Bu protokol, Newcastle Hastalığı Virüsü üretmek için kullanılan teknikleri özetler, böylece farelere ve hamster ve koyun gibi diğer hayvanlara güvenli bir şekilde uygulanabilir. Teğetsel akış filtrasyonunun kullanılması, büyük başlangıç hacimlerinin yalnızca santrifüjleme proseslerini kullanan mevcut prosedürlere kıyasla daha verimli bir şekilde işlenmesini sağlar. Bu, birkaç karmaşık adımı içeren uzun bir prosedürdür, yani zaman yönetimi bir sorun olabilir.
Tüm potansiyel duraklama adımlarını tanımlamanızı tavsiye ederim, böylece teknik uygun şekilde bölünebilir ve stresi en aza indirebilir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Alex olacak. Newcastle Hastalığı Virüsü veya NDV'nin saflaştırılması için, ilk olarak, 50 mililitre PBS çalıştırarak önceden ayarlanmış deneysel sistemi hazırlayın.
Tüpte yaklaşık beş mililitre PBS kaldığında pompayı durdurun. Ardından, boruya bir ila üç mikromolar tutma derecesine sahip bir derinlik filtresi takın. Filtreyi havalandırmak için, derinlik filtresinin epik tarafındaki ikinci kapağı çıkarın ve ardından sistemden ilave 50 mililitre PBS çalıştırmaya başlayın.
PBS, filtrenin üst kısmındaki havalandırma deliğinden akmaya başladığında, bağlantı noktasını kapatın ve PBS'yi hatlar boyunca akmaya devam edin. Bundan sonra atık kabı yeni bir steril toplama kabı ile değiştirin ve Allantoik Sıvıyı derinlik filtresinden geçirmeye başlayın. Daha sonra, teğetsel akış filtrasyonunu veya TFF sistemini açık bir onayda kurun ve makalede açıklandığı gibi çalıştırın.
Rezervuarda yaklaşık beş mililitre sıvı kaldığında, pompayı duraklatın ve rezervuara derinlik filtrelenmiş Allantoik Sıvı ekleyin. Ardından pompa akışına devam edin. Virüsün kesilmesini önlemek için, sistemin basıncının inç kare başına 10 pound kuvvetini geçmemesini sağlamak önemlidir.
İllüzyonu arttırmak için, peristaltik pompanın ve C-kelepçesinin hızının bir kombinasyonu kullanılmalıdır. Rezervuarda 150 ila 100 mililitre Allantoik Sıvı bırakılır, pompayı duraklatın ve 150 ila 200 mililitre ML tamponu ekleyerek tamponu değiştirin. Yine, rezervuarda beş ila 10 mililitre sıvı bırakıldığında pompayı duraklatın, ardından iki C kelepçesi kullanarak beli kapatın.
Rezervuarı besleyen retented hattı ayırın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Ardından akışa devam edin ve rezervuar tankında birkaç damla sıvı kaldığında duraklatın. Ardından, C kelepçelerini atık hatlarından çıkarın ve geri çekilmiş besleme hattını rezervuar tankına yeniden takın.
Bu arada, iyotiksanol yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemeye hazırlanmak için, önce 13.2 mililitrelik açık üst ince duvarlı ultra santrifüj tüpüne 0.5 mililitre% 40 iyodiksantal ekleyin. Daha sonra kolonu, 2.5 mililitre% 20 iyodiksanol ve% 10 iyodiksanol 2.5 mililitre art arda ilavelerle hazır hale getirin. Ultrasantrifüjlemeden önce, TFF sisteminden ima edilen altı ila 6,5 mililitre virüs çözeltisini, gradyanı bozmadan iyotiksanol kolonuna dikkatlice ekleyin.
Ultra santrifüjlemeden sonra, tüpleri bir çift steril forseps ile çıkarın. Hedef bant %10 ile %20 gradyanlar arasında büyük bir bant olmalıdır. Ardından, bir imbik standı kullanarak tüpü bir beherin üstüne asın.
Bundan sonra, beş mililitrelik bir şırıngaya 18 gauge'lik 1,5 inçlik bir iğne takın, ardından ultrasantrifüj tüpünün kenarını iğneyle delin ve pistonu yavaşça uzatarak hedef bandı çıkarın. Makalede açıklandığı gibi virüs çözeltisinden iyodiksanol çıkarıldıktan sonra, virüsü bir diyaliz kasetine dikkatlice enjekte etmek için bir şırınga kullanın. Virüs çözeltisini konsantre etmek için, diyaliz kasetini diyaliz tamponundan çıkarın ve küçük bir sızdırmaz plastik torbaya koyun.
Daha sonra torbaya 15 ila 25 mililitre% 40 polietilen glikol ekleyin, böylece diyaliz kaseti tamamen suya batırılır. Diyalizden sonra diyaliz kasetini PBS ile kısa bir süre durulayın. Ardından, 18 gauge'lik 1,5 inçlik bir iğne ile donatılmış bir şırıngayı hava ile doldurun, şırıngayı diyaliz kasetine yerleştirin ve pistonu itin.
Virüsü çıkarmak için aparatı verilen havanın hiçbirini çıkarmadan döndürün. Membrana yapışan artık virüsü yerinden çıkarmak için, zara zarar vermeden eldivenli parmaklarla dikkatlice masaj yapın. Yerinden çıkarma işlemini kolaylaştırmak için, diyaliz kasetindeki fazla havanın bir kısmını çıkarın.
Kalite kontrol tahlilleri için, ilk olarak, 1,5 mililitrelik bir tüpte 990 mikrolitre PBS'ye 10 mikrolitre ekleyerek virüs çözeltisini 100 kez seyreltin. Ardından, önceki seyreltmenin 100 mikrolitresini 900 mikrolitre PBS'ye ekleyerek seri seyreltmeye devam edin. Enfeksiyon tahlilleri için, 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna her sanrıdan 20 mikrolitre ekleyin.
Yeşil floresan proteininin sitopatik etkisini incelemeden veya dolaylı bir immünofloresan testi yapmadan önce, plakayı en az 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu protokol kullanılarak, viral proteinlerin sodyum do sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ile gösterildiği gibi yüksek saflıkta NDV elde edildi. Bu yöntemle saflaştırılan virüsün enfektivitesi, 96 kuyu plakasında yapılan %50 doku kültürü enfeksiyonu dozu veya TCID50 testi ile de doğrulanmıştır.
TCID50, Spearman-Karber hesap makinesi kullanılarak her seyreltme için pozitif kuyu sayısından belirlendi. Enfeksiyon testi, lentojenik ve mezojenik NDV'nin DF bir hücreleri üzerindeki sitopatik etkileri arasındaki farkı 10 ve 24 saatlik inkübasyondan sonra farklı koşullar altında ortaya koymuştur. İmmüno-floransa testi, Vero hücrelerinin lentojenik NDV ile enfeksiyonunun incelenmesinde de etkiliydi.
Deney sistemini hazırlarken, herhangi bir artık sodyum hidroksit virüsü inaktive edeceğinden hatların etkili bir şekilde astarlandığından emin olun. Ayrıca, membran bütünlüğünü korumak için de önemlidir, çünkü bundan ödün vermek virüs saflaştırmasını ve verimini önemli ölçüde bozacaktır.
