İki boyutlu hücre kültürleri in vivo tümör büyümesini yeterince taklit etmez. Geliştirmek için, 3D prosedürleri küresel kullanılarak geliştirilmiştir. Bizim 3D glioblastoma spheroid tabanlı test özellikle sağlıklı beyin tümörü ortamına beyin tümörü invazyonu araştırmak için uygundur.
Üç boyutlu kültür modelleri, çok hücreli bir mimariyi, heterojenliği ve tümörlerin metabolik durumunu özetlemek için kullanılabilir ve ilaç etkilerinin daha sıkı bir şekilde değerlendirilmesine olanak sağlar. Kuyunun dibine dokunmamaya veya süpernatantı tamamen çıkarmamaya, jeli buzda tutmadığından ve hücreleri hızlı bir şekilde jele eklemeye özenli bir şekilde. Düzgün büyüklükte tümör spheroidleri üretmek için, ilk PBS beş mililitre ile ilgi tümör hücre kültürünü yıkayın ve dissosiasyon enzim0.5 ile bir mililitre ile hücreleri tedavi.
37 santigrat derecede beş dakika sonra, pbs dört ila 4,5 mililitre ile reaksiyonu durdurmak ve tam büyüme orta 10 mililitre içeren 15 mililitre konik tüp içine müstakil hücreleri aktarın. Sayma sonra, bir kez 10 tam büyüme orta sekiz mililitre başına altıncı hücrelere bir kez yeniden askıya 2% metilselüloz konsantrasyonu iki mililitre ile takviye ve steril bir sistem konteyner süspansiyon transfer. Daha sonra 96-iyi yuvarlak alt plaka her kuyuya hücrelerin 100 mikrolitre ekleyin ve 37 derece santigrat içine plaka yerleştirin 5% 5 karbondioksit inkübatör 3-dört gün.
Bir invazyon tayini yapmak için, tümör hücreleri düzgün büyüklükte küresel ler oluşturduğunda, her hücre yapısını 500 mikrolitrelik bir tüpe aktarın ve küresel leri 200 mikrolitre PBS ile bir kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, taze hazırlanmış kollajen matris 100 mikrolitre içine dikkatle sferoidler aktarın ve düz bir alt 96-iyi plaka her kuyunun merkezine her küresel süspansiyon ekleyin. 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir kuluçkadan sonra, her kuyudaki jelin üzerine 100 mikrolitre tam büyüme ortamı ekleyin.
Tümör hücre invazyonunun en iyi görüntülenmesi için tüm küreseloidleri her kuyunun merkezine yerleştirdiğinden emin olun. Bir göç tayini gerçekleştirmek için, tümör hücreleri düzgün büyüklükte sferoidler oluşturduğunda, 37 santigrat derecede 30 dakika büyüme ortamı matrigel mililitre başına 0,2 miligram ile altı iyi bir plaka kat. Kuluçka sonunda, Matrigel kaldırmak ve her iyi tam büyüme orta iki mililitre ekleyin.
50 mikrolitrelik hacimlerde yuvarlak alt plakadaki küresel leri altı kuyulu plakanın tek tek kuyularına aktarın ve plakayı 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Ertesi gün, 37 santigrat derece 30 dakika boyunca Hoechst mililitre başına 10 nanogram ile küresel leke. Bir istila veya göç çıktıktan sonra görüntü edinimi için, plakayı bir video kamera ile donatılmış bir Brightfield konfokal mikroskobun sahnesine yerleştirin ve uygun deneysel dönemde görüntüler elde edin.
Görüntüleri yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için görüntüleri Fiji'ye aktarın ve Eklentiler, Makrolar, Etkileşimli Yorumlayıcı'yı tıklatın. Uyarlanmış mor döngüyü kopyalayıp yapıştırın. Mor cümleler tutun ve gerektiği gibi ilgi yeşil cümleler ekleyin.
Daha sonra her küresel oidin alanını ölçmek için Analiz et ve Ölç'ü tıklatın. Küresel yapının farklı alanlarında hipoksi ölçmek için, hipoksik aktiviteyi belirlemek için karbonik anhidraz IX boyama kullanılabilir. Bu temsili analizde, daha karbonik anhidraz IX pozitif hücreler küresel merkezde gözlendi.
Küresel çekirdekte bulunan hipoksik hücreler çekirdeği çevreleyen hücrelerden daha glikolitik olma eğilimindedir. Mitokondri daha fazla analiz için elektron mikroskobu ile görüntülenebilir. Küresel çap doğrudan 3D hücre yapısını oluşturan hücrelerin yoğunluğu ile ilişkilidir ve Fiji makroları her küresel oid içindeki hücrelerin çoğalmasını, istilasını veya göçlerini veya her küresel oidiçindeki hücrelerin göçlerini ölçmek için kullanılabilir.
Küresel çekirdekteki artışlar hücre çoğalmasının uyarılmasını yansıtır. Mitokondriyal solunum zincirinin Kompleks I'inin inhibisyonu üzerine, mitokondrideki ATP üretiminin büyük çoğunluğu 72 saat sonra %20 oranında çoğalmayı azaltır. Hidrojen klorür tedavisi 24 saatlik bir süre içinde kollajen tip I işgali artırır ama tedavi edilmemiş küresel kontrol göre 1.5 kat küresellerin göç alanını azaltır.
Canlı görüntüleme ile değerlendirildiği gibi, küreseller yüksek iç dinamikleri göstermek ve hızlı hareket. Küresellerin boyutu nispeten düzgün olmalı ve en iyi görüntüleme sonuçları için kuyuların merkezine spheroids işlemek için bakım alınmalıdır. Bu yöntem aynı zamanda tümör hücre çoğalması, göç ve ölüm yanı sıra ekstrasellüler matriks, hücre reseptörleri veya ilgi hücre içi proteinlerin ekspresyonu araştırmak için kullanılabilir.
Spheroidler de kapsüllenmiş olabilir ve artan hücre yüzey gerilimi etkisi kapsüllerin kaldırılması üzerine araştırılabilir.
