Dijital Uzamsal Profil Oluşturma veya DSP, uzamsal olarak katmanlaştırılmış protein niceliği için etkili bir yöntem sunar. Uygulanması, bir tümörün ve mikro çevrenin farklı bölgelerinde protein ekspresyonunu karakterize etmemizi sağlar. DSP'nin önemli bir özelliği, yüksek verimli veri işlemeyi mümkün kılan çoklama yeteneğidir.
Özelleştirilmiş ilgi alanlarını tanımlama yeteneği ayrıca veri analizine uzamsal bir boyut sağlar. DSP, mekansal olarak ölçülen proteinin veya RNA ekspresyonunun patolojik veya fizyolojik bir süreci aydınlatmaya yardımcı olabileceği herhangi bir numuneye uygulanabilir. Bu, özellikle bölgesel hedef değişkenliğinin malign büyüme veya istila ile ilişkili olabileceği onkolojide geçerlidir.
Prosedürü gösteren, bir histoteknoloji uzmanı olan Scott Palisoul ve genomik bir teknoloji uzmanı olan Rachael Barney olacak. Slaytları hazırlamak için, her biyopsiden birkaç iki milimetrelik çekirdek alarak ve bunları tek bir doku mikroarray bloğuna koyarak başlayın. Bloktan dört mikronluk kesitler kesin ve bunları cam slaytlara monte edin.
Her slaytı slayt tutucu contanın içine yerleştirin ve 30 dakika boyunca 60 santigrat derecede inkübe edin. Yarı otomatik IHC sisteminde, kabı birinci konumda slayt başına 150 mikrolitre yıkama tamponu ve beş mililitre ölü hacimle doldurun ve kapağı açık bırakın. Aynı miktarda blokaj çözeltisini ikinci pozisyondaki kaba doldurun.
Reaktif kabı tepsisini makineye yükleyin. IHC'yi İşle'yi ve ardından İşaretçi alanının açılır kutusunda çözüm adını engelleyerek seçin. Tüm slaytlar için bittiğinde, Kapat'a tıklayın.
Ardından Etiketleri Yazdır'a tıklayın ve Tüm slayt etiketleri henüz yazdırılmadı seçeneğini işaretleyin ve ardından Yazdır'a tıklayın. Slaytların üst kısımlarına etiketler yapıştırın. Slaytları slayt tepsisine yükleyerek numunenin ve etiketin yukarı bakmasını sağlayın.
Tepsiyi indirmek için LED düğmesine basın ve cihazın slaytları taramaya ve tanımaya başlamasına izin verin. Denemeye başlamak için Başlat düğmesine tıklayın. Çalıştırma tamamlandığında, yeşil renkte yanıp söndüğünde LED düğmesine basın.
Tepsiyi cihazdan çıkarın ve kapak karolarını her slayttan dikkatlice kaldırın. Slaytları 1X fosfat tamponlu salin içine yerleştirin. Fazla tamponu çıkarın ve hidrofobik bir bariyer oluşturmak için her doku bölümünü hidrofobik bir kalemle ana hatlarıyla belirtin.
Slayt başına her antikorun sekiz mikrolitresini ekleyerek ve 200 mikrolitrelik son hacme ulaşmak için Tampon W kullanarak bir antikor PC oligo çözeltisi yapın. Daha sonra antikor PC oligo solüsyonunu slaytlara uygulayın ve slaytları gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, slaytları nemlendirilmiş bir tepsiye yerleştirin ve 1X TBST'de 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleme sonrası, ardından 1X TBST'de beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca SYTO 13 nükleer lekesi ekleyin, ardından 1X TBST ile iki kez yıkayın. Fareyi Denetim Merkezi'ndeki Veri Toplama'nın üzerine getirin ve Yeni'yi veya Çalışmaya Devam Et'i seçin.
Slaytı, etiketi kullanıcıya doğru olacak şekilde slayt tutucuya yerleştirin. Kızak tepsisi kelepçesini indirerek dokunun uzun pencerede görülebilmesini sağlayın. Altı mililitre Buffer S.Kontrol Merkezi'ndeki istemleri izleyin.
Tarama için bir bölgeyi tanımlamak üzere x ve y kaydırıcılarıyla farklı eksenler arasında yakınlaştırma yapın. Tara'yı seçin ve tanımlanan hedef alanın tamamı görüntülenene kadar taramanın devam etmesine izin verin. 20 kez görüntü oluşturun.
Her doku çekirdeği için 250 mikrometre çapında eşit büyüklükte üç dairesel YG seçerek yatırım getirilerini tanımlayın. Tarama Çalışma Alanından Çık düğmesine tıklayarak YG'leri onaylayın. Daha sonra UV ışığının oligoları antikorlardan ayırmasını bekleyin.
Temizleme cihazı işlemini tamamladıktan sonra, geçerli slaytlara veya plakaya devam etmek için Yeni Veri toplama'yı seçin. Plaka simgesi alanına çift tıklayarak son halini alan plaka penceresini açın. Hibridizasyon kodu paketi lot numarasını girin ve Güncelle'ye tıklayın.
Ardından Sonlandır'a tıklayın. İstemleri izleyerek slayt tutucuyu ve toplama plakasını çıkarın. Slaytları TBST'de saklayın veya uzun süreli depolama için sulu bir ortamla örtün ve fişi örtün.
Plakaları geçirgen bir conta kullanarak kapatın ve aspiratları 65 santigrat derecede termal bisikletçide üstleri açık olacak şekilde kurutun. Yedi mikrolitre dietil pirokarbonatla işlenmiş su ekleyin ve karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından hızla aşağı doğru dönün.
Metin protokolünde açıklandığı gibi denklemi uygulayarak uygun prob R ve prob U denklemlerini seçerek prob tampon karışımını hazırlayın. Her hibridizasyon kod paketine 84 mikrolitre prob tampon karışımı ekleyin. 96 delikli yeni bir hibridizasyon plakasında, belirtilen sıranın 12 kuyucuğunun tümüne her bir hibridizasyon kodu ana karışımından sekiz mikrolitre ekleyin.
DSP toplama plakasından yedi mikrolitreyi hibridizasyon plakasındaki ilgili kuyuya aktarın. Isıl yapışma, plakayı döndürün ve gece boyunca 67 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, plakayı buz üzerinde soğutun ve hızlı bir dönüş yapın.
Her bir kuyucuktan hibridizasyon ürünlerini bir şerit tüpte toplayın ve her bir kuyuyu beş kez hafifçe pipetleyin. Aşağı doğru çevirin ve şerit tüplerini analiz sistemine yükleyin. DSP cihazında, CDF dosyasını bir USB sürücüsüne kaydedin ve verileri dijital analizöre aktarın.
Ekranda, İşlemi Başlat'a basın. Yüksek Duyarlılık'ı ve ardından İleri'yi seçin. Örnekli kuyu sayısı için Tümünü Seç'e, ardından Son'a ve ardından e-posta bildiriminde İleri'ye basın.
Ardından Başlat'a tıklayın. Hazırlık istasyonu tamamlandıktan sonra, kartuşu kapatın ve dijital analizöre aktarın. Saymaya başla'ya basın.
Sahne Alanı Konumu'nu seçin. Mevcut CDF dosyasını yükle'ye basın ve önceden yüklenmiş dosyayı seçin. Bitti'ye basın.
Sahne Alanı Konumu'nu tekrar seçin, programı çalıştırmak için Bitti'ye ve ardından Başlat'a basın. Muhabir sayısı dönüştürme dosyalarının ZIP dosyasını analiz sisteminden bir USB sürücüsüne kaydedin. Sürücüyü DSP makinesine takın.
DSP Denetim Merkezi'nde, fareyle Veri Toplama'nın üzerine gelin ve ardından Hesapları Yükle'ye tıklayın. İlgili ZIP dosyasını seçin. DSP Kontrol Merkezi'ndeki Kayıtlar'a tıklayın.
Kuyruktaki taramaları görüntülemek için Seçili Tadımları Kuyruğa Ekle'yi ve ardından Analiz Kuyruğum'u seçin. Kontrol Merkezi'ndeki Veri Analizi seçeneğinin üzerine gelerek Kuyruktan Yeni Etüt'ü seçin. DSP deneyi glioblastoma örnekleri üzerinde gerçekleştirildi ve sonuçlar bir ısı haritası olarak görselleştirildi.
Satırlar protein hedeflerini temsil eder ve her sütun bir ilgi alanına karşılık gelir. İfade düzeyi, düşük ifade gösteren maviden yüksek ifadeyi gösteren kırmızıya kadar değişen bir renk aralığıyla gösterilir. Üst üste rengin değişkenliği, bölgesel protein heterojenliğini yansıtır ve diferansiyel protein ekspresyonu ile olası bir mekansal ilişki olduğunu gösterir.
Bu deneyde, S100 ve CD-56 evrensel olarak yüksekti, çünkü bunlar nöral belirteçlerdi. En fazla değişkenliğe sahip belirteçler, tümör proliferasyonu, migrasyon ve metastaz ile ilişkili olduğu bilinen B7-H3, KI-67, CD-44 ve fibronektini içerir. DSP, çok çeşitli aday hedeflerden, önemli bölgesel farklılıklar sergileyenleri belirleyebilir.
Bu, değişkenlikle ilişkili faktörleri ve bunların hastalıkla olan ilgilerini araştırmak için temel oluşturur.
