Bu konkanavalin A bazlı in vitro sedimantasyon testi, glukan fosfatazların farklı STA substratlarına karşı bağlanma afinitesini ölçmek için tasarlanmıştır. Bu yöntemden elde ettiğimiz bilgiler, glukan fosfataz enzim ailesini anlamamız için temeldir. Karbonhidrat protein etkileşimleri nispeten zayıftır, bu nedenle mevcut yöntemler glukan fosfataz ve glukan etkileşimlerini tespit edememektedir.
Lektin bazlı kosedimantasyon testimiz, milimolar aralıktaki bağlanma afinitesini tespit edebilir. SEX4 mutantlarının ve glukan fosfataz enzim ailesinin diğer üyelerinin karakterizasyonu, bu tahlilin protein karbonhidrat etkileşimlerini ölçme yeteneğini göstermektedir. Tahlilin en zorlu kısımlarından biri, substratın konsantrasyon aralığını optimize etmektir.
Bir fikir edinmek için daha geniş bir aralıkla başlamanızı ve ardından belirli bir aralık için daraltmanızı öneririz. Başlamak için, pipet 250 mikrolitre ConA-sefaroz boncuk süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne sıkıştırır. İçeriği 10.000 G'de dört santigrat derecede 30 saniye boyunca santrifüj edin.
Süpernatanı attıktan sonra, 250 mikrolitre ConA-sefaroz boncuk içeren her tüpe 750 mikrolitre bağlama tamponu ekleyin. Tüpleri 10.000 G'de dört santigrat derecede bir dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra, iki mililitre seyreltilmiş amilopektin çözeltisi serisi yapmak için çözünür amilopektin çözeltisinin iki kat seyreltilmesini hazırlayın.
ConA-sefaroz amilopektin boncuklarını hazırlamak için, 250 mikrolitre ConA-sefaroz boncuk öndengelenmiş ve bağlayıcı tampon içeren tüplere her seyreltilmiş amilopektin çözeltisinden 250 mikrolitre ekleyin. İçeriği iyice karıştırın ve tüpleri karşılık gelen amilopektin konsantrasyonu ile etiketleyin. Tüp içeriğini 30 dakika boyunca dört santigrat derecede dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin ve tüpleri bir dakika boyunca 10.000 G'de santrifüj edin.
250 mikrolitre ConA-sefaroz amilopektin boncuğunu, 10 mikrogram nişasta fazla dört veya SEX4 proteini, 10 milimolar ditiyotreitol ve 10 mikromolar proteaz inhibitörü kokteyli içeren 100 mikrolitre bağlayıcı tamponla karıştırın. İçeriği yumuşak bir rotasyonla 45 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra tüpleri bir dakika boyunca 10.000 G'de santrifüj edin ve süpernatantın 50 mikrolitresini yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice pipetin.
Toplanan süpernatant fraksiyonların 50 mikrolitresini içeren her tüpe 20 mikrolitre 4X SDS sayfa boyası ve 10 mikrolitre damıtılmış su ekleyin ve bunları S olarak etiketleyin.Benzer şekilde, yıkanmış ConA-sefaroz amilopektin SEX4 boncukları içeren tüplere 20 mikrolitre 4X SDS sayfa boyası ve 80 mikrolitre damıtılmış su ekleyin. Boya ve su ekledikten sonra, tüm numuneleri 95 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. ConA-sefaroz amilopektin SEX4 boncukları bir dakika boyunca 10.000 G'de santrifüj edildikten sonra, süpernatantı kaydedin ve S olarak etiketlenmiş bağlanmamış protein numunelerinin 40 mikrolitresini, en düşük substrat konsantrasyonundan en yükseğe kadar% 4 ila% 12 prekast poliakrilamid jel kuyucuğuna P.Load olarak etiketleyin ve bir protein moleküler ağırlık belirteci için ilk şeridi ayırın.
P.Add etiketli glukan bağlı protein numunelerini yüklemek için ikinci bir jel kullanın Cihazın her iki odasına taze hazırlanmış SDS sayfası çalışma tamponu ekleyin ve jeli 35 dakika boyunca veya boya cephesi jelin dibine ulaşana kadar 150 voltta çalıştırın. Daha sonra jel kasetini cihazdan alın ve batı leke analizi için jeli ayırmak için ara parçaları ve cam plakaları çıkarın. 5.8 gram tris baz, 2.9 gram glisin, 0.37 gram SDS ve 200 mililitre metanol içeren bir litre transfer tamponu yapın.
Boyuttan ayrılmış proteinleri poliakrilamid jelden bir nitroselüloz membranına aktarmak için, süngerleri, filtre kağıtlarını, jeli ve nitroselüloz membranını Batı transfer protokolüne göre birleştirin ve bir saat boyunca 70 voltta çalıştırın. Jeli çalıştırdıktan sonra, spesifik olmayan protein bağlanmasını önlemek için nitroselüloz zarını% 1 ila% 5 sığır serum albümini veya süt proteini protein çözeltisi içinde 50 mililitre TBST tamponunda bir saat boyunca inkübe edin. Herhangi bir bağlanmamış blokaj çözeltisini çıkarmak için TBST tamponunu kullanarak membranı üç kez yıkayın.
Daha sonra, histidin etiketli proteine özgü seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz bağlı antikor ile zarı bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, bağlanmamış antikorları çıkarmak için zarı TBST tamponunda üç kez yıkayın. Dijital görüntüleme için, her biri 1.5 mililitrelik bir tüpte 750 mikrolitre olan kemilüminesan substrat çözeltilerinin eşit parçalarından oluşan bir çözelti yapın ve membranı çözelti içinde en az beş dakika boyunca inkübe edin.
Membran proteinini leke tarayıcısına yan yana yerleştirin ve hem pelet hem de süpernatant fraksiyonlarındaki proteini ölçmek için edinme yazılımını çalıştırın. Verileri elde etmek için, leke tarayıcı ile edinme yazılımını kullanarak nicel sinyal ölçümlerini başlatın. Süpernatant ve pelet fraksiyonlarındaki tüm kantitatif ölçümleri yüklenen toplam proteine normalleştirin.
Doygunlaştırıcı bağlanma deneyinde, amilopektin konsantrasyonuna karşı bağlı protein yüzdesini çizin ve ayrışma sabitini hesaplamak için veri analiz yazılımı kullanarak verileri sığdırın, Kd.SEX4'ün ConA-sefaroz amilopektin boncuklarına bağlanma kapasitesi SDS sayfası kullanılarak analiz edildi. Pelet fraksiyonunda SEX4 proteini ve süpernatant fraksiyonda sığır serum albümininin varlığı kaydedildi. Önemli ölçüde azaltılmış glukan bağlanma kabiliyetine sahip bilinen bir SEX4 mutantı olan W278A, süpernatant fraksiyonunda ortaya çıktı ve bu tahlilin yararlılığını ve özgüllüğünü gösterdi.
Batı lekeleme analizi, SEX4'ün tespitinde önemli bir artış olduğunu ortaya koymuştur ve yöntem, bir uç terminal histidin etiketi ile glukan fosfatları tespit etmek için spesifiktir. Kosedimantasyon testi üç farklı SEX4 konsantrasyonunda test edildi. Kemilüminesans tespiti yoluyla görselleştirmek için iki mikrogram SEX4 yeterli olsa da, beş veya 10 mikrogram SEX4 kullanmak daha doğru algılamaya izin verir.
Ayrıca, artmış amilopektin konsantrasyonu ile artmış SEX4 bağlanması kaydedildi. Amilopektin ve SEX4 vahşi tip proteinin farklı konsantrasyonlarda bağlanma afinitesi belirlendi ve spesifik bir bölge bağlama modeline bağlı protein yüzdesi verileri, mililitre başına yaklaşık 1.03 miligramlık bir Kd verdi. Laforin, LSF2, mısır SEX4 ve patates SEX4'ün patates amilopektinine karşı bağlanmasını ölçmek için bu yöntemin uygulanabilirliği değerlendirildi.
Sonuçlar, tarımsal açıdan önemli mahsullerden elde edilen test edilen proteinlerin de amilopektin'e farklı şekilde bağlandığını göstermiştir. Pelet ve süpernatant fraksiyonlarındaki tüm kantitatif ölçümlerin yüklenen toplam proteine normalleşmesini hatırlamak çok önemlidir. Tüm amilopektinin boncuklara bağlandığından emin olmak için, daha sonra derin glikoz tahlilini gerçekleştirmek için süpernatant fraksiyonları kaydedin.
Glukan fosfataz, karbonhidratları bağlamak, bulmak ve fosforilatmak için farklı mekanizmalar kullanır. Bu yöntem, glukan fosfatazın pozisyona özgü defosforilasyon için büyük polimerik kompleksler içindeki farklı yapısal alanlara bağlanmasının araştırılmasına izin verir.
