İnsan kaynaklı organoidler, tümörlerin hem hasta çeşitliliğini hem de hücresel heterojenitesini temsil eden üç boyutlu in vitro model sistemlerdir. Bu protokol ve video gösterimi, hasta kaynaklı meme tümörü ve normal organoidlerin oluşturulması için ayrıntılı, uygulamalı bir kılavuz sağlar. Hasta kaynaklı meme tümörü organoidleri heyecan verici yeni modellerdir, ancak kurulması zordur.
Burada sağladığımız kapsamlı protokol, meme organoidlerini geliştirmeye çalışan araştırmacıların hazırlanmasına yardımcı olmalı ve onları beklenen zorluklarla tanıştırmalıdır. Farklı bir hastadan türetilen her PDO hattı morfoloji ve büyüme hızı açısından benzersizdir. İki 2D hücre hattı sisteminin aksine, organoidler yüksek yoğunlukta kaplandığında daha iyi büyür ve hücreler arası etkileşimlere izin verir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Disha Aggarwal olacak. Başlamak için, bir şişe bazal membran matrisini buz üzerinde veya bir gecede dört santigrat derecede çözün. Rezeke edilen dokuyu 10 santimetrelik steril bir Petri kabına aktarın.
Dokuyu makroskopik olarak inceleyin ve morfolojik olarak yağlı, vaskülarize veya nekrotik görünüp görünmediğini not edin. Ek olarak, dokunun boyutunu ve şeklini kaydedin ve bir cetvelle dokunun resmini çekin. Dokuyu steril bir 10 numaralı neşterle küçük parçalara ayırın ve 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.
Mililitre kollajenaz IV çözeltisi başına 10 mililitre iki miligram ekleyin ve tüpü kapatın. Tüpü, 30 derecelik bir açıyla 30 ila 90 dakika boyunca 140 RPM'de 37 santigrat derecede bir yörüngesel çalkalayıcıya yerleştirin. Kuluçka sırasında, bir boncuk veya su banyosunda 37 santigrat derecede önceden ısıtmak için tam bir ortam aliquot yerleştirin.
Her 15 dakikada bir, beş mililitrelik, steril, önceden kaplanmış bir serolojik pipet kullanarak yukarı ve aşağı doğru kuvvetlice karıştırarak dokuyu yeniden askıya alın. Tüpü mikroskop altında 5X veya daha yüksek bir büyütmede gözlemleyerek zaman içinde ayrışmayı izledi. Doku ayrıştıktan sonra, beş dakika boyunca 400 G'de santrifüj yapın, süpernatanı aspire edin ve 10 mililitre AdDF + Tekrar ekleyin, santrifüj edin ve doku topakları bazen gevşek olabileceğinden, süpernatanı dikkatlice aspire edin.
Doku peleti kısmen kırmızıysa, iki mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpe 10 mililitre AdDF + ekleyin, beş dakika boyunca 400 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Peletin 50 ila 300 mikrolitre seyreltilmemiş soğuk bazal membran matrisinde tekrar askıya alın ve kabarcık oluşmasını önlemek için pipetleme ile dikkatlice karıştırın.
İnkübatörde gece boyunca önceden ısıtılan altı kuyucuklu bir doku kültürü plakası kullanılarak, her bir kuyucukta organoidler içeren 300 mikrolitre bazal membran matris kubbesi plakası. Bodrum membran matris kubbesinin tamamen katılaşması için plakayı 20 ila 30 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirmeden önce beş dakika boyunca davlumbazda rahatsız edilmeden bırakın. Kuluçka sonunda, her bir oyuğa damla damla üç mililitre önceden ısıtılmış tam ortam ekleyin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, ters çevrilmiş parlak alan mikroskobunda 5X'lik bir hedef kullanarak organoidlerin görüntülerini yakalayın. Baz membran matris kubbesini bir hücre kazıyıcı veya bir mililitrelik pipet ucu kullanarak kuyudaki ortama kaldırın. Önceden kaplanmış bir pipet ucu kullanarak, organoidlerin yüzen kubbesini, hasat edilen kuyu sayısına bağlı olarak, orta dereceli bir 15 veya 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.
Ardından, ses seviyesini en az beş mililitreye çıkarmak için DPBS ekleyin. Tüpleri beş dakika boyunca 400 G'de döndürün. Organoidli bazal membran matrisi altta bir tabaka oluşturur.
Süpernatanı aspire ettikten sonra, bir tüpte toplanan kuyu sayısına bağlı olarak 5 ila 20 mililitre DPBS ekleyin. Organoid bazal membran matris peletini önceden kaplanmış steril tek kullanımlık pipet kullanarak DBPS'de karıştırın. Yine, süpernatanı santrifüj edin ve atın.
Kaplamalı bir pipet ucu kullanarak, bazal membran matrisinin hacminin üç katı hacimde hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve organoidleri yeniden askıya alın. Tüpü, açılı bir konumda 8 ila 15 dakika boyunca 140 RPM'de 37 santigrat derecede bir yörüngesel çalkalayıcıya yerleştirin. Organoidlerin daha küçük kümelere ayrıldığından emin olmak için tüpü her beş dakikada bir mikroskop altında gözlemleyerek izleyin.
Organoidleri karıştırmak için hücre ayrışma reaktifine ve pipete eşit veya daha büyük bir hacimde AdDF+'yı ekleyin. Bir organoid pelet elde etmek için beş dakika boyunca 400 G'de döndürün. Çözülmemiş bazal membran matrisi olmayan beyaz bir organoid pelet elde edildikten sonra, süpernatantı atın ve peleti bir mililitre AdDF + AdDF + ile 10 mililitreye kadar yeniden askıya alın Yıkama adımı için tüpü döndürün ve süpernatanı atın.
Uygun bölünme oranına göre sindirilmiş organoidlere gerekli miktarda bazal membran matrisi ekleyin. Kabarcıkların oluşmasını önlemek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Plaka 300 mikrolitrelik organoid kubbeleri, önceden ısıtılmış altı delikli bir plakada bir bazal membran matrisinde yeniden askıya alınmıştır.
Kubbelerin katılaşması için 20 ila 30 dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye yerleştirmeden önce plakayı beş dakika boyunca davlumbazda rahatsız edilmeden bırakın. İnkübasyonun sonunda ve her bir kuyucuğa üç mililitre önceden ısıtılmış tam ortam ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Her beş ila yedi günde bir taze komple ortam ekleyin.
Hasta kaynaklı çeşitli meme tümörü organoid çizgileri morfoloji ve büyüme hızı bakımından farklılık gösterir. Normal meme organoidleri ve C2 türevi organoidlerdeki birkaç erken duktal karsinom, duktal hücrelerle çevrili merkezi bir lümen ile normal meme yapısına benziyordu. İnvaziv lobüler karsinomdan türetilen organoidler, gevşek bağlanmış üzüm salkımı benzeri yapılar oluşturma eğilimindedir.
Bu arada, invaziv duktal karsinomlardan türetilen organoidler yoğun, büyük ve yuvarlak organoidler oluşturma eğilimindedir. Organoidlerin büyümesi, üç, altı, dokuz ve 12. günlerde ışıldayan hücre canlılığı testi kullanılarak ölçüldü ve kaplamadan sonraki ilk günde bir taban çizgisi okuması yapıldı. Zamanla genişleyen aynı organoidlerin parlak alan görüntüleri burada gösterilmiştir.
Bazı hasta kaynaklı organoid hatlar iki gün iki katına çıkarken, bazıları beş gün sürer. Kurulması yavaş olan belirli organoid çizgilere karşı sabırlı olmak önemlidir. Deneyimlerimize göre, kaplama yoğunluğunu artırmak veya kalıntıları filtrelemek PDO'ların büyümesini teşvik eder.
Hasta kaynaklı organoidler veya PDO'lar, ilaç taraması için mükemmel modellerdir. Kanser patofizyolojisini incelemek için anahtar olan hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matriks etkileşimlerini modellerler. Ek olarak, PDO'lar genetik manipülasyona uğrayabilir ve ko-kültür sistemlerinde ksenogreftler geliştirmek için kullanılabilir, bu da onları mekanik çalışmalar için harika modeller haline getirir.
