Bu çalışma LABEX MemoLife tarafından ve ARSEP tarafından desteklenmiştir (Fondation la recherche sur la sclérose tr plaklar à l&#39;aide dökmek)

1. Çözüm ve Malzeme <ol><li> Izolasyon kabı çözümleri hazırlayın: B1, HBSS 150 ml HEPES 1 M, 1.5 ml ekleyin; B2, 20 B1 ml dekstran 3,6 g ekleyin; B3, B1, 100 ml BSA 1 g ekleyin. </li><li> Üst vidalama kısmı kapalı altını keserek filtre yuvasını değiştirin. </li><li> Immüno-çözümleri hazırlayın: sabitleme çözeltisi, PBS pH 7.4 içinde% 4 paraformaldehit; Permeabilization / bloke etme çözeltisi,% 5 keçi serumu sulandırarak PBS pH 7.4 içinde% 0.25 Triton X100 ile. Not: Sabitleme kullanılan birincil antikor tipine bağlıdır. </li></ol> 2. Diseksiyon Not: gemiler hücre kültürü amacıyla kullanılır sürece Steril koşullar gerekli değildir. <ol><li> B1, 20 ml bir 150 ml&#39;lik beher hazırlayın. Buz üzerinde tutun ve hava kirliliğini önlemek için parafilm ile kaplayın. </li><li> Derinden int eklenir saf İsofluranın 1 ml batırılmış küçük bir kağıt havlu ile bir başlık altında fare uyutmakKafesi o. Anestezi bir ayak tutam tepki eksikliği tarafından doğrulanmadı. Servikal dislokasyon ile fareyi öldürmek. Not: Bu adımlar, ulusal ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilir. </li><li> İsteğe bağlı: Kan içeriği 24 ortadan kaldırmak için, PBS 1x 20 ml intrakardiyak perfüzyon gerçekleştirin. </li><li> Bölüm burun boyun bir neşter ile cilt ve uzak çekin. PBS 1x tüm kirletici tüyleri temizleyin. </li><li> Kafatası açmak için, öncelikle koku ampul öne makas yerleştirin ve iki bölümden kafatası yırtılması için makas açın. </li><li> Dikkatle beyin spatula ile beyin kaldırmak. Onlar kan damarı hazırlık 38 kontamine gibi lateral ventriküllerin koroid pleksus parçalara ayır. NOT: İsteğe bağlı: son hazırlık parankimal ve meninks damarları içerecektir. İstenen değilse, beyin zarları 38 tarafından tarif edilen prosedür takip soyulabilir olabilir. </li><li> TrBuz üzerinde B1 çözeltisi içeren beher içine beyin ansfer. 8 adede kadar beyinleri bir araya tedavi edilebilir. </li></ol> 3. Beyin Dokusu Homojenizasyon <ol><li> İki neşter kullanarak elle ve şiddetle ardından yaklaşık 2 mm küçük parçalar elde B1 çözeltisi içinde beyin yendi. </li><li> 400 rpm&#39;de 20 vuruş gerçekleştiren, bir otomatize Dounce homojenleştirici ile hazırlık homojenize. Cam tüp buz ve hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için, yukarı ve aşağı hareket olduğunda douncer üst kısmı çözelti içinde olduğu muhafaza emin olun. Birkaç örnekler hazırlanır, her homojenizasyon ile iyonize su ile douncer yıkayın. </li></ol> 4. Gemi saflaştırma <ol><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 2000 g&#39;da santrifüj bir 50 ml plastik tüp içine Homojenat aktarın ve devam edin. Hiçbir perfüzyon yapıldı eğer bir büyük beyaz bir arayüz (çoğunlukla miyelin) damar pellet (kırmızı üstünde oluşturacak). </li><li> Süpernatantı atın. Damar pelet ve beyaz arayüz birlikte takılı kalacaktır. Buz soğukluğunda B2 çözeltisi 20 ml ilave edilir ve 1 dakika boyunca elle ve kuvvetlice tüp sallayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 4400 g&#39;de ikinci bir santrifüj işleminden geçin. Miyelin artık süpernatan yüzeyinde yoğun beyaz bir tabaka oluşturacak. </li><li> Dikkatle tüpü tutarak ve yavaşça süpernatant duvarları boyunca geçmesine izin çevirerek tüp duvarlarından miyelin tabakası ayırın. Süpernatant ile miyelini atın. Damarları ihtiva eden topak tüpün altındaki bağlı kalır. </li><li> 5 ml&#39;lik plastik pipet etrafına sarılmış bir emici kağıt ile tüpün iç duvarını kurulayın ve kalan tüm sıvılar kaldırmak, damar pelet dokunmaktan kaçının. Kalan sıvıyı boşaltmak için emici kağıt üzerinde tüp ters tutun. </li><li> Düşük bağlayıcı uçları, hesabı ve hesap ile pipetleme aşağı buz soğukluğunda B3 çözeltisi 1 ml pelet Askıdabuz tüpü ng sonra B3 çözeltisi başka bir 5 ml ekleyin. Gemiler mümkün olduğu kadar disperse edilir ve agregatları oluşturmaz emin olun. </li></ol> 5. Filtrasyon <ol><li> Buz soğukluğunda B3 çözeltisi 30 ml buz üzerinde bir beher hazırlayın. Hava kirlenmesini önlemek için parafilm ile kaplayın. </li><li> Bir Becker şişenin üstüne bir tadil edilmiş filtre tutucusu üzerinde 20 mikron gözenekli bir filtre yerleştirin ve buz soğukluğunda B3 çözeltisi 10 ml uygulayarak denge. </li><li> Filtre üzerinde damar hazırlanmasını dökün ve buz soğukluğunda B3 çözeltisi 40 ml damarları yıkayın. </li><li> Temiz forseps kullanarak filtreyi kurtarma ve hemen B3 solüsyon içeren beher içinde bırakın. Hafifçe sallayarak filtreden gemileri ayırın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 2000 g&#39;de 50 ml plastik tüp ve santrifüj kabı içeriği dökün. </li><li> Not: Alternatif olarak, aşama 4,6 beyin gemilerinin süspansiyon 100 mikron mesh filtre üzerine filtre edilebilir.Akış daha sonra, yukarıdaki gibi bir 20 um-gözenekli filtre üzerinde filtre edilmektedir mikrodamarlar (özellikle kılcal damarlar), içerir ise, bu durumda, daha büyük bir gemi, tercihen filtre üzerinde tutulur. </li><li> Buz soğukluğunda B3 çözeltisi 1 ml mikrodamarlar pelet yeniden süspanse edin ve 1.5 ml Eppendorf tüp içine pipetleme aktarın. 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 2000 g&#39;de santrifüjleyin. </li></ol> 6. Sabitleme, Permeabilization ve Engelleme <ol><li> 1.0 ml düşük bağlanma ucunu kullanarak PBS içeren 0.2 ml PCR tüpleri içine pipetleme Transferi gemiler. Onlar ucu dış kısmına bağlı olabilir damarları dokunmadan dikkatli olun. Binoküler mikroskop altında aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> Aşağıdaki orta değişikliklerin her biri için, gemiler dibe ulaşana kadar buz üzerinde tüpler bırakın ve uzun ve bir şey jel yükleme pipet ipuçlarını kullanarak sıvıların çoğu pipetle. </li><li> PBS en çıkarın ve tespit edici çözeltisi 200 ul ilave edin.Sallanarak damarları askıya alma ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. </li><li> Sabitleştirici çözüm pipet ve 1x PBS (ilk yıkama) 200 ul ile değiştirin, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe ve bu adımı 3 kez tekrarlayın. Her zaman, gemiler doğru gemiler dokunulmaz değil sağlanması, 1x PBS üzerinden boru ve pipet dibine battı doğrulayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, zaman zaman hafifçe sallayarak damarları resuspending, permeabilizasyon / bloke çözümü ile 1x PBS yerine ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir. </li></ol> 7. immün <ol><li> Permeabilizasyon / engelleme çözümü seyreltilmiş primer antikorlar (Malzeme şablon tablo burada ve seyreltiler kullanılan antikorların referanslara bakın) karışımı ile permeabilization / engelleme çözümü değiştirin ve 4 ° CO / N inkübe. </li><li> Oda sıcaklığında PBS içinde 3 yıkamadan sonra, 2 saat süreyle PBS içinde seyreltilmiş sekonder antikor karışımı ile gemiler inkübeoda sıcaklığında karıştırıldı. </li><li> Not: Mikroskop altında tüyleri veya tozları kontamine mümkün gelen gemiler ayırt etmek için: (2000 1) veya DAPI: biz şiddetle Hoechst (2000 1) nükleer boyama yapmanızı tavsiye ederiz. </li><li> PBS içinde 3 yıkamadan sonra, PBS&#39;de 50 ul damarları tekrar süspansiyon. </li></ol> 8. Montaj ve Gözlem <ol><li> Bir silikonlu cam kapiller ile bir ipucu hazırlayın: Bir neşter kullanılarak bir P200 pipet kesip içindeki kılcal ayarlayın. Kılcal yaklaşık hacmi 40 ul olduğunu. </li><li> Silikonize cam kılcal kullanarak bir bardak slayt damarları aktarın ve dikkatle emici bir kağıt parçası ile sıvı çıkarın. </li><li> Gemiler üzerine montaj orta tek bir damla uygulayın ve açılan kayma kenarında yaymak için izin 45º bir lamel tutun. Lamel kapalı gidelim ve orta yavaş yavaş yayılmaya izin verir. Kuru O / N oda sıcaklığında ışıktan korunarak olsun. Kaplar, bir fluoresc altında görülebilirent konfokal mikroskop. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Kan-beyin bariyeri CNS içinde ve dışında fizyolojik maddelerin geçişini düzenleyen ve kandaki mevcut potansiyel zararlı maddelere karşı korur. Bu nörodejeneratif hastalıkların 2 ve beyin tümörleri 28 de dahil olmak üzere, pek çok merkezi sinir sistemi patolojileri yer almaktadır. BBB son derece düşük geçirgenlik ayrıca nöral hücreleri ve beyin araştırmaları 3 çok aktif bir alandır için tersinir hiçbir zararlı sonuçları olan BBB açmak niyetinde yönteml...

Merkezi sinir sistemi (MSS) Uygun işlevi son derece düzenlenir dışı ortam gerektirir ve metabolik talepler diğer organlara 1 ile karşılaştırıldığında çok büyük. CNS ayrıca genel olarak periferal organlara zararsız fakat buna, nörotoksik kimyasal geniş bir yelpazede, son derece duyarlıdır. Doğru çalışmasını sağlamak için, MSS &#39;damar çoğu endotel bariyer oluşturur; Moleküllerin ve iyonların akışını yanı sıra kan ve beyin arasındaki bağışıklık hücrelerinin geçişini kontrol eden kan-beyin bariyeri (KBB), böylece engellemekle tedavileri, böylece doğru homeostasisi 2 koruyarak, aynı zamanda tedavi edici ilaçların girişini sınırlayan nörolojik bozukluklar 3. Hücresel düzeyde, BBB ağırlıklı endotel hücreleri, akış taşıyıcıların polarize ifade ve çok düşük transsitoz oranı 4 arasında kapsamlı sıkı kavşaklar tarafından sürdürülür. Özellikleri ve BBB fonksiyonları çoğunlukla KD tarafından uyarılmaktadırighboring hücreler 4. Özellikle, perisitler BBB 5,6 uyarma ve muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Büyük damarları çevreleyen düz kas hücreleri gibi kasılma hücreleri olmak, perisitler da kan akışını 7 düzenler. Son olarak, astrositler, beynin başlıca glial hücreler, endfeet etrafında adlı büyük süreçlerini göndermek beynin damarsal 8 en BBB bütünlüğü ve bağışıklık sessizliğini 9, nöronlar 10 metabolitlerinin transferini modüle ve nöronal aktivitenin arasındaki sıkı bağlantı neden ve kan akışı 11,12. Serebrovasküler sistemin moleküler ve hücresel özelliklerini incelemek için yeteneği beyin fizyolojisi ve fizyopatolojisi olan katkısını daha iyi karakterize etmek çok önemlidir. Bu soruyu çözmek için, beynin serebrovasküler sistemini izole etmek için stratejiler bozulmamış beyin damar parçalarının hazırlanması için izin veren, geliştirilmiştir. Serebral damar purification başlangıçta özellikle kemirgenler 14, diğer türlere sığır beyinleri 13 kullanılarak tarif ve geliştirilmiş ve uyarlanmıştır. Bu son çalışmada, değişen büyüklükte filtrelerin kullanılması farklı çaplarda damar zenginleştirilmiş kesirler beyin damarları ayırmak için kullanılmaya başlandı. İlginçtir ki, bu terkiplerde, endotelyal hücreler metabolik özellikleri 15, taşıyıcı işlevi 16 ve polarizasyon 17 tutulur. Burada, ayrıntılı olarak protokol açıklar ve ayrıca izole damarlar in situ yapılarda geçen ay, en çok muhafaza ettiğini göstermektedir. Endotel hücreleri sıkı kavşaklar ile bağlantılı ve sürekli bazal lamina ile çevrilidir kalır. Perisitler ve yumuşak kas hücrelerinin endotel tabaka, hem de perivasküler astrosit membranlara bağlı kalır. Ancak, astrositler, mikroglial hücreler, nöronlar ve oligodendrosit ortadan kalkar. Son olarak, biz izole beyin damarları üzerinde immün gerçekleştirmek için bir prosedür açıklanmaktadır. </p&gt; Şimdiye kadar serebrovasküler sistemine ilişkin moleküler ve hücresel çalışmalar çoğu tarafından ayrışmış saflaştınldı, beyin damarı hücrelerinde üzerinde gerçekleştirilmiştir hücre sıralama hücre spesifik raportör fare soyu veya immüno-bazlı prosedürler 18,19 kullanılmıştır. Bu teknikler neredeyse saf serebrovasküler hücre popülasyonlarının izolasyonu için izin verse, izole hücreler tamamen sırayla, büyük ölçüde moleküler ve hücresel özelliklerini etkiler onların yerinde morfolojisi ve etkileşimleri, kaybedersiniz. Protokol, spesifik antikorlar veya transjenik fare lekeleri gerek kalmadan, tüm serebrovasküler fragmanlarının izolasyonu sağlayan, burada açıklanan, moleküler özellikleri üzerinde yansımaları azaltılması ve böylece, muhafaza edilir izole serebral damar genel yapı olarak iyi bir alternatif sunmaktadır. Son zamanlarda tarif edildiği gibi izole edilmiş 20,21 damarları daha sonra BBB gen aktivitesi, protein sentezi ve düzenleme incelemek için kullanılabilecek </sup&gt;. Son olarak, lazer yakalama mikrodiseksiyon 22,23 oranla mevcut protokol, ucuz gerçekleştirmek kolay ve herhangi bir laboratuvara hızla uyarlanabilir.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Grinder Size C</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>3431E25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5415&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance, Modular Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact System Provides High Quality Leica LED1000</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low binding tips (P1000)</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>14200T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 20&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 100&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-86-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1014356290F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips, Thickness 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P10143263NR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;PARAFILM&#174; M (roll size 4 in. &#215; 125 ft)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Life technology</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>ET330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor&#174; 488 Conjugate; Dilution 1/100</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (rabbit) ; dilution 1/400</td>
			<td colspan="2">kindly provided by Dr Markus A Ruegg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>33-9100</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti GFAP (mouse, clone GA5)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3893</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti AQP4 (rabbit)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Cx43 (mouse, Clone&#160; 2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610061</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Olig2 (rabbit)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>&#160;dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NF-M (mouse)</td>
			<td colspan="2">provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.</td>
			<td>&#160;dilution 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Iba1 (rabbit)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>&#160;dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11029</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 488 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11034</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21424</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 555 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21429</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of mouse brain vessels

Beyinde, vasküler sistemin en seçici bir bariyer oluşur, beyin ve kan arasındaki moleküller ve bağışıklık hücrelerinin değişimini düzenleyen kan-beyin bariyeri (BBB). Dahası, büyük nöronal metabolik talep kan akışının bir an-an düzenlenmesini gerektirir. Özellikle, bu düzenlemelerin anormallikler çoğu beyin patolojileri etyolojik özellikleridir; beyin tümörleri, hem de örneğin, multipl skleroz, menenjit ve sepsisi uyaran beyin bozuklukları gibi enflamatuar durumlar: glioblastom, inme, ödem, epilepsi, dejeneratif hastalıklar (Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ex) da dahil olmak üzere. Böylece, serebrovasküler fizyolojisini modüle sinyal olaylarını anlamak önemli bir sorundur. Serebrovasküler sistemini oluşturan çeşitli hücre tiplerinin hücresel ve moleküler özellikleri içine çok içgörü taze ayrışmış beyin dokusundan sıralama primer kültür veya hücreden elde edilebilir. Bununla birlikte,Böyle hücre polarite, morfolojisi ve hücreler arası ilişkiler gibi özellikler bu tür hazırlıklar muhafaza edilmez. Biz burada açıklamak protokol yapısal bütünlüğünü korurken, beyin damar parçaları arındırmak için tasarlanmıştır. Biz izole damarlar sürekli bazal lamina ile çevrilidir sıkı kavşaklar tarafından mühürlenmiş endotel hücreleri ibaret olduğunu göstermektedir. Perisitler, yumuşak kas hücrelerinin yanısıra perivasküler astrosit endfeet membranlar endotel tabakasının bağlı kalır. Son olarak, biz arıtılmış beyin damarları üzerinde immün deneyler gerçekleştirmek için nasıl açıklar.

Burada, biz. Beyin damarlarında 14 mekanik izolasyonu sağlayan bir protokol açıklar 1 Bu tekniğin temel adımları özetlemektedir Şekil. Beyin damarlarının mimarisidir karmaşıktır ve çeşitli hücre tipleri içerir yani, endotelyal hücreler sıkı bırleşme ile kapatılır, perisit, yumuşak kas hücreleri ve astrosit ayak işlemlerinin 9 ile çevrilidir. Bu nedenle, beyin damar izole edildikten sonra, bizim protokolü ikinci bölümünde ta...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Mouse Brain Vessels at JoVE.com

Purification of Mouse Brain Vessels

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K Görüntüleme.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes. 

Video: Purification of Mouse Brain Vessels

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Fare Beyin Dokusu Immunoelectron Mikroskopi için hazırlanması

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Nörobilim

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

Üretim, arıtma ve kalite kontrol için virüs tabanlı vektörel çizimler Adeno ilişkili

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the dendritic filopodia establish contact with a target axon, they begin maturing into spines, leading to the formation of a synapse. Telencephalin (TLCN) is abundantly localized in dendritic filopodia and is gradually excluded from spines. Overexpression of TLCN in cultured hippocampal neurons induces dendritic filopodia formation. We showed that telencephalin strongly binds to an extracellular matrix molecule, vitronectin. Vitronectin-coated microbeads induced phagocytic cup formation on neuronal dendrites. In the phagocytic cup, TLCN, TLCN-binding proteins such as phosphorylated Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), and F-actin are accumulated, which suggests that components of the phagocytic cup are similar to those of dendritic filopodia. Thus, we developed a method for purifying the phagocytic cup instead of dendritic filopodia. Magnetic polystyrene beads were coated with vitronectin, which is abundantly present in the culture medium of hippocampal neurons and which induces phagocytic cup formation on neuronal dendrites. After 24 h of incubation, the phagocytic cups were mildly solubilized with detergent and collected using a magnet separator. After washing the beads, the binding proteins were eluted and analyzed by silver staining and Western blotting. In the binding fraction, TLCN and actin were abundantly present. In addition, many proteins identified from the fraction were localized to the dendritic filopodia; thus, we named the binding fraction as the dendritic filopodia-rich fraction. This article describes details regarding the purification method for the dendritic filopodia-rich fraction.

In this protocol, we introduce a method for purifying the dendritic filopodia-rich fraction from the phagocytic cup-like protrusion structure on cultured hippocampal neurons by taking advantage of the specific and strong affinity between a dendritic filopodial adhesion molecule, TLCN, and an extracellular matrix molecule, vitronectin.

Dendritic Filopodia-zengin kesir arıtma

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, and a ventricular zone niche, which generates the inhibitory GABAergic Purkinje cells, which are neurons that constitute the deep cerebellar nuclei and Bergman glia. Recently, a third stem cell niche has been described that arises as a secondary germinal zone from the ventricular zone niche. The cells of this niche are defined by the cell surface marker prominin-1 and are localized to the developing white matter of the postnatal cerebellum. This niche accounts for the late born molecular layer GABAergic interneurons along with postnatally generated cerebellar astrocytes. In addition to their developmental role, this niche is gaining translational importance in regards to its involvement in neurodegeneration and tumorigenesis. The biology of these cells has been difficult to decipher because of a lack of efficient techniques for their purification. Demonstrated here are efficient methods to purify, culture, and differentiate these postnatal cerebellar stem cells.

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Demonstrated here is an efficient and cost-effective method to purify, culture, and differentiate white matter stem cells from postnatal mouse cerebellum.

Postnatal Fare Serebellum prominin-1+ Kök Hücrelerin Safifikasyon

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Fare Beyninin Yatay Hipokampal Dilimleri

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol describes in vivo labeling and subsequent purification of newly synthesized proteins using an engineered mouse line to direct protein labeling to specific cellular populations. It is an inducible line by Cre recombinase expression of L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS*), enabling azidonorleucine (ANL) incorporation to the proteins, which otherwise will not occur. Using the method described here, it is possible to purify cell-type-specific proteomes labeled in vivo and detect subtle changes in protein content due to sample complexity reduction.

This protocol describes how to perform cell-type-specific protein labeling with azidonorleucine (ANL) using a mouse line expressing a mutant L274G-Methionine tRNA synthetase (MetRS*) and the necessary steps for labeled cell-type-specific proteins isolation. We outline two possible ANL administration routes in live mice by (1) drinking water and (2) intraperitoneal injections.