Bay Danimarka Kanser Derneği (R146-A9394-16-S2) bir bursu tarafından finanse edildi. MFB ve MKT AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8) tarafından finanse edilmiştir. Bay ve MFB co finanse edilmiştir Graduate School, sağlık, AU. E.F.W. laboratuvar İspanyolca Bakanlığı Ekonomi (SAF2015-70857, eş ERDF-AB tarafından finanse edilen) ve grant (741888 - olay yeri inceleme-eğlenceli) gelişmiş bir ERC gelen hibe tarafından desteklenmektedir.
Liliana Fajardo Mellor (genler, geliştirme ve hastalık; teşekkür etmek istiyorum Ulusal Kanser Araştırma Merkezi) için eleştirel okuma şekilde alt alta yazılmalıdır.

Bu iletişim kuralı laboratuvar fareler cerrahi prosedürde içerir. Tüm hayvan deneyleri tek tek gözden geçirilmiş ve bir kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış gerekir. Yaklaşım hayvan kurtarma ve hayatta kalma dayalı olarak uygun anestezi, ağrı yönetimi ve aseptik cerrahi ortam her zaman emin olun. Bir Isıtma yastığı cerrahi ve anestezi kurtarma kadar hipotermi engellemek için kullanın.
1. başlangıç konuları
<ol><li>Kullanılan virüs bağlı olarak, farklı titresi gereksinimleri uygulanabilir; virüs buna göre oranında seyreltin. Not: Bu örnekte, 1 x 1012 IU/mL titresi PBS içinde seyreltilmiş bir Adeno ilişkili virüs enjekte edilir. Virüs serotip 9 vardır ve Kılavuzu RNA Pten ve Cre protein Ubikuitin promotor (şekil 1) altında ifade içerir. Pten kaybı pAKT ve Prostatik epitel13yayılması arttı.</li>
	<li>Yeterli prostat geliştirme sağlamak için ameliyat esnasında 8 haftalık bir yaşta erkek fare kullanın. Not: gösterilen bu deneyde fareler Rosa26-LSI-Cas9-EGFP knockin fareler C57BL/6J arka plan12 (şekil 1) değildir.</li>
	<li>Taze bir genel anestezi karışım hazırlamak ve mümkünse steril tutmak. Not: ameliyat sonrası daha iyi hayvan kurtarma için bir anestezi panzehir önerilir.<ol>
<li>Toplam hacmi 5 mL anestezik hazırlamak için 0.15 mL medetomidine hidroklorid (1 mg/mL), 0.4 mL midazolam (5 mg/mL) ve 0.25 mL butorphanol (10 mg/mL) ile 4,2 mL steril tuzlu su karıştırın. Not: Hayvan Kurulusları kurallarına göre inhalable isoflurane gibi alternatif anestezi yöntemleri kullanılabilir.</li>
		<li>Medetomidine hidroklorid ameliyat sonrası etkisini tersine çevirmek için 0.1 mL atipamezole (5 mg/mL) ile 4.9 mL steril tuzlu su karışımı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aseptik cerrahi ortama uygun dezenfeksiyon ve sterilizasyon hazırlayın. Otoklav cerrahi aletler kullanmadan önce.</li>
</ol>2. fare prostat için virüs-teslim
<ol><li>Hayvan mayi enjeksiyonu ile steril 1 mL şırınga ve iğne 27G x ½" ile anestezi. Bir anestezi doz 0,01 mL/g vücut ağırlığının kullanın. Yordamı 30 dk daha uzun sürerse, anestezi enjekte edilerek korumak başlangıç 1/3 doz her 30 dak.</li>
	<li>Anestezi derinliği tarafından değerlendirilmesi kas gevşeme, pedal çekilmesi ve palpebral refleksleri inceleyin. Reflekslerin kaybı gözlenen zaman hayvanın alt karin tıraş.</li>
	<li>Dikkatle hayvanın gözleri veteriner oftalmik merhem Korneal refleks yetersizliği nedeniyle körlüğü önlemek için bir steril pamuklu çubukla kullanarak kapak.</li>
	<li>Cerrahi alan dezenfekte için % 70 etanol ve % 10 povidone iyot ile traş karın silin. Cerrahi alan çevre doğru cerrahi alanının merkezinden fırçalayın.</li>
	<li>Bir dikey cilt kesi düşük karın orta hat, yaklaşık 1 cm steril Cerrahi makas kullanarak gerçekleştirin.</li>
	<li>Karın zarını altında döşeme organlara zarar verme önlemek için para cezası nokta forseps kullanarak kaldırın. Periton ile Cerrahi makas kullanarak bir < 8 mm kesik dikkatli olun. Not: insan aksine, bir kemirgen 's prostat bezi dört ayrı loblar oluşmaktadır. Ön lob seminal vezikül eklenir.</li>
	<li>Yavaşça kenara yağ dokusu seminal vezikül ortaya çıkarmak için hareket ettirin. Bir halka forseps kullanarak dikkatli bir şekilde yukarı kaldırın (şekil 1) ön prostat olana kadar seminal vezikül tespit.</li>
	<li>Toplam hacmi 30 µL virüs (3 x 1010 viral parçacıkların) 0.5 mL insülin 30G x 8 mm iğne ile kullanarak ön prostat epiteli çözümde enjekte. Sızıntı en aza indirmek ve sıvı küçük bir kabarcık oluşturan doku içinde absorbe emin olun. Seminal vezikül karın boşluğunda yerleştirin.</li>
	<li>Periton ile 13 mm, 3/8 daire ve konik noktası iğne ile 6-0 absorbe dikiş kullanarak 2-3 basit kesintiye uğramış Dikiş dikiş.</li>
	<li>Cilt cilt toparlama Forseps ile karın zarını zarar görmesini önlemek için 3 steril 4.8 x 6,5 mm kliplerle zımbala.</li>
	<li>Daha iyi kurtarma için steril 1 mL şırınga ve iğne 27G x ½" kullanarak mayi enjeksiyonu ile anestezi panzehir 0,01 mL/g vücut ağırlığının bir doz uygulanır. Dikkatle hayvan geri onun kafes içinde yer.</li>
</ol>3. sonrası cerrahi prosedürler
<ol><li>O kafesi ameliyat 1 h bir Isıtma yastığı üzerinde işlemden sonra tamamen iyileşti kadar hipotermi önlemek için fare ile tutun. Panzehir uygulanırsa, hayvan birkaç dakika enjeksiyon sonra uyanık olmalıdır.</li>
	<li>Hayvanlar her gün için uygun yara iyileşmesi ve ağrı göstergeler izleyin. Gerekirse, ek ağrı kesici hayvan Kurulusları esaslarına göre yönetmek.</li>
	<li>Cilt klipleri 4-5 gün sonra yara kapatıldıktan sonra kaldırın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer.">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454 (2015).</li><li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+transgenesis:+an+overview.">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation.">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis.">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis.">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li><li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus.">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+JUNB/AP-1+promotes+invasive+prostate+cancer.">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy,+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis.">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome.">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer.">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer.">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li><li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer.">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li><li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate.">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li><li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+prostate:+an+historical+survey+of+divergent+views.">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation.">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol için biz ön lobunda gen ekspresyonu fare prostat virüs enjeksiyonu ile değiştirmek için bir yöntem prostat kanseri (Şekil 2) bir güçlü yeni fare modeli oluşturma açıklanmaktadır. Bir Adenovirus başarılı yönetim ilk Leow ve ark. 20058tarafından tanımlanmıştır. Biz daha önce nasıl bir Adenovirus için Cre recombinase protein kodlama zaman alıcı çarpı işareti-doğurmak için doku özgü silme 9 (...

Algılama ve prostat kanseri tedavisinde son on yıl içinde önemli ölçüde iyileştirilmiştir. Hala, prostat kanseri insidansı, yaşam beklentisi artıyor. Bir tahmini 1.1 milyon yeni vaka ile dünya çapında, kanserle ilgili ölüm erkekler 1' deki en yaygın nedenleri arasındadır. Prostat kanseri gelişimi içinde yavaş, ama ne zaman kanser için gelişmiş bir metastatik devlet ilerlemiştir, sınırlı tedavi seçenekleri nedeniyle prognozu kötüdür. Şimdiye kadar sadece birkaç genler bu kanserde ortak sürücüleri olarak tespit edilmiştir ve onun heterojenite ve multifocality engellemektedir, biyolojik ve targetable hastalığı sürücüleri2,3.
Klasik teknikleri üreten GEMMs kez onların karmaşıklığı, zamanında giderleri ve masrafları tarafından Engelli. Koşullu nakavt modelleri ne zaman germline4' te inaktive embriyonik ölümcül neden prostat kanseri aday genler, eğitim için yaygın olarak kullanılmaktadır. En yaygın modelleri tarafından değiştirilmiş Probasin5 tahrik Prostat spesifik Cre recombinase veya ek çarpı işareti-doğurmak tarafından et entegre bir PSA6 organizatörü içerir. Bu modellerinde gen ilgi Hiperplazi hayvanın idrar yolu işlev7bozabilen tüm organ içinde üreten çoğu prostat epitel hücrelerinin hedeflenecektir.
Fare prostat ön LOB içine enjeksiyonla Cre proteinin viral teslim sadece birkaç hücre8hedefleyerek bu sorunu çözebilirsiniz. Laboratuvarları teknik önkoşulları, uzmanlık ve hedefler yöntem yarar--dan çok çeşitli olası değişimler dikkate alarak. Başarılı yaklaşımlar Adenovirus JunB ve Pten9 veya Lentivirus Pten ve Trp5310 Hedefleme hedefleme kullanan diğerleri arasında göstermiştir. Transgenes, luciferase gibi viral yapı veya et ekleme Ayrıca11Imaging bioluminescence yoluyla hastalık progresyon non-invaziv izleme olanak sağlar.
Genom CRISPR/Cas9 teknolojisini temel alan düzenleme yeni ve hızlı bir fırsat kanser hızlı somatik knockouts12nesil aracılığıyla çalışma ortaya koymaktadır. İçin fare prostat LOB anterior yönettiği tek Kılavuzu RNA'ların (sgRNAs) viral teslimini prostat kanseri fizyolojik olarak daha alakalı bir model oluşturur. Bu şekilde, seçilen mutasyonlar taşıyan tek hücreleri istila ve genişleme verebilir klonlar oluşabilir. Ayrıca, birden çok hedef genlerin için Kılavuzu RNA'ların kullanımını farklı genler Hücre klonlar değişiklikler ile oluşturur. Bu tümör heterojenite ve doğal seleksiyon basınç her gen değişikliğini veya epistatic mekanizmalar önemini ortaya çıkarabilir kanser ilerlemesine izin verir.
Burada fare prostat gen ekspresyonu İLETİMLERİNİZE için viral parçacıkların sunmak için bir yöntem mevcut. Karın küçük bir kesi, fare ön prostat LOB maruz ve viral parçacıkların LOB enjekte edilir. Beş gün sonrası cerrahi, cerrahi klipleri deriden kaldırılabilir ve prostat kanseri 8 hafta sonra analiz edilebilir. Genel olarak, bu küçük etkisi: fare ve fare ödün vermeden geliştirmek daha büyük tümör sağlayan bir hızlı ve maliyet-etkin yordamdır.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt;tm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh&lt;/sup&gt;/J mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>26175</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml U-100 insulin syringe</td><td>BD</td><td>324825</td><td>for virus injection</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>300013</td><td>for anesthesia injection</td></tr><tr><td>30 G 1/2&#039;&#039; needle</td><td>BD</td><td>304000</td><td>for anesthesia injection</td></tr><tr><td>6-0 Polysorb Suture</td><td>Medtronic</td><td>GL889</td><td>to close the peritoneum</td></tr><tr><td>Disposable sterilized surgery drape</td><td>multiple suppliers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>multiple suppliers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Prep Pad</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-70</td><td></td></tr><tr><td>Trimming machine</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>to shave the abdomen</td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Halsey Micro Needle Holder</td><td>F.S.T</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>F.S.T</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Narrow Pattern Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Ring Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>Wound Clip System Handle incl. Clips</td><td>F.S.T</td><td>12030-01</td><td>to close the skin</td></tr><tr><td>Wound Clip System Remover</td><td>F.S.T</td><td>12030-04</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>different models have been used</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>Butorphanol</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>Medetomidinhydrochlorid</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td></td><td></td><td>obtained from the animal facility</td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Takeda</td><td>7242</td><td></td></tr><tr><td>Virus (AAV, AV)</td><td>multiple suppliers</td><td></td><td>virus used in this protocol is an in-house production</td></tr><tr><td>pAKT antibody</td><td>CST</td><td>4060</td><td>used 1:200 dillution</td></tr><tr><td>GFP anitbody</td><td>CST</td><td>2956</td><td>used 1:100 dillution</td></tr></tbody></table>

virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration

Artan bir prostat kanseri insidansı ile yeni tümör sürücüleri veya modülatörler kimliği çok önemlidir. Prostat kanseri için genetik fare modelleri (et) tümör heterojenite ve onun karmaşık microevolution dynamics tarafından engel vardır. Geleneksel prostat kanseri fare modelleri içerir, diğerleri arasında germline ve koşullu altını gizleme, oncogenes ve xenograft modelleri transgenik ifadesi. Bu modeller de novo mutasyonların, zaman alıcı, karmaşık ve pahalı olduğunu. Ayrıca, insan prostat kanseri hücreleri yalnızca küçük bir bölümünün içinde izole bir olay olarak gelişmeye bilinen ise geleneksel modellerin çoğu prostat epiteli, çoğunluğu hedef. Prostat kanseri başlatma, hem de gelişmiş hastalık ilerleme benzetimini yapmak değerli modelleri gerekir.
Burada bir kaç prostat epitel hücrelerinde transducing hücreleri tarafından tarafından viral parçacıkların hedeflemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Fare prostat için tasarlanmış bir virüs teslim prostat epiteli gen ekspresyonu değiştirilmesini sağlar. Bu vesile ile virüs türü ve miktarı gen değişikliğini için hedeflenen hücreleri kanser başlatılması için birkaç hücre ve gen tedavisi için birçok hücre transducing tarafından tanımlayacaktır. Cerrahi tabanlı enjeksiyonuyla ön LOB, idrar izlemek, distal tümör bu modelde hayvan idrar işlev bozulması olmadan genişletebilirsiniz. Ayrıca, yalnızca alt küme küme küme prostat epitel hücrelerinin hedefleyerek teknik tümör klonal genişleme sağlar ve bu nedenle insan tümör başlatma, ilerleme gibi işgal Bazal membran aracılığıyla taklit eder.
Bu roman tekniği geliştirilmiş fizyolojik alaka ile güçlü prostat kanseri modeli sağlar. Hayvan acı sınırlıdır ve hiçbir ek ıslahı gerekli olduğundan, genel olarak hayvan sayısı azalır. Aynı zamanda, yeni aday genler ve yolları analizi, hızlandırılmış hangi sırayla daha fazla etkili maliyetidir.

Virüs teslim fare prostat için değerlendirmek için örnekleri ameliyattan sonra üç ay analiz edildi. Rosa26-LSI-Cas9-EGFP fareler12 GFP virüs tarafından ifade edilen Cre protein maruz kalmış olan hücrelerde hızlı. Prostat örnekleri GFP sinyal (şekil 2A) ile alanları tanımlamak için bir Floresans mikroskobu ile incelendi. GFP sinyal prostat epiteli ama olsun gene düzenleme CRISPR Kılavuzu tarafından uyarılan değil...

Watch this Scientific Journal Video about Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration at JoVE.com

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Bu iletişim kuralı virüs teslim edilmek üzere fare prostat yeni kurulan bir yöntem açıklanır. CRISPR/Cas9 teknolojisi, gen overexpression veya Cre recombinase teslim kullanarak, teknik gen ifadesinin orthotopic değişiklik sağlar ve prostat kanseri için bir roman fare modeli uygular.

Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

virus-delivery-crispr-guides-to-murine-prostate-for-gene

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.6K Görüntüleme.  Aarhus University. Bu iletişim kuralı virüs teslim edilmek üzere fare prostat yeni kurulan bir yöntem açıklanır. CRISPR/Cas9 teknolojisi, gen overexpression veya Cre recombinase teslim kullanarak, teknik gen ifadesinin orthotopic değişiklik sağlar ve prostat kanseri için bir roman fare modeli uygular.

Video: Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to assess therapeutic avenues. However, their time-, labor- and cost-intensive nature limits their utility for systematic analysis of gene function. Recent advances in genome-editing technologies overcome those limitations and allow for the rapid generation of specific gene perturbations directly within specific mouse organs in a multiplexed and rapid manner. Here, we describe a CRISPR/Cas9-based method (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) to generate thousands of gene knock-out clones within the epithelium of the skin and oral cavity of mice, and provide a protocol detailing the steps necessary to perform a direct&#160;in vivo&#160;CRISPR&#160;screen for tumor suppressor genes. This approach can be applied to other organs or other CRISPR/Cas9 technologies such as CRISPR-activation or CRISPR-inactivation to study the biological function of genes during tissue homeostasis or in various disease settings.

Here we describe a rapid and direct in vivo CRISPR/Cas9 screening methodology using ultrasound-guided in utero embryonic lentiviral injections to simultaneously assess functions of several genes in the skin and oral cavity of immunocompetent mice.

Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...

Genetik

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal experiments. When generating animal models, the electroporation of zygotes offers higher efficiency, simplicity, cost, and throughput as an alternative to the gold standard method of microinjection. Electroporation is also gentler, with higher viability, and reliably delivers Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) into the zygotes of common laboratory mouse strains (e.g., C57BL/6J and C57BL/6N) that approaches 100% delivery efficiency. This technique enables insertion/deletion (indels) mutations, point mutations, the deletion of whole genes or exons, and small insertions in the range of 100-200 bp to insert LoxP or short tags like FLAG, HA, or V5. While constantly being improved, here we present the current state of CRISPR-EZ in a protocol that includes sgRNA production through in vitro transcription, embryo processing, RNP assembly, electroporation, and the genotyping of preimplantation embryos. A graduate-level researcher with minimal experience manipulating embryos can obtain genetically edited embryos in less than 1 week using this protocol. Here, we offer a straightforward, low-cost, efficient, high-capacity method that could be used with mouse embryos.

Here, we describe a simple technique intended for the efficient generation of genetically modified mice called CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). This method delivers editing reagents by electroporation into embryos at an efficiency approaching 100%. This protocol is effective for point mutations, small genomic insertions, and deletions in mammalian embryos.

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Gelişim Biyolojisi

Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

The CRISPR/Cas9 system offers the potential to make targeted genome editing accessible and affordable to the scientific community. This protocol is intended to demonstrate how to create viruses that will knockout a gene of interest using the CRISPR/Cas9 system, and then inject them stereotaxically into the adult mouse brain.

Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique ...

Nörobilim

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Tıp

<meta charset="utf8"></head><body>Th17 Farklılaşmasında Gen Düzenleme için Kılavuz RNA'nın Retroviral Transdüksiyonu

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells can be stimulated with antigens and well-defined cytokine cocktails in vitro to mimic Th17 cell differentiation in vivo. Research has been conducted extensively on the Th17 differentiation regulation mechanisms using the in vitro Th17 polarization assay.
Conventional Th17 polarization methods typically involve obtaining na&#239;ve CD4 T cells from genetically modified mice to study the effects of specific genes on Th17 differentiation and function. These methods can be time-consuming and costly and may be influenced by cell-extrinsic factors from the knockout animals. Thus, a protocol using retroviral transduction of guide RNA to introduce gene knockout in CRISPR/Cas9 knockin primary mouse T cells serves as a very useful alternative approach. This paper presents a protocol to differentiate na&#239;ve primary T cells into Th17 cells following retroviral-mediated gene targeting, as well as the subsequent flow cytometry analysis methods for assaying infection and differentiation efficiency.

<meta charset="utf8"></head><body>İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

We present a protocol for retroviral transduction of guide RNA into primary T cells from Cas9 transgenic mice, providing an efficient alternative for gene editing in studying Th17 differentiation.

İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Plazmid DNA teslimat için fare mesane Urothelium elektroporasyon tarafından roman yöntemi

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Biyoloji

Delivery of the Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Complex in Immortalized and Primary Cells via Virus-like Particles ("Nanoblades")

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas system has democratized genome-editing in eukaryotic cells and led to the development of numerous innovative applications. However, delivery of the Cas9 protein and single-guide RNA (sgRNA) into target cells can be technically challenge. Classical viral vectors, such as those derived from lentiviruses (LVs) or adeno-associated viruses (AAVs), allow for efficient delivery of transgenes coding for the Cas9 protein and its associated sgRNA in many primary cells and in vivo. Nevertheless, these vectors can suffer from drawbacks such as integration of the transgene in the target cell genome, a limited cargo capacity, and long-term expression of the Cas9 protein and guide RNA in target cells.
To overcome some of these problems, a delivery vector based on the murine Leukemia virus (MLV) was developed to package the Cas9 protein and its associated guide RNA in the absence of any coding transgene. By fusing the Cas9 protein to the C-terminus of the structural protein Gag from MLV, virus-like particles (VLPs) loaded with the Cas9 protein and sgRNA (named &#34;Nanoblades&#34;) were formed. Nanoblades can be collected from the culture medium of producer cells, purified, quantified, and used to transduce target cells and deliver the active Cas9/sgRNA complex. Nanoblades deliver their ribonucleoprotein (RNP) cargo transiently and rapidly in a wide range of primary and immortalized cells and can be programmed for other applications, such as transient transcriptional activation of targeted genes, using modified Cas9 proteins. Nanoblades are capable of in vivo genome-editing in the liver of injected adult mice and in oocytes to generate transgenic animals. Finally, they can be complexed with donor DNA for &#34;transfection-free&#34; homology-directed repair. Nanoblade preparation is simple, relatively low-cost, and can be easily carried out in any cell biology laboratory.

Delivery of the Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Complex in Immortalized and Primary Cells via Virus-like Particles "Nanoblades"

We have developed a simple and inexpensive protocol to load Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoprotein complexes within virus-like particles. These particles, called "Nanoblades", allow efficient delivery of the Cas9/sgRNA complex in immortalized and primary cells as well as in vivo.

Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Kompleksinin Virüs Benzeri Parçacıklar ("Nanoblades") aracılığıyla Ölümsüzleştirilmiş ve Birincil Hücrelerde Teslimi

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas system has democratized genome-editing in eukaryotic cells and led to the ...

Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması

Zigotların CRISPR Elektroporasyonu ile Farelerin Verimli Genom Düzenlemesi

Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili

İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

İn vitro Th17 farklılaşmasının incelenmesi için retroviral CRISPR/Cas9 aracılı gen hedeflemesi

Plazmid DNA teslimat için fare mesane Urothelium elektroporasyon tarafından roman yöntemi

Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Kompleksinin Virüs Benzeri Parçacıklar ("Nanoblades") aracılığıyla Ölümsüzleştirilmiş ve Birincil Hücrelerde Teslimi