Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82122048; 82003773; 82203380) ve Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (2023A1515011416) tarafından desteklenmiştir.

Guangzhou Tıp Üniversitesi'ne bağlı Kanser Hastanesi ve Enstitüsü'ndeki ilgili hastadan insan biyopsisi alınan dokular alındı ve hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Cerrahi örneklerden hasta kaynaklı HCC organoidlerinin oluşturulması
NOT: HCC organoidlerinin kurulması, doku ayrışması, organoid kaplama, kültür, pasaj, kriyoprezervasyon ve resüsitasyon gibi çeşitli aşamaları kapsar. Doku ayrışma işlemi 2 saatlik bir süre gerektirirken, organoidlerin bir plakaya tohumlanması yaklaşık 40 dakika sürer. Bunu takiben, HCC organoidlerinin ilk nesli, HCC izolasyon ortamı kullanılarak 10-14 günlük bir kültür periyoduna tabi tutulur. Tatmin edici bir yoğunluğa ulaşıldığında, 1 saat gerektiren organoid geçişler gerçekleştirilir. Organoidlerin müteakip kültürleri daha sonra 7-10 gün boyunca HCC genişleme ortamı kullanılarak korunur, bu da organoidlerin büyüme hızına ve durumuna bağlı olarak değişebilir.
<ol><li>Doku ayrışması<ol><li>Sarf malzemeleri ve malzemelerin hazırlanması<ol><li>Operasyon öncesi daha önce herhangi bir lokal veya sistemik tedavi almamış hastalardan 1-2cm3 HCC dokusu toplayın. Cerrahi rezeksiyondan sonra, işleme kadar dokuyu doku koruma solüsyonunda (Tablo 1) 4 ° C'de tutun. NOT: Organoidlerin başarılı bir şekilde oluşturulması için yüksek kaliteli taze doku örnekleri gereklidir. Doku canlılığını korumak için numunelerin derhal, ideal olarak cerrahi rezeksiyondan sonraki 1-4 saat içinde işlenmesi önemlidir. Sonraki tüm prosedürleri steril malzemeler ve reaktifler kullanarak aseptik bir ortamda gerçekleştirin.</li>
			<li>Ultra düşük ataşman yüzeyli hücre kültürü plakalarını (24 oyuk) 37 °C'de bir inkübatörde 1 saat önceden ısıtın. Dondurulmuş bazal membran ekstraktını (BME) gece boyunca 4 °C'de kullanımdan hemen öncesine kadar çözdürün. NOT: BME'nin tamamen çözülmesini sağlamak için en az 3 saat buz üzerine yerleştirilmelidir. BME'nin tamamen erimesi, sonraki adımlarda başarılı organoid kültürü için gereklidir.</li>
			<li>Kullanmadan önce, sindirim solüsyonunun (Tablo 1) 37 °C'ye kadar ısıtıldığından emin olun. NOT: Çürütme solüsyonunu aseptik bir ortamda taze olarak hazırlayın ve hemen kullanın.</li>
		</ol></li>
		<li>Organizasyonel işlem akışı<ol><li>Laminer akış kabininde, bir Petri kabı üzerinde cerrahi makas kullanarak tümör dokusunu küçük parçalara (0,5-1mm3) kesin. Kırpılmış dokuyu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 5-10 mL bazal ortam ekleyin (Tablo 1). NOT: Bazal ortam (Tablo 1) 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.</li>
			<li>Mümkün olduğunca fazla kanı yıkamak için barotropik bir pipet kullanın ve kan hücreleri ve yüzen yağ pıhtıları da dahil olmak üzere süpernatantın bir kısmını çıkarmak için 1-2 dakika bekletin. Bu işlemi iki kez tekrarlayın.</li>
			<li>Karışımı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Kesilmiş dokuya 5 mL önceden ısıtılmış sindirim solüsyonu (Tablo 1) ekleyin.</li>
			<li>Sindirim için tüpü 37 °C'de döndürün.</li>
			<li>30 dakikalık ilk sindirimden sonra, mikroskop altında küçük hücre kümeleri arayın. Aşırı sindirimi önlemek için her 5-10 dakikada bir kontrol edin. NOT: Doku sindirimi için gereken süre, dokunun boyutuna ve türüne bağlı olacaktır. Doku sindirimi 90 dakikayı geçmemelidir. Aşırı sindirilmiş doku, mikroskop altında büyük bir hücre tabakası olarak görünecektir. Uygun sindirim seviyesi, bunların çoğunun hücre kümeleri olması ve üzüm benzeri bir görünüme sahip olması ile gösterilir.</li>
			<li>Soğuk bazal ortam ekleyerek sindirimi durdurun (Tablo 1) ve 100 μm hücre filtreli yeni bir 50 mL tüpe süzün. 50 mL'lik bir hacme soğuk bazal ortam ekleyin.</li>
			<li>Hücreleri 2 × g'da 8 ° C'de 10 dakika santrifüj edin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve 50 mL daha soğuk bazal ortam ekleyerek peleti yeniden süspanse edin (Tablo 1). Bu adımı iki kez tekrarlayın. NOT: Düşük hızlı santrifüjleme, küçük hücre kümelerinin yerleşmesine izin vermek için kullanılırken, kan hücreleri ve hücre kalıntıları hala süpernatantta asılı kalır; Nispeten saf bir doku hücresi kütlesi elde etmek için işlem birkaç kez tekrarlanır.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Organoid kaplama<ol><li>İkinci yıkamadan sonra, süpernatanı mümkün olduğunca çıkarın ve istenen sayıda hücreyi (24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1.000-5.000 hücre) kaplama için uygun BME'de yeniden süspanse edin. NOT: BME'yi kullanmadan önce daima 4 °C'de tutun.</li>
		<li>BME ekleyin ve BME ekleyerek ve hücre agregaları tamamen süspanse olana kadar hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek Gelişmiş DMEM/F-12'de küçük hücre kümelerini askıya alın. BME konsantrasyonunu %30 ile %50 arasında kontrol edin.</li>
		<li>Tohum 50 μL BME damlacıkları, 24 oyuklu kültür plakalarının merkezinde hücre kümeleri ile karıştırılır. NOT: Mümkün olduğunca, damlacıkların kuyu plakasının yan duvarına yayılmasına izin vermeyin. Düşük adsorpsiyonlu plakanın yan duvarı düşük adsorpsiyon durumunda değildir ve damlacıklar ile yan duvar arasındaki temas, sonraki inkübasyona elverişli olmayan yapışmaya yol açacaktır.</li>
		<li>Eklenen damlacıkların bulunduğu plakaların 37 °C'de 20 dakika katılaşmasına izin verin. İnkübasyonun sonunda, her bir oyuğa 500 μL önceden ısıtılmış ortam (Tablo 1) ekleyin ve 37 ° C'de bir hücre inkübatöründe inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Organoid kültür<ol><li>Kültür ortamını (Tablo 1) 2-3 günde bir yenileyin. Kültürün başlangıcında, HCC organoidlerini HCC izolasyon ortamında (Tablo 1) 2 hafta boyunca kültürleyin.</li>
		<li>HCC izolasyon ortamı ile 2 haftalık inkübasyondan sonra, ortamı HCC organoid genleşme ortamı (Tablo 1) ile değiştirin (4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanır).</li>
		<li>Kültür ortamını her 3 günde bir yenileyin.</li>
		<li>HCC genleşme ortamı ile 7-10 günlük kültürlemeden sonra, organoid uygun yoğunluğa veya boyuta ulaştığında, deneysel müdahaleler veya geçiş başlatın veya organoidleri gerektiği gibi liyofilize edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Organoid pasaj<ol><li>Sarf malzemeleri ve malzemelerin hazırlanması<ol><li>Ultra düşük ataşman yüzeyli hücre kültürü plakalarını (24 oyuk) 37 °C'de bir inkübatörde 1 saat önceden ısıtın. Dondurulmuş BME'yi kullanımdan hemen öncesine kadar gece boyunca 4 °C'de çözdürün.</li>
			<li>Organoid hasat çözeltisini ve tripsin ikamesini 37 °C'de 30 dakika önceden ısıtın.</li>
		</ol></li>
		<li>Geçiş işlemi<ol><li>Kültür ortamını kuyu plakasından çıkardıktan sonra, organoid süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
			<li>1.000 μL'lik bir pipet tabancası kullanarak kazıyarak ve yukarı ve aşağı pipetleyerek BME miktarına göre organoid hasat solüsyonu (50 μL BME başına 500 μL organoid hasat solüsyonu) ekleyin. NOT: Hava kabarcıklarının varlığı daha yüksek pipetleme basıncına işaret ettiğinden, organoid kaybını önlemek için proses boyunca hava kabarcıklarından kaçının.</li>
			<li>Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.</li>
			<li>BME'yi 1.000 μL'lik bir pipetle nazikçe aspire edin ve BME'nin tamamen çözündüğünü gözlemleyin. Berrak bir organoid hücre kümesi gözlenene kadar her 10 dakikada bir gözlemleyin, ardından oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin ve mümkün olduğunca süpernatanı çıkarın. NOT: Bu aşamada, organoid dondurulabilir ve korunabilir.</li>
			<li>Organoidlerin enzimatik sindirimi için, 1-5 mL tripsin ikamesi (organoid sayısına göre) ekleyin ve 37 ° C'de 2 dakika inkübe edin. Organoidlerin 2-10 hücreden oluşan küçük kümelere ayrılıp ayrışmadığını belirlemek için mikroskop altında enzimatik sindirim derecesini gözlemleyin; Değilse, enzimatik sindirime devam edin. NOT: Aşırı sindirim, organoid hücre kümelerinin tek hücrelere bölünmesine, canlılıklarının azalmasına ve sonraki kültür süresinin uzamasına neden olacaktır.</li>
			<li>Sindirimi durdurmak için uygun hacimde soğuk bazal ortam ekleyin (Tablo 1).</li>
			<li>Organoidleri 400 × g'da 8 °C'de 5 dakika santrifüjleyin; Süpernatanı mümkün olduğunca çıkarın.</li>
			<li>İstenilen sayıda organoidi (24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1.000-5.000 organoid) kaplama için uygun matriste yeniden süspanse edin. Bölüm 1.2'deki adımların aynısını izleyin. NOT: Kaplama yoğunluğu, organoidlerin büyüme hızına ve boyutuna göre optimize edilmelidir.</li>
			<li>Organoidleri, organoid büyümesinin yoğunluğuna bağlı olarak her 10 günde bir 1: 3 veya 1: 4 oranında geçirin.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Organoid kriyoprezervasyon ve resüsitasyon<ol><li>Organoidlerin dondurularak saklanması<ol><li>Liyofilizasyon tüpleri hazırlayın, her tüp organoidler içeren 24 oyuklu bir plakanın iki oyuğu ile birleşir.</li>
			<li>BME'siz organoidler elde etmek için organoid geçişi için 1.4.2.1 ila 1.4.2.4 arasındaki adımları izleyin ve 24 oyuklu bir plakaya 500 μL / oyuklu organoid liyofilizasyon çözeltisi ekleyerek organoidleri nazikçe yeniden süspanse edin. NOT: Organoidlerin büyüme durumuna ve boyutuna bağlı olarak, organoidlerin üçüncü nesle kadar kültürde dondurularak saklanması önerilir.</li>
			<li>Süspansiyonu liyofilizasyon tüplerine aktarın ve -80 °C'de gradyan soğutmalı bir kutuya yerleştirin. En az 24 saat boyunca -80 °C'de gradyan soğutmadan sonra, uzun süreli depolama için tüpleri sıvı nitrojene aktarın.</li>
		</ol></li>
		<li>Organoidlerin resüsitasyonu<ol><li>Liyofilize tüpleri 37 °C'lik bir su banyosunda inkübe edin ve sadece küçük bir buz bloğu kaldığında inkübasyonu durdurun.</li>
			<li>Süpernatanı tamamen çıkarmak için 400 × g'da 8 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
			<li>Sonraki işlemler için bölüm 1.2 ve 1.3'ü izleyin.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Hedef belirleme ve ilaç geliştirme için HCC organoid oluşumunun optimize edilmesi

<ol>
	<li>Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).</li><li>Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+in+hepatocellular+carcinoma.">Tumour evolution in hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (3), 139-152 (2020).</li><li>Yang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+view+of+hepatocellular+carcinoma:+trends,+risk,+prevention+and+management.">A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).</li><li>Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+hepatocellular+carcinoma.">Targeted therapy for hepatocellular carcinoma.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).</li><li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+and+Integrative+Genomic+Characterization+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+organoids+and+cell+transplantation:+What+the+future+holds.">Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).</li><li>Nuciforo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+liver+cancers+derived+from+tumor+needle+biopsies.">Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies.</a> Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hepatocyte+differentiation+model+reveals+two+subtypes+of+liver+cancer+with+different+oncofetal+properties+and+therapeutic+targets.">A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).</li><li>Kong, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+lineage+plasticity+in+hepatocellular+carcinoma+using+an+anti-CLDN6+antibody-drug+conjugate.">Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate.</a> Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).</li><li>Li, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+potential+oncofetal+targets+in+human+hepatocellular+carcinoma.">Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell-mediated+therapeutic+resistance+in+hepatocellular+carcinoma.">Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatoma Research. 8, 36 (2022).</li></ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Hasta kaynaklı organoid modellerin dikkate değer bir yararı, doku yapısını ve genomik manzarayı kapsayan tümörlerin biyolojik özelliklerini aslına uygun olarak kopyalama kapasitelerinde yatmaktadır. Bu modeller dikkate değer bir doğruluk düzeyi gösterir ve uzun süreli ekim dönemlerinde bile tümörlerin heterojenliğini ve ilerlemesini etkili bir şekilde yansıtır 6,8,9. Bu rafine organoid kültür protokolü...

Yaygın ve çok çeşitli bir tümörolan hepatosellüler karsinom (HCC) 1, tıp camiasında büyük ilgi görmüştür. HCC'de soy plastisitesinin ve önemli heterojenliğin varlığı, çeşitli hastalardan kaynaklanan tümör hücrelerinin ve hatta aynı hastadaki farklı lezyonların farklı moleküler ve fenotipik özellikler gösterebileceğini ve böylece yenilikçi terapötik yaklaşımların ilerlemesinde zorlu engeller oluşturabileceğini düşündürmektedir 2,3,4,5 . Sonuç olarak, daha etkili tedavi stratejilerinin formülasyonunu bilgilendirmek için HCC'de ilaç direncinin biyolojik özelliklerinin ve mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına ihtiyaç vardır.
Son yıllarda, araştırmacılar çabalarını HCC 3,4'ü incelemek amacıyla in vitro modellerin geliştirilmesine adamışlardır. Bazı gelişmelere rağmen, sınırlamalar devam etmektedir. Bu modeller, hücre hatlarının, birincil hücrelerin ve hastadan türetilen ksenogreftlerin (PDX) kullanımı gibi bir dizi tekniği kapsar. Hücre hatları, HCC hastalarından elde edilen tümör hücrelerinin uzun süreli kültürü için in vitro modeller olarak hizmet eder ve kolaylık ve kolay genişleme avantajları sunar. Primer hücre modelleri, primer tümör hücrelerinin hasta tümör dokularından doğrudan izolasyonunu ve kültürünü içerir, böylece hastaların kendilerine çok benzeyen biyolojik özelliklerin bir temsilini sağlar. PDX modelleri, tümör büyümesini ve yanıtını daha sadık bir şekilde simüle etmek amacıyla hasta tümör dokularının farelere nakledilmesini gerektirir. Bu modeller HCC araştırmalarında etkili olmuştur, ancak hücre hatlarının heterojenliği ve in vivo koşullarda tam olarak kopyalanamaması dahil olmak üzere belirli sınırlamalara sahiptirler. Ayrıca, uzun süreli in vitro kültivasyon, hücrelerin orijinal özelliklerinin ve işlevlerinin bozulmasına neden olabilir ve HCC'nin biyolojik özelliklerini doğru bir şekilde temsil etmede zorluklar ortaya çıkarabilir. Ek olarak, PDX modellerinin kullanımı hem zaman alıcı hem de maliyetlidir3.
Bu sınırlamaları ele almak ve HCC'nin fizyolojik özelliklerini daha doğru bir şekilde çoğaltmak için, organoid teknolojisinin kullanımı, önceki kısıtlamaları aşabilen umut verici bir araştırma platformu olarak tanıtılmıştır. İn vitro kültürlenmiş üç boyutlu hücre modelleri olan organoidler, gerçek organların yapısını ve işlevselliğini kopyalama yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, HCC bağlamında, organoid modellerin oluşturulmasında bazı zorluklar vardır. Bu zorluklar arasında HCC organoid yapım prosedürlerinin yeterince ayrıntılı olmayan açıklamaları, HCC organoid yapımının tüm süreci için kapsamlı protokollerin eksikliği ve tipik olarak küçük boyutlu kültürlenmiş organoidler 6,7,8 yer almaktadır. Kültürlenmiş organoidlerin tipik olarak sınırlı boyutları ışığında, HCC organoid yapısının tamamını kapsayan kapsamlı bir protokol geliştirerek bu zorlukların üstesinden gelmeye çalıştık6. Bu protokol doku ayrışması, organoid kaplama, kültür, pasaj, kriyoprezervasyon ve resüsitasyonu kapsar. Prosedürel adımları optimize ederek ve kültür ortamının bileşimini iyileştirerek, sürekli büyüme ve uzun vadeli geçiş yapabilen HCC organoid modellerini başarıyla kurduk 6,8. Sonraki bölümlerde, HCC organoidlerinin yapımında yer alan operasyonel karmaşıklıkların ve ilgili faktörlerin kapsamlı bir açıklaması sunulacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[Leu15]-gastrin I human</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYMCT150LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301 (TGF&#946; inhibitor)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (503), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (503), serum-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-03P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer size 100 &#956;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SML1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Ultra-Low</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>R&#38;D SYSTEMS</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td>Organoid harvesting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#8217;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24010043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1 M</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (1003)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A0737-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spodin1-conditioned medium</td>
			<td>(Broutier et al.)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Secretion of cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical specimen of tumor removed from HCC patients</td>
			<td>Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Trypsin substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3a-conditioned medium</td>
			<td>(Broutier et al.)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Secretion of cell lines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery

Hepatosellüler karsinom (HCC) dünya çapında oldukça yaygın ve ölümcül bir tümördür ve geç keşfi ve etkili spesifik terapötik ajanların eksikliği, patogenezi ve tedavisi ile ilgili daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmektedir. Doğal tümör dokusuna çok benzeyen ve in vitro kültürlenebilen yeni bir model olan organoidler, karaciğer kanseri için organoid modellerin geliştirilmesine ilişkin çok sayıda raporla son yıllarda büyük ilgi görmüştür. Bu çalışmada, prosedürü başarılı bir şekilde optimize ettik ve stabil pasajlama ve kültür koşulları ile daha büyük boyutlu HCC organoidlerinin oluşumunu sağlayan bir kültür protokolü oluşturduk. Bu yazıda, HCC doku ayrışması, organoid kaplama, kültür, pasaj, kriyoprezervasyon ve resüsitasyon sürecinin tamamını kapsayan prosedürün her adımını kapsamlı bir şekilde özetledik ve ayrıntılı önlemler sağladık. Bu organoidler, orijinal HCC dokularına genetik benzerlik gösterir ve tümörler için potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesi ve müteakip ilaç geliştirme dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.

Hepatocellular carcinoma (HCC), a prevalent and extensively diverse tumor1, has garnered considerable attention within the medical community. The presence of lineage plasticity and substantial heterogeneity in HCC suggests that tumor cells originating from various patients and even distinct lesions within the same patient may manifest dissimilar molecular and phenotypic traits, thereby presenting formidable obstacles in the advancement of innovative therapeutic approaches2,3,4,5. Consequently, there is an imperative need for enhanced comprehension of the biological attributes and mechanisms of drug resistance in HCC to inform the formulation of more efficacious treatment strategies.
In recent decades, researchers have dedicated their efforts to the development of in vitro models for the purpose of studying HCC3,4. Despite some advancements, limitations persist. These models encompass a range of techniques, such as the utilization of cell lines, primary cells, and patient-derived xenografts (PDX). Cell lines serve as in vitro models for long-term culture of tumor cells obtained from HCC patients, offering the benefits of convenience and facile expansion. Primary cell models involve direct isolation and culture of primary tumor cells from patient tumor tissues, thereby providing a representation of biological characteristics that closely resemble those of the patients themselves. PDX models entail the transplantation of patient tumor tissues into mice, with the aim of more faithfully simulating tumor growth and response. These models have been instrumental in HCC research, yet they possess certain limitations, including the heterogeneity of cell lines and the inability to fully replicate in vivo conditions. Furthermore, prolonged in vitro cultivation may result in the deterioration of the cells&#39; original characteristics and functionalities, posing challenges in accurately representing the biological properties of HCC. Additionally, the utilization of PDX models is both time-consuming and costly3.
To address these limitations and more accurately replicate the physiological attributes of HCC, the utilization of organoid technology has been introduced as a promising research platform capable of surpassing previous constraints. Organoids, which are three-dimensional cell models cultured in vitro, have the ability to replicate the structure and functionality of actual organs. However, in the context of HCC, there exist certain challenges in establishing organoid models. These challenges include insufficiently detailed descriptions of HCC organoid construction procedures, a lack of comprehensive protocols for the entire process of HCC organoid construction, and the typically small size of cultured organoids6,7,8. In light of the typically limited dimensions of cultured organoids, we endeavored to tackle these challenges through the development of a comprehensive protocol encompassing the entirety of HCC organoid construction6. This protocol encompasses tissue dissociation, organoid plating, culture, passaging, cryopreservation, and resuscitation. By optimizing the procedural steps and refining the composition of the culture medium, we have successfully established HCC organoid models capable of sustained growth and long-term passaging6,8. In the subsequent sections, a comprehensive account of the operational intricacies and pertinent factors involved in the construction of HCC organoids will be presented.

Yazar Spotlight: Hasta Kaynaklı Organoidler Kullanarak Karaciğer Kanseri Patogenezinin Araştırılması 

Potansiyel Hedef Belirleme ve İlaç Keşfi için İnsan Hepatoselüler Karsinomu Hasta Kaynaklı Organoid Modelinin Geliştirilmesi ve Optimizasyonu

Our lab aims to investigate the molecular pathogenesis of liver cancer and identify novel therapeutic targets for drug development. We would like to answer how cancer initiates, metastasis, and progress to drug tolerance utilizing novel disease models such as patient derived organoids. The current experimental challenges are in two aspects.First, there is a lack of complete set of protocols for constructing hepatocellular carcinoma organoids for the whole process. Second, the size of cultured HCC organoids is too small for subsequent experimental processing. In this protocol, we provide the details of the optimized organoids culture and subsequent transfer and freezing procedures, as well as the precautions to be taken during all the procedures.We optimized the composition of the organoid medium for organoids with close to the original tissue characteristics. We may monitor the tumor evolution using the patient-derived organoids and try to identify novel molecular and therapeutic targets for HCC treatment.

Yukarıda belirtilen prosedürün uygulanmasından sonra, HCC organoid sferoidlerinin ortaya çıkışı tipik olarak 3 günlük bir süre içinde gözlemlenebilir (Şekil 1). Şekil 1A,B, kuruluşun ilk gününde yuvarlatılmış kenarlar ve geçirgen sitozol ile karakterize edilen kompakt sferoidleri hemen geliştiren yerleşik HCC organoidini göstermektedir. HCC organoidlerinin büyümesi sırasında, farklı konsantrasyonlarda BME kullanım...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Liver Cancer Pathogenesis Using Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Hepatoselüler karsinom (HCC) organoid oluşumu için organoid kültivasyonun tüm aşamalarını kapsayan mevcut protokollere kapsamlı bir genel bakış ve iyileştirme sunuyoruz. Bu sistem, potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesi ve ilaç adaylarının etkinliğinin değerlendirilmesi için değerli bir model görevi görmektedir.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents ...

Laboratuvarımız, karaciğer kanserinin moleküler patogenezini araştırmayı ve ilaç geliştirme için yeni terapötik hedefleri belirlemeyi amaçlamaktadır. Hasta kaynaklı organoidler gibi yeni hastalık modellerini kullanarak kanserin nasıl başladığını, metastaz yaptığını ve ilaç toleransına nasıl ilerlediğini cevaplamak istiyoruz. Mevcut deneysel zorluklar iki yönlüdür.İlk olarak, tüm süreç için hepatoselüler karsinom organoidleri oluşturmak için eksiksiz bir protokol seti eksikliği vardır. İkincisi, kültürlenmiş HCC organoidlerinin boyutu, sonraki deneysel işlemler için çok küçüktür. Bu protokolde, optimize edilmiş organoid kültürü ve sonrasındaki transfer ve dondurma işlemlerinin detaylarının yanı sıra tüm işlemler sırasında alınması gereken önlemleri veriyoruz.Orijinal doku özelliklerine yakın organoidler için organoid ortamın bileşimini optimize ettik. Hastadan elde edilen organoidleri kullanarak tümör gelişimini izleyebilir ve HCC tedavisi için yeni moleküler ve terapötik hedefler belirlemeye çalışabiliriz.

development-optimization-human-hepatocellular-carcinoma-patient

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Development and Optimization of A Human Hepatocellular Carcinoma Patient-Derived Organoid Model for Potential Target Identification and Drug Discovery

983 Görüntüleme.  Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University. Laboratuvarımız, karaciğer kanserinin moleküler patogenezini araştırmayı ve ilaç geliştirme için yeni terapötik hedefleri belirlemeyi amaçlamaktadır. Hasta kaynaklı organoidler gibi yeni hastalık modellerini kullanarak kanserin nasıl başladığını, metastaz yaptığını ve ilaç toleransına nasıl ilerlediğini cevaplamak istiyoruz. Mevcut deneysel zorluklar iki yönlüdür.İlk olarak, tüm süreç için hepatoselüler karsinom organoidleri oluşturmak için eksik...

Video: Yazar Spotlight: Hasta Kaynaklı Organoidler Kullanarak Karaciğer Kanseri Patogenezinin Araştırılması 

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents necessitate further research into its pathogenesis and treatment. Organoids, a novel model that closely resembles native tumor tissue and can be cultured in vitro, have garnered significant interest in recent years, with numerous reports on the development of organoid models for liver cancer. In this study, we have successfully optimized the procedure and established a culture protocol that enables the formation of larger-sized HCC organoids with stable passaging and culture conditions. We have comprehensively outlined each step of the procedure, covering the entire process of HCC tissue dissociation, organoid plating, culture, passaging, cryopreservation, and resuscitation, and provided detailed precautions in this paper. These organoids exhibit genetic similarity to the original HCC tissues and can be utilized for diverse applications, including the identification of potential therapeutic targets for tumors and subsequent drug development.

We provide a comprehensive overview and refinement of existing protocols for hepatocellular carcinoma (HCC) organoid formation, encompassing all stages of organoid cultivation. This system serves as a valuable model for the identification of potential therapeutic targets and the assessment of drug candidate effectiveness.

Kanser Araştırmaları

Hepatocellular Carcinoma Tissue Dissociation for Organoid Culture

To begin the tissue dissociation, collect one to two cubic centimeters of hepatocellular carcinoma or HTC tissue from untreated patients. Then place the tissue in the tissue preservation solution and maintain it at four degrees Celsius until processing. Now, preheat the ultra-low attachment surface cell culture plates for one hour in an incubator set at 37 degrees Celsius.Thaw the basement membrane extract overnight at four degrees Celsius. Using surgical scissors, cut the tumor tissue into small pieces on a Petri dish inside a laminar flow hood. Transfer these pieces into a 15-milliliter conical tube and add five to 10 milliliters of basal medium.With a barotropic pipette, wash away as much blood as possible. Allow the mixture to settle for one to two minutes before removing some of the supernatant, including any blood cells and floating fat clots. Next, centrifuge the mixture at 300 G for five minutes at room temperature.Then carefully extract the supernatant and add five milliliters of pre-warmed digestion solution to the trimmed tissue. Place the tube at 37 degrees Celsius in a rotor for optimum digestion. After 30 minutes of initial digestion, use a microscope to look for small cell clusters.To stop the digestion, add five milliliters of cold basal medium to the tube. Then use a 100-micrometer cell filter to sieve into a new 50-milliliter tube. Fill up the tube with cold basal medium to reach a total volume of 50 milliliters.Next, centrifuge the cells at two G for 10 minutes at eight degrees Celsius. Once complete, carefully remove the supernatant liquid. Re-suspend the pellet in 50 milliliters of cold basal medium to obtain the cell pellet for organoid plating.

Organoid Kültür için Hepatosellüler Karsinom Doku Ayrışması

Hepatocellular Carcinoma Organoid Culture and Digestion to Study Liver Cancer Pathogenesis

To perform organoid plating, first, remove the supernatant from the centrifuge and washed hepatocellular carcinoma cells. Re-suspend the cells in the 50 microliters of basement membrane extract, or BME, per well, for plating. Next, suspend the cells in advanced DMEM/F12.Then gently pipette the cell aggregates until an even suspension is seen. Add BME to the suspension, ensuring that the BME concentration is between 30 and 50%Now seed 50 microliters of BME droplets with cell clusters in the center of a 24 well plate. Allow the droplets to solidify at 37 degrees Celsius for 20 minutes.Add 500 microliters of prewarmed medium to each well and incubate in a cell incubator at 37 degrees Celsius. Refresh the culture medium every two to three days. After two weeks, replace the isolation medium with the organoid expansion medium.After seven to 10 days of culturing, once the organoids have reached the appropriate density, process the cultures as needed. To passage the organoids, first preheat ultra low attachment surface cell culture plates in an incubator. Next, thaw the frozen BME overnight at four degrees Celsius until right before usage.Prewarm the organoid harvest solution and trypsin substitute at 37 degrees Celsius for 30 minutes. Following the preparation stage, remove the culture medium from the organoid culture plate. Then transfer the organoid suspension into a 15 milliliter tube.Now add organoid harvesting solution in proportion to the amount of BME. To mix the suspension, use a 1000 microliter pipette gun to scrape and pipette up and down. After incubating the tube at room temperature for 30 minutes, use a one milliliter pipette to carefully aspirate the BME.Ensure that the BME is fully dissolved. Monitor the extract every 10 minutes until a clear organoid cell cluster is visible. Then centrifuge at room temperature at 400 g for five minutes.Remove as much of the supernatant as feasible. To start enzymatic digestion of the hepatocellular carcinoma organoids, add one to five milliliters of the prewarmed trypsin substitute to the cultured organoid pellet. Incubate the suspension at 37 degrees Celsius for two minutes.Use a microscope to verify if organoids dissociate into small clusters of two to 10 cells. To stop the digestion, add an appropriate volume of cold basal medium. Then centrifuge the organoids at 400 g for five minutes at eight degrees Celsius.Carefully remove as much supernatant as possible. Re-suspend the desired number of organoids in the proper matrix for plating. Every 10 days passage the organoids, depending on the density of organoid growth.HCC organoids spheroids were observed within three days of culture. Compact spheroids with rounded edges and permeable cytosol were seen on the initial day of establishment. Organoids were similarly sized and had the largest diameter when cultured in 30 to 50%BME.The BME was most fragmented at 10%resulting in the smallest organoids. The BME was most intact at 100%but resulted in organoids with intermediate diameter. The proliferating HCC organoid attained a size exceeding 500 micrometers in each culture after three generations.Substantially sized HCC organoids of higher than 1000 micrometers were obtained within a 20 day culture period.