Yazarlar, mutant ve transgenik stokları sağladıkları için Mısır Genetiği İşbirliği, Mısır Hücresi Genomiği Projesi, Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratuvarı, NY), Anne W. Sylvester (Deniz Biyolojisi Laboratuvarı, Chicago Üniversitesi, IL), Andrea Gallavotti (Rutgers Üniversitesi, NJ) ve Carolyn G. Rasmussen'e (Kaliforniya Üniversitesi, Riverside) ve ayrıca Robert F. Baker ve Alexander Jurkevich'e teşekkür etmek istiyor. Missouri-Columbia, konfokal mikroskopi ile ilgili yardımları için. JMR, J. William Fulbright Bursu, Diane P. ve Robert E. Sharp Fonu ve Ulusal Bilim Vakfı'nın Bitki Genomu Araştırma Programı (IOS-1546873) tarafından PM'ye desteklenmiştir. CDTC, EDCDP ve RJRR, DOST-SEI S&T Lisans Bursu ile desteklenmektedir. DODL, Fr. Thomas Steinbugler SJ Akademik Bursu tarafından desteklenmektedir. RJRR, Aiducation International-Pathways to Higher Education Bursu tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma Fen ve Mühendislik Fakültesi ve Ateneo de Manila Üniversitesi Rizal Kütüphanesi tarafından desteklenmiştir.

Mısır Yaprağı Primordia'yı Görüntülemek için Geliştirilmiş Yöntemler

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Mısır yaprağı primordiasını hücresel görüntüleme için hazırlamak için iki yöntem sunuyoruz. İlk yöntem (protokol bölüm 2), enine kesit analizi için primordiumun ölçülmesine izin verirken, ikinci yöntem (protokol bölüm 3), tüm montaj analizi için primordiumun açılmasını ve düzleştirilmesini sağlar. Bu yöntemler, mısır yaprağı primordia24'teki FP'lerin hücresel görüntülemesini kolaylaştırır (Şekil 4 ve Şekil 5'te gösterildiği gibi) ve mısır yaprakları geliştirmenin görüntülenmesinin zorluklarına basit çözümler sunar. Protokol bölüm 2, diseksiyon süresini azaltır ve yalnızca evrelemeparametrelerine 9,16 güvenmek yerine, kesitlemeden önce primordia'yı ölçerek örnekleme doğruluğunu artırır. Ticari olarak temin edilebilen nano bant ile, protokol bölüm 3, mısırda tam yapraklı primordia'nın görüntülenmesi ile ilgili uzun süredir devam eden sorunu çözer. Bu protokol, diyaliz tüpü 31'i kullanan önceki yöntemi geliştirir ve BT ve MRG11,32,33'e çok daha ucuz bir alternatiftir. Bununla birlikte, yaprak anatomik özelliklerinin görselleştirilmesi ve optimal sonuçların üretilmesi söz konusu olduğunda, her iki protokolün de Tablo 2'de özetlenen ve aşağıda daha ayrıntılı olarak tartışılan bazı sınırlamaları vardır.
Protokol bölüm 2'de, yaprak primordiasının kalın enine kesitlerinde hücre ana hatlarını görselleştirmede zorlukla karşılaştık ve hücre duvarı veya plazma zarı bağlayıcı floresan boyalarla karşı boyama tatmin edici sonuçlar vermedi. Örneğin, FM 4-64, plazma membranı FP belirteci p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Şekil 3A-D). Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, hücre ana hatlarının canlı bir parlak alan görüntülemesine veya karşı boyama protokolünün optimize edilmesine izin verecek daha ince doku kesitleri (~ 0,1 mm)58 üretmek için bir vibratom kullanmanızı öneririz 47,59.
Protokol bölüm 3'te ana sınırlama, protokol adımları 3.2.5-3.2.6'da (Şekil 3E-K) ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, yaprağın yırtılma, hasar görmeden veya hava kabarcıkları olmadan monte edilmesinin zorluğudur. Mısır yaprağı iki taraflı simetrik olduğundan, görselleştirme için tam yapraklı bir montaj yerine yarım yapraklı bir montaj yeterli olabilir9. Bunu yapmak için, primordiyum, midrib'e kadar açıldıktan sonra uzunlamasına eksen boyunca bir tıraş bıçağı ile kesilebilir, böylece yaprağın sadece yarısının monte edilmesine izin verilir. Protokol bölüm 3'ün bir başka sınırlaması, yaprağın kalınlığının derin görüntüleme sırasında florofor sinyalinin optik çözünürlüğünü sınırlayabilmesidir. Bu sorunu çözmek için, bir doku temizleme tekniği60 kullanmak mümkündür. Bununla birlikte, bitki dokularını görüntülemek için yaygın olarak kullanılan bir temizleme reaktifi olan ClearSee61'in protokolle uyumlu olmadığını bulduk, çünkü numunenin ve kapak kaymasının nano banttan ayrılmasına neden oluyor. Bu soruna potansiyel bir çözüm, yaprak numunesi üzerine yarı geçirgen bir membran31 uygulamak ve nano bant tarafından yerinde tutulurken temizleme çözeltisi ile muamele edilmesine izin vermek olabilir. Yuvarlanmamış yaprağa sıvı çözeltilerin uygulanmasına izin veren böyle bir yöntem, daha önce mısır salkımını geliştirmek için optimize edilmiş, ancak tam yapraklı primordia62,63 için değil, tam montajlı RNA in situ hibridizasyon ve immünolokalizasyon teknikleri için de kullanılabilir.
Fide aşamasında bile büyük yaprak primordiasına sahip olan mısır için protokolleri tanımladık. Pirinç, arpa, buğday, Setaria ve Brachypodium 16,23,64,65,66 gibi çok daha küçük yaprak primordiasına sahip diğer çim türleri, bu protokolleri etkili bir şekilde uygulamak için ek hassas araçların kullanılmasını gerektirebilir. Ayrıca, bu protokoller, doku oluşumunun ve hücresel yanıtların gerçek zamanlı dinamik süreçlerini yakalayan canlı hücre görüntülemesi için tasarlanmamıştır. Bununla birlikte, floresan problar, görüntüleme teknolojileri ve bilgi işlem yetenekleri bitkiler için canlı hücre görüntülemede ilerlemeye devam ettikçe67, gelecekteki araştırmalar, çim yaprağı primordiasının benzersiz özelliklerine uyarlanmış canlı hücre görüntüleme stratejileri geliştirmek için bu protokoller üzerine inşa edilebilir.

Çim bitkileri,küresel nüfus 1 için önemli bir gıda ve biyoyakıt kaynağıdır ve yaprak anatomisinin iyileştirilmesi, verimliliklerini artırma potansiyeline sahiptir 2,3. Bununla birlikte, yaprak anatomisinin çimlerde nasıl düzenlendiğine dair mevcut anlayışımızsınırlıdır 4 ve yaprağın birçok anatomik ve fizyolojik özelliği gelişimin erken dönemlerinde önceden belirlendiğinden, yaprak primordiasının analizini gerektirir 5,6,7. Floresan ve konfokal görüntüleme gibi hücresel görüntüleme teknikleri, çim yaprağı anatomisini ve hücresel özelliklerini incelemek için vazgeçilmezdir, ancak bu tekniklerin çim yaprağı primordiasına uygulanması zordur, çünkü bunlar yaprak fahişesi içinde derinlemesine kaplanmış ve yuvarlanmıştır. Bu sorunu, çim yaprağı anatomisini ve gelişimini incelemek için bir model sistem olan mısır yaprağı primordiasının floresan ve konfokal analizi için enine kesitler ve yuvarlanmamış tam yaprak montajları hazırlamak için yöntemler geliştirerek ele aldık 2,8.
Mısır yaprağı, tüm çim yaprakları gibi, sapın etrafını saran ve 9,10,11,12,13 filizlenen bir kılıfa sahip kayış benzeri bir bıçaktan oluşur. Yapraklar, sürgün apikal meristeminden (SAM) distichous bir desende gelişir, burada her yeni yaprak bir önceki yaprağın zıt pozisyonunda başlar ve dikey eksen boyunca iki yaprak sırası ile sonuçlanır (Şekil 1A)14 . Her yaprak primordiyumunun gelişim aşaması, SAM'a göre konumu ile tanımlanır, en yakın primordyum plastochron1 (P1) olarak adlandırılır ve aşağıdaki primordia P2, P3 vb. olarak adlandırılır (Şekil 1B, C)2. Geliştirme sırasında (Şekil 1D), yaprak primordiyumu ilk önce SAM'ın (P1) tabanı etrafında hilal şeklinde bir payanda olarak görünür ve daha sonra meristem (P2) 9,10,11 üzerinde uzanan başlık şeklinde bir primordiyuma dönüşür. Kaputun bazal kenar boşlukları daha sonra yanal olarak genişler ve uç yukarı doğru büyüdükçe üst üste binerek koni şeklinde bir primordyum (P3-P5)10 oluşturur. Primordium daha sonra hızla uzar ve tabandaki kılıf-bıçak sınırı, yaprağın adaksiyel tarafındaki saçak benzeri projeksiyon olan ligule oluşumu ile daha belirgin hale gelir (P6 / P7). Son olarak, yaprak kararlı durum büyümesi sırasında ortaya çıkarken açılır, burada bölünen hücreler bıçağın küçük bazal bölgesi içinde kısıtlanır, proksimal-distal eksen boyunca genişleyen ve farklılaşan hücrelerle bir gradyan oluşturur (P7 / P8)15. Bir mısır fidesinin sürgün tepesi, gelişimin farklı aşamalarında birden fazla primordia içerir ve bu da onu yaprak gelişimini incelemek için mükemmel bir model haline getirir8.
Erken yaprak gelişiminin doğru analizi, diğer büyüme veya morfolojik parametrelerle ilişkili olarak primordyum gelişiminin farklı aşamalarını tanımlamak için evreleme veya standartlaştırılmış kriterlerin kullanılmasını gerektirir. Yaprak primordiası çim çekiminin içine gizlendiğinden, araştırmacılar tipik olarak bitkinin yaşı veya ortaya çıkan yaprakların büyüklüğü gibi parametreleri yaprak primordiasının aşamaları ve boyutları için öngörücü olarak kullanırlar 9,16. Mısırda, bitkinin kronolojik yaşı, ekimden veya çimlenmeden sonraki gün sayısına göre belirlenir (DAP / DAG)17,18. Vejetatif aşama (V aşaması), görünür bir yakaya sahip en üstteki yaprak, bıçak ile kılıf arasındaki abaksiyel tarafta ligule ve kulak kepçelerinin konumuna karşılık gelen soluk bir çizgi, bıçağın tabanında bir çift kama şeklinde bölge tarafından belirlenir (Şekil 1A, B)17,19 . 20 ila 25 DAG arasında, SAM çiçeklenme meristemine dönüşür ve yeni yapraklar üretmeyi bırakır20. Mısır yaprağı primordiasının büyüme oranları, çevreye ve bitkinin genotipine bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, bitki yaşı ve ortaya çıkan yaprakların büyüklüğü, yaprak primordiasının boyutlarını doğru bir şekilde tahmin edemez; Bununla birlikte, bu parametrelerin kullanılması, deneysel amaçlar için primordia aşamalarının ve boyutlarının aralığını tahmin etmeye yardımcı olabilir.
Enine kesit analizi, mısır ve diğer çimlerde yaprak anatomisini ve gelişimini incelemek için popüler bir yöntemdir, çünkü sürgün21,22,23 boyunca tek bir bölümde birden fazla plastokronun örneklenmesine izin verir. Bu yöntem aynı zamanda taze numunelerin hücresel görüntülenmesi için de uygundur, çünkü çevreleyen yapraklar kesitleme ve montaj sırasında yaprak primordiasını yerinde tutan bir iskele görevi görür24. Bununla birlikte, bu yöntemin bir dezavantajı, sağlam bir çekimden kesit alırken hedef plastokronun ve bölgenin primordiyum içinde tam olarak konumlandırılmasının zor olabilmesidir. Ayrıca, yaprak büyümesi plastokronlar arasında ve proksimal-distal eksen2,5 boyunca değiştiğinden, kesin olmayan örnekleme, belirli bir bölümdeki primordiumun gelişim aşamasının ve bölgesinin yanlış yorumlanmasına neden olabilir. Bu nedenle, hassas enine kesit örneklemesi için bir yöntem geliştirmek, çim yaprağı primordiasının anatomik ve gelişimsel analizlerinin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için kritik öneme sahiptir.
Tam yaprak montaj analizi, proliferatif büyüme 25 ve damar desenleme26,27,28 gibi tüm organ ölçeğinde meydana gelen doku ve hücresel süreçlerin kapsamlı ve bütünleştirici bir şekilde araştırılmasını sağlar. Yöntem, yaprağın paradermal bir genel bakışını sağlar ve enine kesit analizi24,27 kullanılarak tespit edilmesi zor olacak farklı süreçlerin ve kalıpların keşfedilmesini sağlar. Tam yaprak montajlarını görüntülemek için zaten belirlenmiş yöntemlerin bulunduğu Arabidopsis'in aksine29,30, şu anda çimlerde yuvarlanmamış tam yaprak montajlarını görüntülemek için standart bir yöntem yoktur. İzole mısır yaprağı primordiasının açılması için önceki bir protokol nadir materyalleri içeriyordu ve hücresel görüntüleme için uygun değildi31. Bilgisayarlı tomografi (BT) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi gelişmiş görüntüleme teknikleri, primordia 11,32,33'ü izole etmeden ve açmadan 3D anatomik bilgi elde edebilir, ancak pahalıdır ve özel ekipman gerektirir. Mısır ve diğer otlardaki yaprak primordiasının haddelenmiş ve konik morfolojisinin getirdiği kısıtlamaların üstesinden gelmek için bir teknik geliştirmek, anatomik ve gelişimsel özelliklerine yönelik araştırmaları ilerletecektir.
Burada, floresan ve konfokal görüntüleme için enine kesitler ve açılmış mısır yaprağı primordialarının bütün montajlarını hazırlamak için yöntemler sunuyoruz. Bu yöntemleri damar sayısını ölçmek ve mısır yaprağı primordiasında mekansal-zamansal hormon dağılımını floresan proteinlerle (FP'ler) haritalamak için kullandık24. İlk yöntem, yaşlı yaprakların üst kısmının mısır fidelerinden bir tel sıyırıcı ile çıkarılmasını içerir (Şekil 1E). Primordiumun ucunu (P5-P7) açığa çıkararak, eski çevreleyen yaprakları tamamen çıkarmak zorunda kalmadan uzunluğunu belirlemek mümkün hale gelir, böylece kolay ve doğru bölümleme sağlanır. İkinci yöntem, tüm yapraklı primordia'nın (P3-P7) şeffaf, çift taraflı nano bantla açılmasını ve monte edilmesini içerir (Şekil 1F). Bu yöntemler çeşitli FPs24'ü görselleştirmek için uygundur, ancak floresan boyaları ve temizleme reaktiflerini kullanmak için optimizasyona ihtiyaç duyar. Ek olarak, z-yığınlarını düzleştirmek, görüntüleri dikmek ve ImageJ / FIJI34'teki kanalları birleştirmek için iki yöntemle üretilen görüntüler için geçerli olan bazı prosedürleri özetliyoruz. Bu yöntemler, mısır yapraklarının rutin floresansı veya konfokal görüntülenmesi için yararlıdır, ancak pirinç, Setaria ve Brachypodium gibi diğer model çim türleri için de uyarlanabilirler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> Şekil 1: Mısır yaprağı primordiasının organizasyonu ve morfolojisi ve yöntemlere genel bakış . (A) Bir mısır fidanının şematik gösterimi. Mısır, yeni yaprağın önceki yaprağın zıt pozisyonunda başladığı distichous phyllotaxy'ye sahiptir. Yaprak numarası, yaprakların çimlenmeden ortaya çıktığı kronolojik sırayı gösterir (yani, birinci yaprak, L1; ikinci yaprak, L2; üçüncü yaprak, L3; vb.). Her yaprağın distal bir bıçağı ve ligule ve kulak kepçesine karşılık gelen bir yaka ile çizilmiş bazal bir kılıfı vardır. Yakası görülebilen en üstteki yaprak vejetatif aşamayı gösterir. Bu örnekteki fide V2 aşamasındadır ve L2 tasması (ok ucu) görülebilir. Makas simgesi, fidenin toplanması için kesilmesi gereken mezokotil (me) yerini gösterir. (B) İzole edilmiş L1'den L4'e kadar olan disseke edilmiş çekimin şematik gösterimi, yaprak primordia L5 ila L9 (C)'de büyütülmüş bir görüntü olarak gösterilir. Plastochron sayısı, primordiumun SAM'a göre konumunu gösterir, en genç yaprak primordium (P1) SAM'a en yakın ve daha yaşlı yaprak primordia (P2, P3, P4vb.) art arda 2'den daha uzaktadır. (D) Mısır yaprağı primordiasının P1'den P5'e morfolojisinin şematik gösterimi. (E) Mısır yaprağı primordiasının enine kesit analizi yöntemine şematik genel bakış. (1) Eski yaprakları bir tel sıyırıcı ile kesin. (2) Primordiumu ölçün ve çekimi kesinleştirin. (3) Görüntüleme ve işleme için bölümü bir slayta monte edin (4, 5). (F) Mısır yaprağı primordiasının tam montajlı analizi için yönteme şematik genel bakış. (1) Primordiumu çıkarmak için çevredeki yaprakları çıkarın. (2) Primordiumu nano bant üzerinde düz bir şekilde kesin ve açın. (3) Numuneyi görüntüleme ve işleme için monte edin (4, 5). Kısaltmalar: L = yaprak; bl = bıçak; sh = kılıf; co = yaka; me = mezokotil; V = bitkisel; P = plastokron; SAM = apikal meristemi vur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

Mısır (Zea mays) ve diğer otlarda (Poaceae), yaprak primordiası yaprak fahişesi içinde derinlemesine kaplanır ve yuvarlanır, bu da erken yaprak gelişimini incelemeyi zorlaştırır. Burada, floresan ve konfokal görüntüleme için enine kesitler ve açılmış bütün mısır yaprağı primordia montajlarını hazırlama yöntemlerini açıklıyoruz. İlk yöntem, eski yaprakların üst kısımlarını çıkarmak, yaprak primordiyumunun ucunu açığa çıkarmak ve daha doğru enine kesit örneklemesi için ölçümüne izin vermek için bir tel sıyırıcı kullanır. İkinci yöntem, görüntüleme için tüm yaprak primordiasını açmak ve monte etmek için açık, çift taraflı nano bant kullanır. İki yöntemin mısırdaki floresan protein muhabirlerini görselleştirme ve analiz etmedeki faydasını gösteriyoruz. Bu yöntemler, mısır yaprağı primordiasının ayırt edici morfolojisinin sunduğu zorluklara bir çözüm sunar ve mısır ve diğer çim türlerinde yaprak anatomik ve gelişimsel özelliklerini görselleştirmek ve ölçmek için yararlı olacaktır.

Grass crops are a major source of food and biofuel for the global population1, and improving leaf anatomy has the potential to increase their productivity2,3. However, our current understanding of how leaf anatomy is regulated in grasses is limited4 and requires the analysis of leaf primordia, as many anatomical and physiological traits of the leaf are predetermined early in development5,6,7. Cellular imaging techniques, such as fluorescence and confocal imaging, are indispensable for studying grass leaf anatomy and cellular traits, but these techniques are difficult to apply to grass leaf primordia because they are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl. We addressed this issue by developing methods for preparing transverse sections and unrolled whole-leaf mounts for fluorescence and confocal analysis of maize leaf primordia, a model system for studying grass leaf anatomy and development2,8.
The maize leaf, like all grass leaves, consists of a strap-like blade with a sheath that wraps around the stem and developing shoot9,10,11,12,13. The leaves develop from the shoot apical meristem (SAM) in a distichous pattern, where each new leaf initiates in the opposite position of the previous leaf, resulting in two ranks of leaves along the vertical axis&#160;(Figure 1A)14 . The developmental stage of each leaf primordium is identified by its position relative to the SAM, with the closest primordium designated as plastochron1 (P1) and the following primordia designated as P2, P3, and so on (Figure 1B,C)2. During development (Figure 1D), the leaf primordium first appears as a crescent-shaped buttress around the base of the SAM (P1), and then grows into a hood-shaped primordium that extends over the meristem (P2)9,10,11. The basal margins of the hood then expand laterally and overlap each other as the tip grows upward, forming a cone-shaped primordium (P3-P5)10. The primordium then rapidly grows in length, and the sheath-blade boundary at the base becomes more prominent with the formation of the ligule, the fringe-like projection on the adaxial side of the leaf (P6/P7). Finally, the leaf unrolls as it emerges from the whorl during steady-state growth, in which the dividing cells are restricted within the small basal region of the blade, forming a gradient with expanding and differentiating cells along the proximal-distal axis (P7/P8)15. The shoot apex of a maize seedling contains multiple primordia at different stages of development, making it an excellent model for studying leaf development8.
Accurate analysis of early leaf development requires staging or the use of standardized criteria to define distinct stages of primordium development in relation to other growth or morphological parameters. Because the leaf primordia are hidden within the grass shoot, investigators typically use parameters such as the age of the plant or the size of the emerging leaves as predictors for the stages and sizes of the leaf primordia9,16. In maize, the chronological age of the plant is determined either by the number of days after planting or germination (DAP/DAG)17,18. The vegetative stage (V stage) is determined by the uppermost leaf with a visible collar, a pale line on the abaxial side between the blade and the sheath that corresponds to the position of the ligule and auricles, a pair of wedge-shaped regions at the base of the blade&#160;(Figure 1A,B)17,19 . Between 20 and 25 DAG, the SAM transitions into an inflorescence meristem and ceases to produce new leaves20. The growth rates of maize leaf primordia can vary depending on the environment and the genotype of the plant. For this reason, plant age and the size of the emerging leaves cannot accurately predict the sizes of leaf primordia; however, using these parameters can help predict the range of primordia stages and sizes for experimental purposes.
Transverse section analysis is a popular method for examining leaf anatomy and development in maize and other grasses because it allows for the sampling of multiple plastochrons in a single section across the shoot21,22,23. This method is also convenient for cellular imaging of fresh samples, as the surrounding leaves serve as a scaffold&#160;that keeps the leaf primordia in place during sectioning and mounting24. However, a disadvantage of this method is that it can be challenging to precisely locate the target plastochron and region within the primordium when sectioning from an intact shoot. Furthermore, because leaf growth varies across plastochrons and along the proximal-distal axis2,5, imprecise sampling could result in an incorrect interpretation of the developmental stage and region of the primordium in a given section. Therefore, developing a method for precise transverse section sampling is critical for ensuring the accuracy and reproducibility of anatomical and developmental analyses of grass leaf primordia.
Whole-leaf mount analysis enables the comprehensive and integrative investigation of tissue and cellular processes that occur at the whole-organ scale, such as proliferative growth25 and vein patterning26,27,28. The method provides a paradermal overview of the leaf, allowing the discovery of distinct processes and patterns that would otherwise be difficult to detect using transverse section analysis24,27. Unlike in Arabidopsis, where there are already established methods for imaging whole-leaf mounts29,30, there is currently no standard method for imaging unrolled whole-leaf mounts in grasses. A previous protocol for unrolling isolated maize leaf primordia involved uncommon materials and was not suitable for cellular imaging31. Advanced imaging techniques, such as computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), can acquire 3D anatomical information without isolating and unrolling the primordia11,32,33, but they are expensive and require specialized equipment. Developing a technique to overcome the constraints imposed by the rolled and conical morphology of leaf primordia in maize and other grasses would advance investigations into their anatomical and developmental traits.
Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. We used these methods to quantify vein number and map the spatial-temporal hormone distribution in maize leaf primordia with fluorescent proteins (FPs)24. The first method involves removing the upper portion of older leaves from maize seedlings with a wire stripper (Figure 1E). By exposing the tip of the primordium (P5-P7), it becomes possible to determine its length without having to completely remove the older surrounding leaves, thus enabling easy and accurate sectioning. The second method involves unrolling and mounting whole-leaf primordia (P3-P7) with clear, double-sided nano tape (Figure 1F). These methods are suitable for visualizing various FPs24&#160;but need optimization for using fluorescent dyes and clearing reagents. In addition, we outline some procedures for flattening z-stacks, stitching images, and merging channels in ImageJ/FIJI34, which apply to the images produced by the two methods. These methods are useful for routine fluorescence or confocal imaging of maize leaves, but they can also be adapted for other model grass species, such as rice, Setaria, and Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" /> 
Figure 1: Organization and morphology of maize leaf primordia and overview of the methods. (A) Schematic representation of a maize seedling. Maize has a distichous phyllotaxy, with the new leaf initiating at the opposite position of the previous leaf. The leaf number indicates the chronological order in which the leaves emerged from germination (i.e., first leaf, L1; second leaf, L2; third leaf, L3; etc.). Each leaf has a distal blade and a basal sheath delineated by a collar that corresponds to the ligule and auricle. The uppermost leaf with the collar visible denotes the vegetative stage. The seedling in this example is at the V2 stage, with the L2 collar (arrowhead) visible. The scissors icon indicates the location at the mesocotyl (me) where the seedling must be cut in order to be collected. (B) Schematic representation of the dissected shoot showing isolated L1 to L4, with the leaf primordia L5 to L9 shown as an enlarged image in (C). The plastochron number indicates the position of the primordium relative to the SAM, with the youngest leaf primordium (P1) closest to the SAM and the older leaf primordia (P2, P3, P4, and so on) successively farther away2. (D) Schematic representation of the morphology of maize leaf primordia from P1 to P5. (E) Schematic overview of the method for transverse section analysis of the maize leaf primordia. (1) Trim the older leaves with a wire stripper. (2) Measure the primordium and section the shoot. (3) Mount the section on a slide for imaging and processing (4, 5). (F) Schematic overview of the method for whole-mount analysis of the maize leaf primordia. (1) Remove the surrounding leaves to extract the primordium. (2) Cut and unroll the primordium flat on the nano tape. (3) Mount the sample for imaging and processing (4, 5). Abbreviations: L = leaf; bl = blade; sh = sheath; co = collar; me = mesocotyl; V = vegetative; P = plastochron; SAM = shoot apical meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Yazar Spot Işığı: Floresan ve Konfokal Görüntüleme için Mısır Yaprağı Primordia'nın Enine Kesitlerini ve Açılmamış Bütün Montajlarını Hazırlamak için Geliştirilmiş Yöntemler  

Enine kesitler hazırlamak için geliştirilmiş yöntemler ve floresan ve konfokal görüntüleme için mısır yaprağı primordiasının bütün montajlarını açma

Mısır yaprağı primordiasının enine kesit analizi Damar sayısını ölçmek ve FP'lerle mısır yaprağı primordiasının enine kesitlerinde hormon yanıt paternlerini karakterize etmek için protokol bölüm 2'yi kullandık (Şekil 4)24. Bitki hormonu oksininin yaprak büyümesi ve damar oluşumundaki rolünü değerlendirmek için, oksin eksikliği olan bir mısır mutantının yaprak primordiasındaki damar sayısını ölçtük, kaybolan püskül254. Erken plastokronlarda, gelişmekte olan damarlar, mısır yaprağı primordium21,22'nin medyan hücre tabakasında belirgin hücreselleşme sergiler. Bununla birlikte, geleneksel histolojik teknikler22 kullanılarak damarların tanımlanması ve sayılması emek yoğun ve zaman alıcı olabilir. Bu nedenle, damarları ölçmek için, gelişmekte olan damarları ve prokambiyal iplikçikleri (PCS'ler; Şekil 4A). Protokol bölüm 2'yi kullanarak, kesitlemeden önce primordia'yı ölçerek enine kesit örneklemesini standartlaştırabildik (Şekil 4B, C). Vt2'nin normalden daha geniş bir primordyuma ve daha fazla damara sahip olduğu bir eğilim keşfettik (Şekil 4D, E)24, tamamen genişlemiş yapraklardan elde edilen verilerle tutarlıdır55, vt2'deki kusurun yaprak gelişiminde erken başladığını göstermektedir. Protokol bölüm 2'yi kullanarak, yaprak primordiasındaki hormon yanıtı FP muhabirlerinin ifade kalıplarını sistematik olarak inceleyebildik (Şekil 4F-I'deki görüntülerin örneklerine bakınız). Standartlaştırılmış bir enine kesit örnekleme şeması aracılığıyla, oksin, sitokinin (CK) ve gibberellik asit (GA) yanıtlarının farklı plastokronlar ve yaprak primordia bölgeleri arasındaki dağılımını haritalandırdık ve yaprak büyümesi ve damar oluşumu için etkileri olduğunu varsaydığımız yeni yanıt kalıplarını keşfettik24. Bu nedenle, bu temsili sonuçlar, mısır yaprağı primordiasının enine kesit analizi için protokol bölüm 2'nin yararlılığını göstermektedir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> Şekil 4: Mısır yaprağı primordiasının enine kesit analizi için temsili sonuçlar. (A-E) Normal ve kaybolan püskülün2 yaprak primordiasında damar sayısının ve primordyum genişliğinin oksin efflux protein markörü PIN1a-YFP ile ölçülmesi. (A) Gelişmekte olan damarlarda ve prokambiyal iplikçiklerde PIN1a-YFP'yi ifade eden P5 ila P7 enine kesitlerinin temsili floresan görüntüleri. Enine kesitler bir FITC filtresi (495-519 nm uyarım) kullanılarak bir epifloresan mikroskobu ile görüntülendi. Damar sayısı ve primordyum genişliği, sırasıyla FIJI / ImageJ'deki çok noktalı ve serbest çizgi araçları kullanılarak ölçüldü. (B) Dördüncü yaprağın ucunu (L4) açığa çıkarmak için bir tel sıyırıcı ile çıkarılan üst yaprak olan bir mısır fidesi. Braket, öngörülen primordium uzunluğunu kapsar ve kesikli çizgi orta uzunluğu gösterir. (C) P5'ten P7'ye kadar değişen primordyum şekillerinin şematik diyagramı, orta uzunluktaki damar sayısının ve primordiyum genişliğinin (yatay kesikli çizgi) primordiumun gelişim aşamasına bağlı olarak nasıl değişebileceğini gösterir. (D,E) Normal ve vt2'nin L4'ünün orta uzunluktaki bölümünde primordyum genişliğinin (D) ve damar sayısının (E) ölçülmesi. Eğilim çizgisi, ölçümlerin 10 mm yuvarlanan ortalamalarını ± ortalamanın standart hatasını (SEM) temsil eder. (F-I) PIN1a-YFP, oksin yanıt muhabiri, DR5-RFP, sitokinin yanıt muhabiri, TCS-Domates, gibberellik aside duyarlı belirteç, GAR2-YFP ve oksin sinyal giriş muhabiri DII-Venüs'ün mutasyona uğramış bir versiyonu olan mDII-Venüs'ün kombinasyonlarını ifade eden yaprak primordiasının enine kesitlerinin temsili konfokal görüntüleri. FP kanalları, her görüntüdeki parlak alan kanalına bindirilir. Ölçek çubuğu = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Bu rakam Robil ve McSteen24'ün izniyle değiştirilmiş ve çoğaltılmıştır. Kısaltmalar: DAG = çimlenmeden sonraki günler; P = plastokron; vt2 = kaybolan püskül2; PCS = prokambiyal iplikçik; YFP = sarı floresan proteini; FITC = floresein izotiyosiyanat; RFP = kırmızı floresan proteini; PIN1a-YFP =pZm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Domates = TCSv2::NLS-tdDomates; GAR2-YFP =pZm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venüs = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Mısır yaprağı primordiasının tam montajlı analizi Mısır yaprağı primordiasının bütün yaprak montajlarında FP ekspresyonunu görselleştirmek ve analiz etmek için protokol bölüm 3'ü izledik (Şekil 5). PIN1a-YFP ile ven paternlerini görselleştirerek, damar oluşumunun erken plastokronlar sırasında tüm primordyumda meydana geldiğini, ancak bu sürecin gelişimin ilerleyen dönemlerinde proksimal bölgelerde kısıtlandığını bulduk (Şekil 5A)24. Enine kesit analizlerine tamamlayıcı olarak, tüm yaprak montaj analizleri, damar oluşumu sırasında doku ve aşamaya özgü hormon yanıtı modellerini ortaya çıkarmıştır24. Bir örnek, CK yanıt raporlayıcısı TCSv2::NLS-tdDomates37'nin (TCS-Domates) PIN1a-YFP ifadesine göre ifade desenidir (Şekil 5B)24. Protokol bölüm 3'ü izleyerek, yaprak primordiasında FP ekspresyonunun hem nitel hem de nicel analizlerini yapabildik (Şekil 5D-F; yayınlanmamış veriler). Bir oksin yanıt raporlayıcısı DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP) ve GA-duyarlı bir belirteç olan p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39'un (GAR2-YFP) ekspresyon kalıplarını, GA-eksikliği olan bir mutant 56 olan vt2 ve cüce bitki3 (d3) tek ve çift mutantlarının tam yaprak montajlarında inceledik (Şekil 5D). Ayrıca, hücre döngüsü57'deki G1 / S geçişi için bir belirteç olan p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B: YFP 42 (Cyclin-D2B-YFP) kullanarak normalve vt2 yaprak primordia arasındaki hücre proliferasyonunun göreceli seviyelerini karşılaştırdık (Şekil 5E, F). Normal ve vt2 arasında anlamlı bir fark olmamasına rağmen, Siklin-D2B-YFP ekspresyonu, erken plastokrkronların bilinen hücre proliferasyon profili ile tutarlıydı31. Protokol bölüm 3'ün, haddelenmiş morfolojileri nedeniyle görüntülenmesi zor olan mısır yaprağı primordiasının tüm montajlarını analiz etmek için etkili bir yöntem olduğu sonucuna vardık.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> Şekil 5: Mısır yaprağı primordiasının tam montajlı analizi için temsili sonuçlar. (A) Oksin efflux protein markörü PIN1a-YFP ile işaretlenmiş, gelişmekte olan damarları ve prokambiyal iplikçikleri gösteren 7 DAG mısır fidanının yaprak primordiasının temsili floresan görüntüleri. P3-P6 primordia tabandan çıkarıldı, yuvarlandı ve adaksiyel tarafı yukarı bakacak şekilde düzleştirildi. Girişler P3 ve P4'ün yakın çekimlerini gösterir. P5 ve P6'da, kesikli çizgiler, prokambiyal iplikçiklerin çoğunluğunun hala gelişmekte ve genişlediği proliferatif bölgelerin distal ucunu sınırlar. (B,C) Bir P5 primordiyumunun proksimal marjinal bölgesinde PIN1a-YFP ve sitokinin yanıt muhabiri TCS-Domates ekspresyonunu gösteren temsili konfokal görüntüler. (D) Kaybolan püskül2 ve cüce bitkinin3 normal ve tek ve çift mutantlarında oksin yanıt muhabiri DR5-RFP ve gibberellik aside duyarlı belirteç GAR2-YFP'nin ekspresyonunu gösteren P4 primordia'nın temsili floresan görüntüleri. (E) Hücre döngüsündeki G1/S geçişi için bir muhabir olan Cyclin-D2B-YFP'nin ekspresyonunu gösteren P3 ve/veya P4'ün temsili konfokal görüntüleri. (F) Normal ve vt2'nin P3/P4 yaprak primordiasında hücre proliferasyonunun nispi miktarları, ImageJ/FIJI kullanılarak primordiyum alanı üzerindeki Siklin-D2B-YFP sinyalinin entegre yoğunluğunun ölçülmesiyle ölçülür. Çubuklar, ortalamanın standart hatasını ± ortalama ölçümlerini temsil eder. Ölçek çubuğu = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B); 100 μm (C). Şekil 4A-C, Robil ve McSteen24'ün izniyle değiştirilmiş ve çoğaltılmıştır, Şekil 4D-F ise yazarlardan yayınlanmamış verilerdir. Kısaltmalar: DAG = çimlenmeden sonraki günler; P = plastokron; vt2 = kaybolan püskül2; d3 = cüce bitki3; YFP = sarı floresan proteini; RFP = kırmızı floresan proteini; PIN1a-YFP =pZm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Domates = TCSv2::NLS-tdDomates; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP =pZm GAR2::ZmGAR2:YFP; Siklin-D2B-YFP =pZm Siklin-D2B::ZmSiklin-D2B:YFP; ns = anlamlı bir fark yok; au = keyfi birim. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Mısır fidelerinde yaprak gelişim evrelemesi örnekleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S1: Protokollerde kullanılan bitki örnekleri ve malzemeleri. (A,B) Üst yaprak fahişesi ile 7-8 DAG bir mısır fidesi bir tel sıyırıcı kullanılarak çıkarıldı. (B) İç kısım, açıkta kalan P6 primordium ile çekimin yakın çekimini gösterir. (C-G) Enine kesit analizi için üst çıkarılmış mısır fidelerinin sürgünleri (C,D) ve çevresindeki yapraklar tam montaj analizi için tamamen çıkarılmış (E-G). (H) Bir rulo poliüretan jel şeffaf çift taraflı nano bant. (I,J) P6 yaprak primordium (I) ve P8 yaprağının (J) proksimal bölgesi açılmış ve nano bant ile cam slaytlara monte edilmiştir. (K) Bir epifloresan mikroskobunun sahnesine monte edilmiş, yuvarlanmamış yaprak primordiyumlu bir cam slayt. Kısaltma: DAG = çimlenmeden sonraki günler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging at JoVE.com

Mısır yaprağı primordiaları derinlemesine kaplanır ve yuvarlanır, bu da onları incelemeyi zorlaştırır. Burada, floresan ve konfokal görüntüleme için enine kesitler ve açılmış mısır yaprağı primordialarının bütün montajlarını hazırlamak için yöntemler sunuyoruz.

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

Mısır gibi otların yaprak primordiaları sürgün içinde büyür ve bu da onları incelemeyi zorlaştırır. Bu sorunu, floresan ve konfokal görüntüleme için mısır yaprağı enine kesitleri ve bütün montajları hazırlamak için geliştirilmiş protokollerle ele alıyoruz. İlk protokol, eski yaprakları kesmek için bir tel sıyırıcı kullanır ve bölümlemeden önce primordiumun ölçülmesine izin verir.İkinci protokol, tüm yaprak primordiyumunu açmak için açık, çift taraflı nano bant kullanır. Bu protokoller, enine kesitlemenin doğruluğunu arttırır ve haddelenmiş, konik morfolojileri nedeniyle elde edilmesi çok zor olan yaprak primordiasının açılmasını sağlar. Bu yöntemler, mısır ve diğer çimlerdeki yaprak anatomik ve gelişimsel özelliklerini görselleştirmek ve ölçmek için yararlı olacaktır.Bu yöntemlere dayanarak, çim yaprağı gelişimindeki soruları ele almak için canlı hücre görüntüleme stratejileri geliştirmeyi planlıyoruz.

improved-methods-for-preparing-transverse-sections-unrolled-whole

Research

JoVE Journal

Biology

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

1.9K Görüntüleme.  Ateneo de Manila University. Mısır gibi otların yaprak primordiaları sürgün içinde büyür ve bu da onları incelemeyi zorlaştırır. Bu sorunu, floresan ve konfokal görüntüleme için mısır yaprağı enine kesitleri ve bütün montajları hazırlamak için geliştirilmiş protokollerle ele alıyoruz. İlk protokol, eski yaprakları kesmek için bir tel sıyırıcı kullanır ve bölümlemeden önce primordiumun ölçülmesine izin verir.İkinci protokol, tüm yaprak primordiyumunu açmak için açık,...

Video: Yazar Spot Işığı: Floresan ve Konfokal Görüntüleme için Mısır Yaprağı Primordia'nın Enine Kesitlerini ve Açılmamış Bütün Montajlarını Hazırlamak için Geliştirilmiş Yöntemler  

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study early leaf development. Here, we describe methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. The first method uses a wire stripper to remove the upper portions of older leaves, exposing the tip of the leaf primordium and allowing its measurement for more accurate transverse section sampling. The second method uses clear, double-sided nano tape to unroll and mount whole-leaf primordia for imaging. We show the utility of the two methods in visualizing and analyzing fluorescent protein reporters in maize. These methods provide a solution to the challenges presented by the distinctive morphology of maize leaf primordia and will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grass species.

Maize leaf primordia are deeply ensheathed and rolled, making them difficult to study. Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging.