundur. Örneğin, enzimlerin dallanmasıyla kabul edilen Glukan üzerine aktarılan Glukan zincirlerinin polimerizasyon derecesini belirleyebiliriz. Reaksiyon koşullarda yapılmalıdır.
Bu nedenle, bölgeler nemden korunmalıdır. Saflaştırılmış glikojen mililitresi başına 200 mikrolitre 0.5-2 miligram ile 200 mikrolitre 100 asetat tamponu pH 4.8 ile karıştırın. 2 mikrolitre İzoamilaz ve 1.5 mikrolitre Pullulanaz ekleyin.
Yukarı ve aşağı pipetle çekerek hafifçe karıştırın. Daha sonra 1,5 mililitrelik bir tüpte 16 saat boyunca 42 santigrat derecede inkübe edin. 5 dakika boyunca 95 santigrat derecede inkübe ederek reaksiyonları durdurun.
16'da santrifüj, 100 kez G'oda sıcaklığında 5 dakika boyunca peletlemek ve çözünmeyen herhangi bir malzemeyi çıkarmak için. Süper bakımı bir pipetle çıkarın ve yeni açıklamalı tüplere aktarın. Reçine boncuklarını boş mikro füj tüpüne ekledikten sonra, 100 mikrolitre anyon katyon değişim reçinesi boncuklarına eşdeğer ekleyerek süpernatantların tuzunu çözün ve çalkalayın.
Pipetleme yaparak numuneleri toplayın ve yeni açıklamalı tüplere yerleştirin. Numuneleri dondurarak kurutun. Kurutulmuş numuneleri oda sıcaklığında veya 20 santigrat derecede saklayın.
Kurutulmuş numuneleri 2 mikrolitre 1 molar sodyum Siyanoborohidrit ve Tetrahidrofuran ve 2 mikrolitre 8 amino 1-3-6 piren trisülfonik asit ile karıştırın. Karanlıkta 16 saat boyunca 42 santigrat derecede inkübe edin. Her numuneye 46 mikrolitre ultra saf su ekleyin.
Numuneleri 50 kez seyreltmek için, 100 mikrolitrelik mikrovaçlarda 49 mikrolitre ultra saf suya bir mikrolitre numune ekleyin. Vortekste iyice karıştırmak için. Yüzü ayarlarken örnekleri karanlıkta 5 ila 10 dakika bekletin.
Ters polarite elektroforezi gerçekleştirmek için, yöntemi ayarlayın, enjeksiyon basıncını inç kare başına 0,5 pound kuvvete ayarlayın. Ardından polariteyi ayırma için ters moda ayarlayın. N'ye bağlı karbonhidrat ayırma tamponunu ultra saf suda üçte birine kadar seyreltin.
APTS etiketli Glukanlar ayırma işlemini seyreltilmiş tamponda 30 kilovoltta çıplak kaynaşmış silika kılcal damarda gerçekleştirin. Ardından enjeksiyon süresini ayarlayın ve analize başlayın. Sırasıyla elektroferogram profilini ve entegrasyon verilerini içeren ASC ve CDF dosyalarını dışa aktarın.
ASC dosyasını açın ve zaman çizelgesine göre göreceli floresan birimini çizin. CDF dosyasını açın. İlk otomatik entegrasyon ile devam edin ve aşağıdaki parametreleri vadiden vadiye entegrasyon ve minimum alan ile ayarlayın.
Herhangi bir yanlış entegrasyon olayını manuel olarak kontrol edin ve düzeltin. 4.13 ila 4.67 dakika arasında gözlenen floresan sinyalleri, reaksiyona girmemiş APTS'den kaynaklanmıştır. Maltoheksaose DP 6 etiketli Aleut zamanının 8.49 dakika olduğu tahmin edilmektedir.
Sığır glikojen Glukanları etiketli APTS, DP 6'nın Aleut zamanına dayanarak tanımlanmıştır. Glikojen debranching enzimleri ile inkübe edilmeyen kontrol örneğinde serbest Maltooligosakkarit izi tespit edilmedi. İç panel, 44 DP'ye kadar Glukan zincirlerinin ayrılmasını gösterir. Zincir uzunluğu dağılımı, her DP için DP yüzdesi olarak gösterilir. Ortalama zincir uzunluğu, her bir yüzde zincir çarpısının toplanmasıyla hesaplandı Karşılık gelen polimerizasyon derecesi.
Yüz analizi, en bol glukanların Maltoz ve tavşan karaciğeri, istiridyede Maltoheksaz ve sığır karaciğerinde Maltoheptaoz olduğunu göstermiştir. Yabani tip ve mutant Siyanobakteriyel suşlardan arındırılmış glikojen zincir uzunluğu dağılımları yüz analizi kullanılarak belirlendi. Çıkarma analizleri, vahşi tipteki her DP'nin yüzdesinin, mutantların her bir DP'sinin yüzdesinden çıkarılmasıyla gerçekleştirildi.
Yabani tipten ve Synechocystis mutantlarından glikojen ortalama zincir uzunluğu dağılımları, her CLD için gözlemlenen maksimum zirveye göre normalleştirildi. Bu teknik, glikojen metabolizmasındaki bir kusurla ilişkili insan hastalıklarının, özellikle de anormal glikojen parçacıklarının hücrelerde birikmesinden zengin sonuçlar alan Andersen hastalığı hastalığının daha iyi anlaşılmasını sağlar.
