Alzheimer hastalığının teşhisi için amiloid plaklar gereklidir. Ancak, bunlar yeterli değildir. Bu gerçeğe rağmen, kısmen içeriklerini karakterize etmedeki zorluklar nedeniyle esrarengiz kalırlar.
Protokolümüz, amiloid fibrilleri yüksek saflıkta izole etmede oldukça etkilidir ve yapı ve bileşimin ince ayrıntılarını anlamak için çok uygundur. Amiloid plakların protein içeriğini bilmek, birikimlerini geciktirebilecek, engelleyebilecek veya önleyebilecek terapötik müdahalenin hedeflerini belirlemeye yardımcı olabilir. Bu nedenle, hastalığın başlangıcını geciktirmek.
Bu yöntem, dejenere olmuş beyin dokularından protein birikintilerini ve diğer farklı protein yolaklarındaki protein agregalarını çıkarmak için çok uygundur. Yeni hazırlanmış buz gibi soğuk homojenizasyon tamponunda altı ila sekiz seramik boncuk içeren iki mililitrelik bir tüpe taze disseke edilmiş veya çırpılmış dondurulmuş bir beyin dokusu bölgesi yerleştirerek başlayın. Daha sonra 30 saniyelik iki döngü açma ve kapama darbesi ile 4.000 rpm'de bir boncuk değirmeni homojenizatörü kullanarak dokuyu öğütün.
Şimdi bir mililitre beyin dokusu homojenatına ve 15 mililitrelik bir tüpe dokuz mililitre buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu ekleyin ve laboratuvar balmumu film şeritleriyle kapatın. Sağlam çözünürlük sağlamak için, tüpün gece boyunca dört santigrat derecede dönmesini sağlayın. Ertesi gün, doku ekstresi süspansiyonuna 1.2 mol'lük son konsantrasyona katı sakkaroz ekleyin.
İyice karıştırın ve santrifüj, dört santigrat derecede 45 dakika boyunca 250.000 x g'ye sahipti. Süpernatanı attıktan sonra, peleti 1.9 molar sakkaroz içeren iki mililitre homojenizasyon tamponunda, dört santigrat derecede 45 dakika boyunca 125.000 x g'de tritürasyon ve santrifüj yaparak yeniden askıya alın. Santrifüjlemeden sonra, üst beyaz katı tabakayı taze bir tüpe aktarın ve birkaç kez yukarı ve aşağı okşayarak bir mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponunu çözün.
Pelet ayrıca amiloid fibrilleri ile zenginleştirildiğinden, sulu orta tabakayı atın ve daha yüksek bir verim için peleti üst tabaka ile birleştirin. Kombine fraksiyonları 8.000 x g'de dört santigrat derecede 20 dakika boyunca santrifüj yapın. Süper natantı attıktan sonra, peleti bir mililitre buz gibi soğuk sindirim tamponunda yeniden askıya alın ve bir girdap üzerinde üç saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Numuneyi tekrar santrifüj edin, ardından peleti bir mililitre buz gibi soğuk Tris tamponunda iki kez yıkayın ve tekrar santrifüj yapın. İkinci yıkamadan sonra, peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek bir mililitre çözünürizasyon tamponunda yeniden askıya alın ve tüpü dört santigrat derecede 60 dakika boyunca 200.000 x g'de hızlı bir şekilde santrifüj edin. Peletten tasarruf edin, ardından süpernatana 50 milimolar Tris tamponu ekleyerek sakkaroz konsantrasyonunu 1.3'ten bir azı dişine düşürün.
Süpernatantı tekrar santrifüj edin, ardından hem peletleri hem de %0,5 SDS içeren 100 mikrolitre Tris tamponunu çözün. Amiloid saflaştırması için, 20 döngü boyunca bir banyo sonikasyon cihazında ultrason dalgaları kullanarak amiloid bakımından zengin peletleri çözün, ardından malzemeyi dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 20.000 x g'de hemen santrifüj edin. Peleti 500 mikrolitre% 0.5 SDS Tris tamponunda yeniden askıya alın ve yıkamayı dört kez daha tekrarlayın, Son santrifüjleme adımından sonra, peleti 200 mikrolitre ultra saf suda yıkayın ve kalan deterjanı çıkarmak için dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 20.000 x g santrifüj yapın.
Arıtılmış amiloid fibriller içeren son peleti 100 mikrolitre ultra saf suda çözün. Saflaştırılmış 100 mikrolitre amiloid fibrilini 400 mikrolitre metanol ve vorteks içinde iyice çözün. Daha sonra 100 mikrolitre kloroform ve vorteks ile tekrar karıştırın.
Ardından, 300 mikrolitre ultra saf su ve vorteksi iyice ekleyin. Oda sıcaklığında iki dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjlemeden sonra, protein pulunu içeren arayüz tabakasını bozmadan üst sulu tabakayı dikkatlice çıkarın ve aynı miktarda metanolü tekrar ekleyin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın, süpernatantı atın ve peleti hava ile kurutun.
Sindirim için, peleti 50 mikrolitre guanidin hidroklorür tamponunda çözün ve buz gibi soğuk su banyosunda sonikat yapın. Daha sonra oda sıcaklığında 45 dakika ila bir saat boyunca iyice vorteks, 50 mikrolitre% 0.2 yüzey aktif madde çözeltisi ekleyin ve 60 dakika daha tekrar vorteks yapın. Daha sonra, bir mikrolitre 500 milimolar TCEP ekleyin ve 60 dakika boyunca inkübe edin.
Daha sonra iki mikrolitre 500 milimolar iyodoasetamid ekleyin ve karanlıkta 20 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, iyodoasetamid'i 15 dakika boyunca beş mikrolitre TCEP çözeltisi ile söndürün. Daha sonra, guanidin konsantrasyonunu 1.5 mol'e düşürmek için tüpe gerekli hacimde 50 milimolar amonyum bikarbonat çözeltisi ekleyin.
Ayrıca, tüpe % 1 yüzey aktif madde çözeltisi ekleyin. Daha sonra tripsin ekleyin ve tüp karışımını gece boyunca 37 santigrat derecede bırakın. Ertesi gün, pH'ı 2.0'a düşürmek için sindirilmiş peptit çözeltisine formik asit ekleyin, ardından 200 mikrolitre% 50 metanol çözeltisi ekleyerek ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca 1500 x g'de eğirerek C18 spin kolonunu aktive edin.
Daha sonra, C18 kolon reçine yataklarını 200 mikrolitre denge tamponu ekleyerek ve iki dakika boyunca tekrar döndürerek dengeleyin. Dengelemeden sonra, asitleştirilmiş peptit çözeltisini C18 kolonuna yükleyin ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj yapın. Akışı yeniden yükleyin, sütunu döndürün ve ikinci akışı atın.
Daha sonra C18 reçinesine bağlı peptitleri yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. 40 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyerek ve kolonu santrifüj ederek peptidi üç kez süzün. Peptitleri, sulu çözeltiyi buharlaştırarak hızlı bir vakum yoğunlaştırıcısında kurutun.
Kuru peletler, MS analizinden önce birkaç hafta boyunca 20 santigrat derecede saklanabilir. Saflaştırılmış amiloidlerin Kongo kırmızısı boyaması, SDS'de çözünür fraksiyona kıyasla amiloid fibrillerinin zenginleşmesini belgeliyor. SDS'de çözünür fraksiyon amiloidlerin varlığını göstermedi.
Saflaştırılmış fibrillerin yapısı, neredeyse saf amiloid fibrillerinin varlığını doğruladı. Ayrıca, immünogold etiketleme amiloid beta-42 peptitlerinin varlığını doğruladı. Anti-amiloid beta-42 ve anti-fibril antikorlar kullanılarak yapılan boyama, fibrillerde göreceli olarak amiloid beta-42 peptidlerinin bolluğunu göstermiştir.
Saflaştırılmış amiloid fraksiyonları yaklaşık 250 proteinin varlığını gösterirken, ultrasonikasyon ve SDS yıkamadan önce toplanan fraksiyon 2.500'den fazla protein içeriyordu. Fibril çekirdekleri, membrana bağlı olmayan organel ve supramoleküler komplekslerle ilişkili proteinlerin zenginleştiğini gösterdi. Amiloidler düşük bolluk türleridir, belki de birkaç pikogram ila birkaç mikrogram beyin dokusu başına birkaç mikrogramdır.
Bu yüzden katmanları, paletleri toplarken veya süpernatanı atarken çok dikkatli olmanız gerekir. Bu tekniğin geliştirilmesiyle, artık ilk amiloid tohumlarıyla ilişkili proteinleri daha güvenle tanımlayabilir, yapılarını karakterize edebilir ve terapötik müdahale için onları hedefleyebilirsiniz. Bu nedenle, bu ölümcül hastalığın başlangıcını önlemek.
