Bu çalışma Glokom Araştırma Vakfı Shaffer Grant, 4-CA Cavalier İşbirliği Ödülü, R01EY029121, R01EY035088 ve Tapınak Şövalyeleri Göz Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Tüm hayvan prosedürleri, Virginia Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün (NIH) Hayvanların Kullanımı kılavuzuna uygun hale getirildi. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. İn vivo vis-OCT görüntüleme
<ol><li>Vis-OCT sistemi<ol><li>480 nm ile 650 nm arasında görünür ışık aydınlatması sağlayan bir süper sürekli ışık kaynağı kullanan küçük bir hayvan vis-OCT sistemi kullanarak farelerin gözlerini görüntüleyin. Korneadaki güç olayının 1 mW olduğundan emin olun ve 25 kHz'lik bir A-hattı hızı ve A-hattı başına 39,3 μs'lik bir entegrasyon süresi kullanın.</li>
		<li>Spektrometrenin spektral algılama aralığının, retinada 1,3 μm'lik bir eksenel çözünürlük sağlayan 508 nm ile 613 nm arasında olduğundan emin olun. Toplam görüntüleme hacmi yaklaşık 700 μm (x) x 700 μm (y) x 1.500 μm (z) 'dir. Yanal çözünürlük, görüş alanının merkezinde 4.5 μm ile merkezden 8.7 μm'de 350 μm arasındadır11,13.</li>
	</ol></li>
	<li>Fare anestezisi<ol><li>C57BL / 6 arka planlı fareleri ve her iki cinsiyeti de intraperitoneal Ketamin (114 mg / kg) ve Ksilazin (17 mg / kg) kokteyli enjeksiyonu ile uyuşturun ve% 1 tropikamid damlaları kullanarak öğrencilerini genişletin. Sert bir ayak parmağı sıkışmasından sonra pedal refleksi kaybıyla yeterli anesteziyi onaylayın.</li>
		<li>Görüntüleme sırasında, kızılötesi bir ısı lambası kullanarak fareyi sıcak tutun. Her görüntü alımından sonra, kornea dehidrasyonunu önlemek için suni gözyaşı uygulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntüleme için farenin konumlandırılması<ol><li>Anestezi uygulanmış fareyi hayvan tutucunun üzerine yerleştirin ve iki Velcro kayış yardımıyla fareyi yerinde tutun. NOT: Hayvan tutucu, lazeri farenin gözüne yerleştirmek için üç boyutlu (dikey ayar, ince yatay ayarın yanı sıra eğim ve sapma ayarları) harekete izin verir.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntüleme parametrelerinin ayarlanması<ol><li>Bilgisayarı açın ve lazeri otomatik olarak açacak olan referans yazılımı açın.</li>
		<li>Lazer sabit olana ve farenin gözüne ortalanana kadar hayvan tutucuyu ayarlayın. Yazılım arayüzündeki bir En Face önizlemesi, yüzeysel vasküler pleksusun görüş alanı (FOV) ve FOV içindeki retinanın kesiti olan bir B-taraması aracılığıyla gözün arka kısmını görselleştirin.</li>
		<li>512 A-satır/B-tarama ve 512 B-tarama/hacimden oluşan optik odakta küçük ayarlamalar yaptıktan sonra yazılım arayüzündeki Acquire düğmesine tıklayarak bir OCT'ye karşı bir hacim elde edin. NOT: Bu işlem ~10.5 sn sürer. Görüntü alımı, önceden belirlenmiş bir eşiğin (QI < 45) altındaki görüntülerin dahil edilmemesini sağlamak için yerleşik bir kalite indeksi (QI) tahmincisi tarafından yönlendirilir.<ol><li>Her fare için, aynı gözden dört vis-OCT hacmi elde edin. Retinanın farklı alanlarını kapsayacak şekilde FOV'daki dört köşenin her birinde optik sinir başını (ONH) hizalayın. NOT: Bu tür bir yerleştirme, FOV boyunca RNFL yansımasını en üst düzeye çıkaran retina eğriliğini en aza indirir. Her çekim arasında gözü yeniden konumlandırmak ~ 1 dakika sürer (Şekil 1A, B).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Karşılaştırma-OCTF analizi NOT: MATLAB, görüntü analizi yapmak için kullanılır.<ol><li>Vis-OCT hacminden vis-OCT fibergramları oluşturmak için, retinanın yüzeyini tespit etmek için yoğunluğa dayalı bir eşik yöntemi (MATLAB kod satırı 808) kullanın. NOT: Bu çizgiler, bscan'in yoğunluk değerlerini ayarlamak için imadjust işlevini kullanır. imadjust öğesine iletilen [0,0087 0,08] bağımsız değişkeni, çıktı görüntüsünün tam dinamik aralığına eşlenecek yoğunluk aralığını belirtir.</li>
		<li>İlk ~16 μm derinliğini seçerek RNFL'yi kırpın. Bkz. Matlab kod satırı 782. NOT: Yetişkin vahşi tip C57BL/6 faredeki tipik in vivo RSLT kalınlığı ~14 μm'dir ve farklı segmentasyon yöntemleriarasında değişebilir 13.</li>
		<li>RAW dosyasının (satır 9), Yeniden yapılandırma dosyalarının (satır 11) ve dosya adının (satır 15) yollarını değiştirin, Çalıştır'a tıklayın ve OCT görüntüsünün MATLAB kodu tarafından analiz edilmesini bekleyin. RGC akson demetleri ve çevresindeki damar sisteminden oluşan fibergram görüntüsünü oluşturmak için eksenel (z) yönü (MATLAB kod satırları 905-908) boyunca ortalama yoğunluk projeksiyonunu hesaplayın. Toplamda ~1,2 x 1,2 mm'yi kapsayan, kan damarlarını tercih edilen bir grafik düzenleyiciyle hizalayarak her FOV için fibergram işlemeden sonra dört görüntüyü monte edin. RAW dosyaları genellikle şu klasöre kaydedilir: Halo Data, OCT görüntüleme tarihi altında (örneğin, 0606 Opticent). NOT: MATLAB kodları Ek Dosya 1'de mevcuttur.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ex vivo konfokal görüntüleme
<ol><li>Fare ötenazisi<ol><li>OCT verilerini elde ettikten sonra, fareleri bir pentobarbital sodyum (390 mg / mL) ve fenitoin sodyum (50 mg / mL) karışımı ile ötenazi yapın. Fenitoin sodyum, kemirgen ötenazisinde yaygın olarak uygulanan pentobarbital sodyumun etkilerini artırarak işlev görür14,15. Her fare için 0,2 mL/20 g seyreltilmiş karışım (156 mg/mL) kullanın ve 20 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ve ardından PBS16,17'de 20 mL %4 paraformaldehit (PFA) ile perfüzasyon yapın.</li>
	</ol></li>
	<li>Göz diseksiyonu ve oryantasyonu<ol><li>Gözleri enüklee edin ve oryantasyonu belirtmek için temporal tarafta bir işaret yapın.</li>
		<li>Ön kamarayı dikkatlice çıkardıktan sonra, oküler lens, vitreus ve göz kapaklarını 30 dakika boyunca PFA'da sabitleyin.</li>
		<li>Vizör lastiğini PBS ile 30 dakika yıkayın ve yıkama sırasında PBS solüsyonunu 3 kez değiştirin. Daha sonra PBS'de (pH 7.5) %0.5 Triton X-100 ile 30 dakika yıkayınız.</li>
		<li>Göz kapaklarını oda sıcaklığında 2 saat boyunca bloke edici tamponda (%2.5 sığır serum albümini ve %0.5 Triton X-100 ile %0.5 eşek serumu) oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>İmmün boyama NOT: Göz kapakları artık RGC akson demetlerini tespit etmek için fare anti-Tuj1'in ve kan damarlarını tespit etmek için sıçan anti-ICAM-2'nin birincil antikorları ile boyanmaya hazırdır.<ol><li>Göz kaplarını 4 ° C'de birincil antikorlar, fare anti-Tuj1 (bloke tamponunda 1:200) ve sıçan anti-ICAM-2 (bloke tamponunda 1:500) ile gece boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Arka planı en aza indirmek ve bağlanmamış antikoru çıkarmak için vizör lastiklerini her seferinde 1 saat boyunca 3-5x %0,5 Triton X-100 (PBST) içeren fosfat tamponlu bir salin solüsyonu ile yıkayın.</li>
		<li>Yıkadıktan sonra, göz kaplarını gece boyunca ikincil antikorlar, Alexa Fluor 488 boyasına (yeşil floresan) konjuge eşek anti-fare İmmünoglobulin G ve Alexa Fluor 594 boyasına (kırmızı floresan) konjuge eşek anti-sıçan IgG ile inkübe edin, hepsi 4 ° C'de bloke edici tamponda 1:1000 oranında seyreltilir.</li>
		<li>Ertesi gün, arka planı en aza indirmek ve bağlanmamış antikoru çıkarmak için göz kapaklarını 3-5x 1 saat boyunca PBST ile yıkayın.</li>
		<li>Düz montajdan önce vizör lastiğini PBS'nin bir Petri kabına aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Düz monteli retina<ol><li>İmmün boyama işleminden sonra, retinaları mikroskop altında göz kapaklarından izole edin.</li>
		<li>Retinaları dört yaprağa kesin ve RGC tabakası yukarı bakacak şekilde düz bir şekilde monte edin. Oryantasyonu belirtmek için retinaya bağlı temporal tarafta işareti bırakın.</li>
		<li>Retinaları montaj ortamı13,18 ile örtün. Slaytları oje13,18,19 ile kapatın.</li>
	</ol></li>
	<li>Konfokal görüntüleme NOT: Konfokal görüntülerin görüntü işlemesi ZEN Mikroskopi Yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir.<ol><li>Konfokal mikroskobu açın ve Konum modunda, mikroskobun göz merceğini kullanarak ilgilendiğiniz alanı bulun.</li>
		<li>Alım modunda, tüm retinayı kaplayacak döşemeler ve tüm bilgi katmanlarını kapsayacak şekilde z-yığını dilimleri ayarlayın. 1,24 μm/piksel piksel boyutunda 5,99 mm (x) x 5,88 mm (y) x 30 μm (z) toplam hacmi kapsayacak şekilde tüm retina boyunca en az 25 karo görüntüleyin.</li>
		<li>İki boyutlu en yüz konfokal mikroskopi görüntüleri oluşturmak için Z-yığını dilimlerini yansıtın (Şekil 1C,D)11,13,19,20,21.</li>
	</ol></li>
</ol>3. İn vivo ve ex vivo görüntülerin hizalanması
<ol><li>Fibergramı işledikten sonra, tüm kan damarlarını tercih edilen bir grafik düzenleyiciyle hizalayarak her fareden elde edilen dört görüntüyü içeren bileşik bir görüntü oluşturun. NOT: Ortalama olarak, nihai bileşik görüntü, Şekil 1B'de gösterildiği gibi yaklaşık 1,2 mm (x) x 1,2 mm (y) boyutlarındadır.</li>
	<li>Kompozit fibergramı hizalamak için optik sinir başını (ONH) ve kan damarlarının modelini yer işaretleri olarak kullanın. Kompozit OCT görüntülerinin kan damarı paternini ICAM-2 ile boyanmış aynı retinanın konfokal görüntüleri ile örtüştürerek in vivo ve ex vivo hizalamayı elde edin.</li>
</ol>

Konfokal Görüntülerle Fare Retina OCT Fibergram Hizalaması

<ol>
	<li>Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+retinal+ganglion+cell+structure+and+function.">Development of retinal ganglion cell structure and function.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).</li><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+types+of+retinal+ganglion+cells:+current+status+and+implications+for+neuronal+classification.">The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li><li>Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture,+function,+and+assembly+of+the+mouse+visual+system.">Architecture, function, and assembly of the mouse visual system.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).</li><li>Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+function,+organization,+and+development+of+the+mouse+superior+colliculus.">Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus.</a> Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).</li><li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+glaucomatous+optic+neuropathy:+the+synergy+between+clinical+observation+and+investigation.">Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation.</a> Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).</li><li>Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glaucoma:+thinking+in+new+ways-a+role+for+autonomous+axonal+self-destruction+and+other+compartmentalised+processes.">Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).</li><li>Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+injury+signaling+and+compartmentalized+injury+response+in+glaucoma.">Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).</li><li>Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-dependent+morphological+and+functional+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+mouse+models+of+experimental+glaucoma.">Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma.</a> Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).</li><li>Tatham, A. J., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+structural+progression+in+glaucoma+with+optical+coherence+tomography.">Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography.</a> Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).</li><li>Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible-light+optical+coherence+tomography:+a+review.">Visible-light optical coherence tomography: a review.</a> Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).</li><li>Miller, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy+for+quantitative+imaging+of+retinal+ganglion+cell+axon+bundles.">Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).</li><li>Beckmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+inner+retinal+layer+structure+in+mice+after+eye-opening+using+visible-light+optical+coherence+tomography.">In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography.</a> Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).</li><li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+damages+in+retinal+ganglion+cell+axon+bundles+monitored+non-invasively+by+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy.">Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).</li><li>Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+Injection+of+Ethanol+for+the+Euthanasia+of+Laboratory+Mice+(Mus+musculus)+and+Rats+(Rattus+norvegicus).">Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).</li><li>Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologic,+Behavioral,+and+Histologic+Responses+to+Various+Euthanasia+Methods+in+C57BL/6NTac+Male+Mice.">Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+degeneration+of+retinal+and+superior+collicular+functions+in+mice+with+sustained+ocular+hypertension.">Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).</li><li>Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+laser-induced+mouse+model+of+chronic+ocular+hypertension+to+characterize+visual+defects.">A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+experimental+glaucoma+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+in+mice.">Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).</li><li>Thomson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-1+knockout+mice+as+a+genetic+model+of+open-angle+glaucoma.">Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).</li><li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+ocular+hypertension+induces+dendritic+degeneration+of+mouse+retinal+ganglion+cells+that+depends+on+cell+type+and+location.">Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).</li><li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+analysis+of+retinal+ganglion+cell+damage+at+individual+axon+bundle+level+in+mice+using+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy.">Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).</li></ol>

Chang, S., Yok; Xu, W., Yok; Fan, W., Yok; McDaniel, J.A., Yok; D.A. Miller, Hiç kimse; M. Grannonico, Hiç kimse; M. Liu, Hiç kimse; X. Liu, Hiç kimse; H.F. Zhang'ın Opticent Health'te bu çalışmayı desteklemeyen mali çıkarları var.

Bu protokolde dikkat edilmesi gereken iki adım vardır. İlk olarak, hayvanın derin anestezi altında olduğundan ve OCT görüntülemeden önce gözlerinin tamamen genişlediğinden emin olmak gerekir. Fareler yeterince uyuşturulmazsa, hızlı nefes almaları, fibergramın kalitesini olumsuz yönde etkileyebilecek en yüz görüntülerinin dengesiz hareketlerine yol açabilir. Ayrıca, yetersiz genişleme de görüntü kalitesi üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir, çünkü iris ışığı engelleyere...

Retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) görsel bilgi işlemede kritik bir rol oynar, iç pleksiform tabakadaki (IPL) dendritik ağaçları aracılığıyla sinaptik girdiler alır ve bilgiyi retina sinir lifi tabakasındaki (RNFL) aksonları aracılığıyla beyne iletir 1,2,3,4. Glokom gibi hastalıklı durumlarda, erken RGC dejenerasyonu, hem hastalarda hem de kemirgen modellerindeRNFL, ganglion hücre tabakası (GCL), IPL ve optik sinirde ince değişikliklere neden olabilir 5,6,7,8,9. Bu nedenle, RGC'lerdeki bu morfolojik değişikliklerin erken tespiti, RGC ve görme kaybını önlemek için zamanında müdahale için gereklidir.
Yakın zamanda, RGC hasarının in vivo izlenmesi ihtiyacını karşılamak için görünür ışık optik koherens tomografi (vis-OCT) adı verilen yeni bir klinik kullanıma hazır görüntüleme teknolojisi geliştirdik. Vis-OCT, retinada 1.3 μm'ye ulaşarak eksenel çözünürlüğü iyileştirdi10,11 ve RNFL'deki bireysel RGC akson demetlerinin görüntülenmesine izin verdi. Daha sonra, farelerde tek akson demeti seviyesinde RGC hasarını izlemek ve ölçmek için vis-OCT fibergrafisi (vs-OCTF) kuruldu11,12,13. Bununla birlikte, in vivo bulguları doğrulamak için altın standart ile aynı retinanın ex vivo konfokal görüntülemesi genellikle gereklidir. Bu nedenle, bu çalışma, OCTF'ye karşı elde edilen in vivo görüntülerin, aynı fare retinasının ex vivo konfokal görüntüleri ile nasıl hizalanacağını gösterecektir. Protokol, ex vivo konfokal görüntüleme ile in vivo bulguları doğrulamayı ve hastalıklı durumlarda RGC hasarının altında yatan moleküler ve hücresel değişiklikleri incelemek için bir temel oluşturmayı amaçlamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo 100</td>
			<td>Opticent Health, Evanston, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs and antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Santz Cruz Biotechnology, SC-281692</td>
			<td></td>
			<td>1-2 drops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin powder</td>
			<td>Fisher Scientific, BP9706-100</td>
			<td></td>
			<td>1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202</td>
			<td></td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209</td>
			<td></td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))</td>
			<td>Covetrus, NDC 11695-4860-1</td>
			<td></td>
			<td>15.6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Covetrus, NADA043304</td>
			<td></td>
			<td>114 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Tuj1</td>
			<td>A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia</td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum(NDS)</td>
			<td>Millipore Sigma, S30-100 mL</td>
			<td></td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 
			(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3</td>
			<td></td>
			<td>1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-ICAM-2</td>
			<td>BD Pharmingen, Cat#553325</td>
			<td></td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide drops&#160;</td>
			<td>Covetrus, NDC17478-102-12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 
			(Reagent Grade)</td>
			<td>VWR, CAS: 9002-93-1</td>
			<td></td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories Inc. H2000-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Covetrus, NDC59399-110-20</td>
			<td></td>
			<td>17 mg/kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alignment of visible-light optical coherence tomography fibergrams with confocal images of the same mouse retina

Son yıllarda, biyolojik sistemler ve süreçler hakkında non-invaziv, gerçek zamanlı ve boylamsal bilgi sağlayan in vivo retinal görüntüleme, göz hastalıklarında nöral hasarın objektif bir değerlendirmesini elde etmek için giderek daha fazla uygulanmaktadır. Aynı retinanın ex vivo konfokal görüntülemesi, özellikle hayvan araştırmalarında in vivo bulguları doğrulamak için sıklıkla gereklidir. Bu çalışmada, fare retinasının ex vivo konfokal görüntüsünü in vivo görüntüleriyle hizalamak için bir yöntem gösterdik. Fare retinasının in vivo görüntülerini elde etmek için görünür ışık optik koherens tomografi fibergrafisi (vis-OCTF) adı verilen yeni bir klinik kullanıma hazır görüntüleme teknolojisi uygulandı. Daha sonra in vivo ve OCTF görüntülerini doğrulamak için "altın standart" ile aynı retinanın konfokal görüntülemesini gerçekleştirdik. Bu çalışma sadece moleküler ve hücresel mekanizmaların daha fazla araştırılmasını sağlamakla kalmaz, aynı zamanda in vivo nöral hasarın hassas ve objektif bir değerlendirmesi için bir temel oluşturur.

Retinal ganglion cells (RGCs) play a critical role in visual information processing, receiving synaptic inputs through their dendritic trees in the inner plexiform layer (IPL) and transmitting the information via their axons in the retinal nerve fiber layer (RNFL) to the brain1,2,3,4. In diseased conditions such as glaucoma, early RGC degeneration may result in subtle changes in the RNFL, the ganglion cell layer (GCL), the IPL, and the optic nerve in both patients and rodent models5,6,7,8,9. Early detection of these morphological changes in RGCs is thus essential for timely intervention to prevent RGC and vision loss.
We have recently developed a new clinical-ready imaging technology called visible-light optical coherence tomography (vis-OCT) to satisfy the need for in vivo monitoring of RGC damage. Vis-OCT improved the axial resolution, reaching 1.3 &#181;m in the retina10, 11, allowing for the visualization of individual RGC axon bundles in the RNFL. Subsequently, vis-OCT fibergraphy (vis-OCTF) was established to track and quantify RGC damage at the single axon bundle level in mice11,12,13. However, ex vivo confocal imaging of the same retina as the gold standard is often necessary to validate the in vivo findings. Therefore, this study will demonstrate how to align in vivo images acquired by vis-OCTF with ex vivo confocal images of the same mouse retina. The protocol aims to validate the in vivo findings by ex vivo confocal imaging and establish a foundation for examining the molecular and cellular changes underlying RGC damage in diseased conditions.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Glokom Tanı ve Tedavisi için In Vivo ve Ex Vivo Retinal Görüntülemedeki Gelişmeler 

Görünür Işık Optik Koherens Tomografi Fibergramlarının Aynı Fare Retinasının Konfokal Görüntüleri ile Hizalanması

We present a protocol for aligning in vivo VIS-OCT images with ex vivo immunostained retinal nerve fibers to validate our novel imaging technology. VIS-OCT enables visualization of retinal nerve fibers in vivo, and this process confirms the accuracy of our findings. Our protocol combines in vivo and ex vivo imaging to provide a real time visualization of retina structure and confirm findings.The process is applicable to mouse models of eye diseases, provided the anterior eye portion allows for optical imaging. This includes diabetic retinopathy and retinal ischemia models. These studies lay the foundation for establishing an objective evaluation of neuro damage in humans, which can significantly improve glaucoma diagnosis and treatment in the future.

Kompozit vis-OCT fibergramı, RGC aksonları için Tuj-1 ile immün boyanmış düz monte retinanın karşılık gelen konfokal görüntüsü ile karşılaştırılır (Şekil 1D, üst panel). Vis-OCTF ile görüntülenen akson demetleri, konfokal görüntüde Tu-j1 etiketli akson demetleri ile eşleştirilebilir. Kan damarları genellikle, konfokal görüntüdeki ICAM-2 etiketli kan damarları ile eşleştirilebilen fibergram görüntülerinde çevredeki akson demetlerine kıyasla ayırt ed...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment at JoVE.com

Mevcut protokol, in vivo görüntülerde gözlenen retinal ganglion hücre akson demeti morfolojisini doğrulamak amacıyla in vivo görünür ışık optik koherens tomografi fibergrafi (vis-OCTF) görüntülerini aynı fare retinasının ex vivo konfokal görüntüleriyle hizalama adımlarını özetlemektedir.

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Yeni görüntüleme teknolojimizi doğrulamak için in vivo VIS-OCT görüntülerinin ex vivo immün boyalı retina sinir lifleri ile hizalanması için bir protokol sunuyoruz. VIS-OCT, retina sinir liflerinin in vivo olarak görüntülenmesini sağlar ve bu işlem bulgularımızın doğruluğunu teyit eder. Protokolümüz, retina yapısının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlamak ve bulguları doğrulamak için in vivo ve ex vivo görüntülemeyi birleştirir.İşlem, ön göz kısmının optik görüntülemeye izin vermesi koşuluyla, göz hastalıklarının fare modellerine uygulanabilir. Buna diyabetik retinopati ve retinal iskemi modelleri dahildir. Bu çalışmalar, gelecekte glokom tanı ve tedavisini önemli ölçüde iyileştirebilecek insanlarda nöro hasarın objektif bir değerlendirmesini oluşturmak için temel oluşturmaktadır.

alignment-visible-light-optical-coherence-tomography-fibergrams-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

883 Görüntüleme.  University of Virginia. Yeni görüntüleme teknolojimizi doğrulamak için in vivo VIS-OCT görüntülerinin ex vivo immün boyalı retina sinir lifleri ile hizalanması için bir protokol sunuyoruz. VIS-OCT, retina sinir liflerinin in vivo olarak görüntülenmesini sağlar ve bu işlem bulgularımızın doğruluğunu teyit eder. Protokolümüz, retina yapısının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlamak ve bulguları doğrulamak için in vivo ve ex vivo görüntülemeyi birleştirir.İşle...

Video: Yazar Spotlight: Gelişmiş Glokom Tanı ve Tedavisi için In Vivo ve Ex Vivo Retinal Görüntülemedeki Gelişmeler 

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Nörobilim

In Vivo Visible Light Optical Coherence Tomography (OCT) Mouse Retinal Imaging

Start by positioning the anesthetized mouse on the animal holder and securing it with two Velcro straps. Turn on the computer and open the software to activate the laser. Adjust the animal holder to center the laser in the mouse's eye.Visualize the posterior part through an on-face preview, the field of view of the superficial vascular plexus, a B scan, and the retina cross-section within the field of view. Acquire a visible light optical coherence tomography, or vis-OCT volume after making minor adjustments to the optical focus. Align the optical nerve head in each of the four corners of the field of view to cover different retinal areas.Use an intensity-based threshold method to detect the retina surface, and generate vis-OCT fiber grams from the volume. Crop the retinal nerve fiber layer, or RNFL, by selecting the first 16 micrometers depth. Next, calculate the mean intensity projection along the axial direction to generate the fiber gram image composed of retinal ganglion cell axon bundles and surrounding vasculature.Align the blood vessels using a graphics editor to montage the four images post-processing. The composite vis-OCT fiber gram is compared with the corresponding confocal image of flat-mounted retina immunostained with TUJ1 for RGC axons. Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM II labeled blood vessels on the confocal image.Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC exon bundle networks and surrounding retinal vasculature.

In Vivo Görünür Işık Optik Koherens Tomografi (OCT) Fare Retinal Görüntüleme

Ex Vivo Confocal Imaging of Mouse Retina

Enucleate the eyes of a euthanized mouse, marking the temporal side for orientation purposes. Remove the anterior chamber. Then remove the lens and vitreous and place eye cups in paraformaldehyde for 30 minutes.Wash eye cups with PBS for 30 minutes. Replacing the solution three times. Then, wash with 0.5%Triton X-100 for 30 minutes.Incubate eye cups in the blocking buffer for two hours at room temperature. After immunostaining, isolate the retinas from the eye cups using a microscope. Divide the retinas into four leaves and flat mount them with the retinal ganglion cell layer facing up.Ensure the mark on the temporal side remains attached for orientation. Cover the retinas with mounting medium. Place cover slips.And seal the slides using nail polish. Turn on the confocal microscope and under Locate mode, find the area of interest using the eye piece. Switch to Acquisition mode and set up tiles to cover the entire retina, along with Z-Stack slices for all layers of information.Image at least 25 tiles across the whole retina to achieve a total volume. Project the Z-Stack slices to generate two-dimensional on-face confocal microscopy images. The composite vis-OCT fibergram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina immunostained with TuJ1 for RGC axons.Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM-2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.

Fare Retinasının Ex Vivo Konfokal Görüntülemesi

Alignment of In Vivo and Ex Vivo Mouse Retinal Images

Start by creating a composite image using the four obtained images from each mouse. Utilize a graphics editor to align all the blood vessels, employ the optic nerve head and blood vessel patterns as landmarks for aligning the composite fiber gram overlap the composite images and the confocal images of the same retina stained with ICAM2, to achieve in vivo and ex vivo alignment. The composite vis-oct fiber gram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina.Immuno stain with TUJ1 for RGC axons. Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-oct revealed identical RGC Axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.