Bayan Prachi Shah'a başlangıçta protokol optimizasyonunda bize yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Dr. Manoj Garg'a A2780 yumurtalık kanseri hücre hattını sağladığı için teşekkür ederiz. EK, Biyoteknoloji Bölümü'nden (No. BT/RLF/Re-entry/06/2015), Bilim ve Teknoloji Bölümü (ECR/2018/002117) ve NMIMS Tohum Hibesi (IO 401405) tarafından desteklenmektedir.

NOT: Aşağıdaki protokolde kullanılan tüm reaktifler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Tablo 1 , laboratuvar yapımı reaktifleri optimize edilmiş hacimlerle birlikte listeler ve Tablo 2 , ticari olarak temin edilebilen reaktiflerin çalışma konsantrasyonlarını gösterir.
1. Hücre kültürü
<ol><li>Telomer uzunluğu ölçülecek hücreleri (burada bir yumurtalık adenokarsinom hücre hattı olan A2780 hücreleri vardı), Dulbecco'nun modifiye kartal besiyeri (DMEM) tam ortamında, 6 cm'lik bir Petri kabında% 10 fetal sığır serumu (FBS), streptomisin, penisilin ve amfoterisin B ile desteklenmiş olarak koruyun. 37 °C'de, hücreler %80-%100 birleşene kadar %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş ve kontrollü bir ortamda inkübe edin.</li>
	<li>Ortamı çıkarın ve 5 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 3-5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe ederek hücreleri ayırmak için 1 mL tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile tedavi edin.</li>
	<li>Tripsini inaktive etmek ve hücreleri bir santrifüjleme tüpünde toplamak için 2 mL DMEM komple ortamı ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 5 dakika boyunca 2.348 × g'da pelet yapın.</li>
	<li>Peletleri 1x PBS ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 2.348 × g'da santrifüj yapın.</li>
	<li>Pelet bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. NOT: Hücre sayısı, hücre satırına bağlı olarak değişebilir. Daha sonraki adımlarda kullanılan A2780 hücre hattında yaklaşık 2.5 × 106 hücre elde ettik.</li>
</ol>2. Genomik DNA izolasyonu
<ol><li>Hücre peletine 500 μL lizis tamponu (10 mM tris-Cl, pH 8.0; 25 mM EDTA, pH 8.0; 100 mM NaCl; %0.5 w/v sodyum dodesil sülfat) ekleyin ve bir kesme ucu (en az 2 mm açıklık çapı ile) kullanarak hafifçe karıştırın. 20 μg/mL taze hazırlanmış RNase A ekleyin ve ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve bazen inkübasyon sırasında tüpü ters çevirin.</li>
	<li>Proteinaz K'yı 100 μg / mL'lik bir son konsantrasyona ekleyin ve 10 kez ters çevirerek yavaşça karıştırın. 2 saat boyunca 55 ° C'de inkübe edin. İnkübasyon sırasında tüpü düzenli aralıklarla (her 10 dakikada bir) ters çevirin.</li>
	<li>500 μL fenol:kloroform:izoamil alkol reaktifi (25:24:1) ekleyin ve 20 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında (yaklaşık 25 ° C) 15 dakika boyunca 9.391 × g'da santrifüj. NOT: Şekil 1A , santrifüjlemeden sonra elde edilen üç katmanı göstermektedir.</li>
	<li>Viskoz üst sulu tabakayı görünür üç katmandan çıkarın, kesilmiş bir uç kullanarak taze bir tüpe yerleştirin ve eşit miktarda kloroform ekleyin. 20 kez nazik ters çevirme ile karıştırın.</li>
	<li>Tüpleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 9.391 × g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Sulu tabakayı toplayın ve uygun miktarda 5 M NaCl ekleyin, böylece NaCl'nin nihai konsantrasyonu 0.2 M'dir.</li>
	<li>İki hacim% 100 etanol ekleyin. 20-25 kez hafifçe ters çevirerek karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 15.871 × g'da santrifüj.</li>
	<li>Süpernatantı çıkarın ve peleti yıkamak için 500 μL% 70 etanol ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 15.871 × g'da santrifüj.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın, peleti birkaç dakika hava ile kurutun ve 50 μL steril nükleaz içermeyen su ekleyin. DNA'nın oda sıcaklığında 1-2 gün boyunca rehidratasyonuna izin verin. Kesme ucunu kullanarak pipetleme ile karıştırın.</li>
	<li>Ultraviyole (UV)-spektrofotometri kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün. Gerekirse, minimum 300-500 ng / μL konsantrasyon elde etmek için steril nükleaz içermeyen su kullanarak numuneleri yeniden seyreltin.</li>
	<li>DNA'nın bütünlüğünü% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırarak kontrol edin (Şekil 1B).</li>
	<li>Seyreltilmiş DNA'yı bir sonraki kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.</li>
</ol>3. Genomik DNA'nın sindirimi
<ol><li>Rsa1 (20 U) ve Hinf1 (20 U) enzim karışımı hazırlayın ve reaksiyon başına 2 μL kısıtlama sindirim tamponu ekleyin.</li>
	<li>Toplam DNA miktarı 1.5 μg olacak şekilde uygun bir genomik DNA hacmi alın. Hacmi steril nükleaz içermeyen suyla telafi edin, böylece enzim ilavesinden sonraki toplam hacim 20 μL'dir.</li>
	<li>Dokunarak iyice karıştırın, ardından bir nabız dönüşü yapın.</li>
	<li>Karışımı 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
</ol>4. Agaroz jel elektroforezi
<ol><li>Yüksek dereceli agaroz kullanarak 1x tris asetat EDTA (TAE) tamponunda 10 cm × 15 cm% 0.8 agaroz jeli hazırlayın.</li>
	<li>Her sindirilmiş genomik DNA örneğine 5 μL yükleme boyası ekleyin, böylece son hacmi 25 μL yapın ve numuneleri jel üzerine yükleyin.</li>
	<li>1 μL moleküler belirteç (merdiven), 3 μL steril nükleaz içermeyen su ve 1 μL 5x yükleme boyası kullanarak moleküler bir belirteç karışımı hazırlayın.</li>
	<li>Daha fazla sayıda örnek varsa (~ 10) genomik DNA sindirilmiş numunelerin her iki tarafına 5 μL moleküler belirteç karışımı veya beşten az veya beşe eşit ise sadece bir tarafa yükleyin.</li>
	<li>Jeli 6 saat boyunca 5 V / cm'de çalıştırın. Koşu tamamlandıktan sonra, yükleme sırasını işaretlemek için jelin bir köşesinde bir çentik yapın.</li>
	<li>Jeli oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 0.25 M HCl'ye hafifçe çalkalama ile batırın.</li>
	<li>Jeli damıtılmış suyla iki kez durulayın.</li>
	<li>Jeli, yumuşak ajitasyonla oda sıcaklığında her biri 15 dakika boyunca iki kez 0.5 M NaOH ve 1.5 M NaCl'lik bir çözeltiye batırarak DNA'yı denatüre edin.</li>
	<li>Jeli damıtılmış suyla iki kez durulayın.</li>
	<li>Jeli, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca iki kez 0.5 M tris-HCl ve 3 M NaCl (pH 7.5) çözeltisine batırarak DNA'yı nötralize edin.</li>
</ol>5. Güney lekelenmesi
<ol><li>10 cm × 12 cm boyutunda bir naylon membran kesin ve jel ile aynı pozisyonda bir çentik yapın.</li>
	<li>Damıtılmış suya daldırarak membranı aktive edin ve ardından 20x sodyum salin sitrat (SSC) tamponu uygulayın (bkz. Tablo 1).</li>
	<li>Aktarımı ayarlayın.<ol><li>Temiz bir cam tepsi alın ve içine ters konumda başka bir tepsi yerleştirin. Normal filtre kağıdı kullanarak, uçları dış tepsinin tabanına dokunacak şekilde bir fitil oluşturun.</li>
		<li>Jeli filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Aktif naylon zarı, çentikler üst üste binecek şekilde jelin üzerine yavaşça yerleştirin ve bir cam çubuk üzerinde yuvarlayarak hava kabarcıklarını çıkarın.</li>
		<li>2 cm'lik 9,5 cm'lik bir yığın × 11,5 cm'lik selüloz filtre kağıdı ve ardından aynı boyutlarda 6 cm'lik bir normal filtre kağıdı yığını yerleştirin. Bu kurulumun üstüne, aşağıda eşit ağırlık dağılımı olacak şekilde bir ağırlık yerleştirin. Dış tepsiyi 20x SSC arabelleği ile doldurun (bkz. Şekil 2).</li>
		<li>Gece aktarımı için kurulumu bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Güney transferinden sonra, aktarılan DNA'yı bir UV transilluminatör veya UV çapraz bağlayıcı üzerinde UV çapraz bağlama ile membrana sabitleyin. Yaklaşık 120 mJ'ye karşılık gelen 5 dakika boyunca 302 nm 8 W lamba veya 2 dakika boyunca 254 nm 8 W lamba kullanın. DNA'nın aktarıldığı zar tarafının lambaya baktığından emin olun.</li>
	<li>Membranı 25 mL 2x SSC tamponu ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Gerekirse, lekeyi tamamen kurutarak ve folyoya gevşek bir şekilde sardıktan sonra 2-8 ° C'de saklayarak protokolü duraklatın.</li>
</ol>6. Hibridizasyon ve kemilüminesans tespiti
<ol><li>Prehibridizasyon tamponunu önceden 42 °C'ye ısıtın. NOT: Aşağıdaki adımlar, 100cm2 leke başına kullanılacak çözelti/tampon hacimlerini içerir.</li>
	<li>Membranı, prehibridizasyon için nazik ajitasyonla 42 ° C'de 1 saat boyunca 10 mL prehibridizasyon tamponunda inkübe edin.</li>
	<li>Hibridizasyon çözeltisini yapmak için 5 mL önceden ısıtılmış prehibridizasyon tamponu başına 0,5 μL telomer probu ekleyin.</li>
	<li>Lekeyi 10 mL'lik hibridizasyon çözeltisinde 42 ° C'de 3 saat boyunca nazik ajitasyonla inkübe edin.</li>
	<li>Lekeyi sıkı tampon 1 (Tablo 1) ile oda sıcaklığında 10 dakika (her biri 25 mL) boyunca iki kez hafif çalkalama ile yıkayın.</li>
	<li>Sıkı tampon 2'yi (Tablo 1) 50 ° C'de 30 dakika önceden ısıtın.</li>
	<li>Lekeyi sıkı tampon 2 ile 50 ° C'de 50 ° C'de 15 dakika (her biri 25 mL) boyunca iki kez yıkayın.</li>
	<li>RT'de hafif çalkalama ile 15 mL yıkama tamponu ile 5 dakika durulayın.</li>
	<li>Membranı, 10 mL'lik taze hazırlanmış 1x bloke edici çözelti içinde, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nazik ajitasyonla inkübe edin.</li>
	<li>Membranı, alkalen fosfataz çalışma çözeltisi ile konjuge edilmiş 10 mL anti-digioxigenin içinde (bakınız Tablo 2) RT'de 30 dakika boyunca nazik ajitasyonla inkübe edin.</li>
	<li>Lekeyi iki kez oda sıcaklığında yıkama tamponu ile 15 dakika boyunca nazik bir ajitasyonla yıkayın.</li>
	<li>RT'de 5 dakika boyunca 10 mL algılama tamponunda hafif ajitasyonla inkübe edin.</li>
	<li>Fazla algılama tamponunu çıkarın ve membranı, DNA yukarı bakacak şekilde bir hibridizasyon torbası veya asetat tabakası üzerinde tutun. Membran üzerine damla damla ~ 1-1.5 mL substrat çözeltisi ekleyin, hemen üzerine başka bir tabaka yerleştirin ve RT'de 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Görüntüleme için fazla substrat çözeltisini sıkın.</li>
	<li>Lekeyi bir jel dokümantasyon görüntüleme sisteminde yaklaşık 20 dakika boyunca görüntüleyin ve farklı zaman noktalarında birden fazla görüntü toplayın. Daha fazla analiz için doymamış görüntüleri seçin. NOT: Sinyalin zayıf olması durumunda, görüntüleme daha uzun bir süre için gerçekleştirilebilir.</li>
</ol>7. Analiz
<ol><li>Görüntü dosyalarını aldıktan sonra, mümkün olan en yüksek çözünürlükte (bu durumda 600 dpi) .tif formatta yayınlanmak üzere dışa aktarın.</li>
	<li>Telotool yazılımını yükleyin. Bu, çalıştırmak için MATLAB'ın belirli bir sürümünü (R2012a) gerektirir (serbestçe kullanılabilir).</li>
	<li>Yazılımı açın ve sağ üstteki Görüntü Dosyası Yükle düğmesine tıklayın.</li>
	<li>Görüntü yüklendikten sonra, görüntü arka planının siyah ve lekelerin/bantların beyaz olması için Görüntüyü Tersine Çevir'i tıklatın.</li>
	<li>Görüntüyü kuyulardan başlayarak üst köşelerle kırpın. Kırpma seçimi yapıldıktan sonra, içine sağ tıklayın ve Görüntüyü Kırp'ı seçin.</li>
	<li>Görüntü kırpıldıktan sonra, Şeritleri Hesapla'ya tıklayın ve şerit algılamanın otomatik olarak gerçekleşmesine izin verin.</li>
	<li>Şeritler düzgün algılanmamışsa, örneğin belirli şeritler hiç algılanmamışsa veya fazladan veya kısmi şeritler algılanmışsa, şerit ayarlamasını aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.<ol><li>Şeritleri Ayarla'ya tıklayın ve açılan açılır pencerede, şeritleri gerektiği gibi ekleyin ve / veya ayarlayın ve Uygula ve Kapat'a tıklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Şeritleri ayarladıktan sonra, şeritlerin her birinde kırmızı bir nokta göründüğünden emin olun ve her iki merdiven şeridindeki tepe sayısının aynı konumda olduğundan emin olarak Merdivene Sığ düğmesini kullanarak merdivenleri ayarlayın. Extremum'u Sil düğmesini kullanarak yabancı pikleri kaldırın.</li>
	<li>Merdivenler ayarlandıktan sonra, Şerit Profilleri'ni seçin, Merdiven Uyumu'na tıklayın ve Polinom Uyumu'nu seçin.</li>
	<li>Yazılım tarafından önerildiği gibi Trendline'a tıklayın ve ardından bir sonraki seçenekte Düzeltildi'yi seçin.</li>
	<li>Sonuçları, Ortalama TRF satırının ilgili şerit örneklerinin telomer uzunluğu ölçümü olduğu bir tablo olarak görüntülemek için Sonuçları Al'a tıklayın.</li>
	<li>Sonuçları elektronik tablo biçiminde saklamak için Tümünü kaydet'i tıklayın.</li>
</ol>

Radyoaktif Olmayan Kemilüminesans Tespiti Kullanılarak Telomer Uzunluğunun Ölçülmesi

<ol>
	<li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+regulation.">Telomere length regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).</li><li>Valdes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+cigarette+smoking,+and+telomere+length+in+women.">Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women.</a> Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).</li><li>Allsopp, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+predicts+replicative+capacity+of+human+fibroblasts.">Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).</li><li>Epel, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+telomere+shortening+in+response+to+life+stress.">Accelerated telomere shortening in response to life stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).</li><li>Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+telomere+length+quantification+by+FISH+and+its+application+to+human+population+studies.">High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).</li><li>R&#233;v&#233;sz, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+as+a+marker+of+cellular+aging+is+associated+with+prevalence+and+progression+of+metabolic+syndrome.">Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).</li><li>Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+variations+in+aging+and+age-related+diseases.">Telomere length variations in aging and age-related diseases.</a> Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).</li><li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+restriction+fragment+(TRF)+analysis.">Telomere restriction fragment (TRF) analysis.</a> Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).</li><li>Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+and+its+role+in+the+aging+pathways:+telomere+shortening,+cell+senescence+and+mitochondria+dysfunction.">Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction.</a> Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).</li><li>G&#246;hring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TeloTool:+a+new+tool+for+telomere+length+measurement+from+terminal+restriction+fragment+analysis+with+improved+probe+intensity+correction.">TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).</li><li>Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+terminal+restriction+fragment+analysis+for+quantifying+telomere+length+using+in-gel+hybridization.">Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).</li><li>Fojtov&#225;, M., Fajkus, P., Sov&#225;kov&#225;, P. P., Fajkus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+restriction+fragments+(TRF)+method+to+analyze+telomere+lengths.">Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths.</a> Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).</li><li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths.">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li><li>Trigodet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+molecular+weight+DNA+extraction+strategies+for+long-read+sequencing+of+complex+metagenomes.">High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes.</a> Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).</li><li>Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+telomere+length+measurement+methods.">Comparison of telomere length measurement methods.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).</li><li>Mochida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+size+and+telomerase+activity+in+Epstein-Barr+virus+(EBV)-positive+and+EBV-negative+Burkitt's+lymphoma+cell+lines.">Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt's lymphoma cell lines.</a> Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+senescence,+telomere+shortening+and+cell+proliferation+rate+in+Gaddi+goat's+skin+fibroblast+cell+line.">Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat's skin fibroblast cell line.</a> Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).</li><li>Michaeli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+telomere+length+correlates+with+extended+female+fertility.">Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility.</a> Cells. 11 (3), 513 (2022).</li><li>Lesmana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+reference+intervals+for+leukocyte+telomere+length+in+children:+the+method+matters.">Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).</li></ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Güney lekelemesi kullanarak telomer uzunluğu ölçümü için radyoaktif olmayan, kemilüminesans bazlı bir yöntem için ayrıntılı bir prosedür tarif ediyoruz. Protokol, sonuçların kalitesinden ödün vermeden birkaç reaktifin akıllıca kullanılmasına izin verecek şekilde test edilmiştir. Prehibridizasyon ve hibridizasyon tamponu beş defaya kadar tekrar kullanılabilir. Enzim konsantrasyonu, sonuçları etkilemeden 1.5-2 μg genomik DNA başına 10-20 U arasında değişebilir. DIG etiketli moleküler a?...

Telomerler, kromozomların sonunda bulunan tekrarlayan DNA dizileridir. TTAGGG'nin tandem tekrarlarına sahiptirler ve kromozomu hem yıpranmadan hem de son replikasyon probleminden koruyarak genom bütünlüğünü korurlar, bu da 3' çıkıntısının bir kısmının DNA polimeraz 1,2 tarafından kopyalanamayacağı anlamına gelir. Kısa telomerler, hücrelerde kromozomal anormalliklere yol açar, çünkü hücreler replikatif yaşlanma3 adı verilen bir aşamada kalıcı olarak tutuklanır. Kısa telomerler ayrıca mitokondri disfonksiyonu 4,5 ve hücre disfonksiyonu gibi bir dizi başka soruna da neden olur.
DNA telomerik tekrarları, hücre bölündüğünde ve bölündüğünde kaybolur, yılda ortalama 25 ila 200 bp kaybı6 ile sonuçlanır, bu da belirli sayıda bölünmeden sonra hücresel yaşlanma ile sonuçlanır6. Yaşlanma, telomer uzunluğu7'de kısalma ile işaretlenen daha yüksek bir komorbidite sıklığı ile ilişkilidir. Telomer kısıtlama fragmanı (TRF) analizi, Mender tarafından tanımlandığı gibi, çok pahalı bir yöntemdir8. Bu nedenle, çoğu çalışmada telomer uzunluğunu ölçerken uygulanmaz.
Günümüzde epidemiyolojik çalışmaların çoğunda telomer uzunluğunun kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) bazlı ölçümleri kullanılmaktadır. Bununla birlikte, qPCR tabanlı yöntem, telomerler ve tek kopyalı gen amplifikasyon ürünleri arasındaki oranı ölçtüğü ve mutlak telomer uzunluğunu ölçmediği için göreceli bir ölçüm yöntemidir. TRF protokolünü kullanarak telomer uzunluğu ölçümü altın standart yöntemdir, çünkü numunedeki telomer uzunluk dağılımını ölçebilir ve ölçümler kilobaz (kb) cinsinden mutlak değerlerle ifade edilebilir. Bununla birlikte, kullanımı sınırlıdır çünkü hantal, emek yoğun ve maliyetlidir. Burada, kemilüminesans bazlı TRF'leri kullanarak telomer uzunluğu ölçümü için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.
TRF analizi yedi ana adımı içerir: 1) genomik DNA ekstraksiyonu için hücrelerin kültürlenmesi, 2) fenol: kloroform: izoamilalkol (P: C: I) yöntemi kullanılarak genomik DNA ekstraksiyonu, 3) genomik DNA'nın kısıtlama sindirimi, 4) agaroz jeli elektroforezi, 5) kısıtlama sindirim DNA fragmanının güney lekelenmesi, 6) hibridizasyon ve tespit yoluyla Kemilüminesans-İmmobilize telomer probu, alkali fosfataz, disodyum 2-kloro-5-(4-metoksispiro[1,2-dioksetan-3,2′-(5-klorotrisiklo [3.3.1.13.7]dekan])-4-yl]-1-fenil fosfat (CDP-Star)-ve 7) analizi için oldukça hassas bir kemilüminesan substrat ile görselleştirilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line)</td>
			<td>Received as a gift</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Universal hood II (721BR14277)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop (Epoch 2)</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>EPOCH2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeloTool</td>
			<td>Version 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>MP</td>
			<td>180720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>HyClone, Cytiva, USA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI FBS</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>76-47-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Molychem</td>
			<td>1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11209299001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1185-53-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>GE healthcare lifesciences</td>
			<td>1001-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3232S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15557-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti DIG AP</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution 10x</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutsmart Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection buffer 10x</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dig easy hyb</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hinf 1</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hinf 1 (alternative to kit)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0155T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td>BIOLABS</td>
			<td>N3231S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid buffer 10x</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular marker</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rsa 1</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rsa 1 (alternative to kit)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0167L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td>Telo TAGGG Telomere Length Assay kit</td>
			<td>12209136001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of performance parameters of the taggg telomere length assay

Telomerler, kromozomal uçlarda bulunan tekrarlayan dizilerdir; Kısalmaları, insan somatik hücrelerinin karakteristik bir özelliğidir. Kısalma, son replikasyon ile ilgili bir sorun ve telomer uzunluğunun korunmasından sorumlu olan telomeraz enziminin yokluğu nedeniyle oluşur. İlginç bir şekilde, telomerler, kirleticiler, enfeksiyöz ajanlar, besinler veya radyasyon gibi hücre dışı ajanlar nedeniyle etkilenebilecek oksidatif stres ve inflamasyon gibi çeşitli iç fizyolojik süreçlere yanıt olarak da kısalır. Bu nedenle, telomer uzunluğu yaşlanmanın ve çeşitli fizyolojik sağlık parametrelerinin mükemmel bir biyobelirteci olarak hizmet eder. TAGGG telomer uzunluk tahlil kiti, telomer kısıtlama fragmanı (TRF) testini kullanarak ortalama telomer uzunluklarını ölçmek için kullanılır ve yüksek oranda tekrarlanabilir. Bununla birlikte, pahalı bir yöntemdir ve bu nedenle, büyük örneklem sayıları için rutin olarak kullanılmaz. Burada, Güney lekeleri veya TRF analizi ve radyoaktif olmayan kemilüminesans bazlı algılama kullanılarak telomer uzunluğunun optimize edilmiş ve uygun maliyetli bir ölçümü için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Telomeres are the repetitive DNA sequences present at the end of chromosomes. They have tandem repeats of TTAGGG and maintain genome integrity by protecting the chromosome from both fraying and the end replication problem, which means that part of the 3&#39; overhang is unable to be replicated by DNA polymerase1,2. Short telomeres lead to chromosomal abnormalities in cells, due to which cells become permanently arrested in a stage called replicative senescence3. Short telomeres also cause a host of other problems, such as mitochondria dysfunction4,5 and cell dysfunction.
DNA telomeric repeats are lost as and when the cell divides, with an average loss of 25 to 200 bp per year6, resulting in cellular senescence after a certain number of divisions6. Aging is associated with a higher frequency of comorbidities, which is marked by a shortening in telomere length7. Telomere restriction fragment (TRF) analysis, as described by Mender, is a very expensive method8. Because of this, it is not implemented while quantifying telomere length in most studies.
Presently, the majority of epidemiological studies employ quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based measurements of telomere length. However, the qPCR-based method is a relative measurement method, as it measures the ratio between telomeres and single-copy gene amplification products, and not absolute telomere length. Telomere length measurement using the TRF protocol is the gold standard method, as it can measure telomere length distribution in the sample and measurements can be expressed in absolute values in kilobases (kb). However, its use is limited because it is cumbersome, labor-intensive, and costly. Here, we present an optimized protocol for telomere length measurement using chemiluminescence-based TRFs.
TRF analysis includes seven major steps: 1) culturing of cells for genomic DNA extraction, 2) genomic DNA extraction using the phenol:chloroform:isoamylalcohol (P:C:I) method, 3) restriction digestion of genomic DNA, 4) agarose gel electrophoresis, 5) Southern blotting of the restriction digestion DNA fragment, 6) hybridization and detection via chemiluminescence-the immobilized telomere probe is visualized by a highly sensitive chemiluminescent substrate for alkaline phosphatase, disodium 2-chloro-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2&#8242;-(5-chlorotricyclo[3.3.1.13.7]decan])-4-yl]-1-phenyl phosphate (CDP-Star)-and 7) analysis for obtaining mean telomere length and range information from these telomeric smears.

Yazar Spotlight: TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu  

TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu

The scope of our research involves measuring telomere length differences across various study groups. The questions we are trying to answer revolve around diseases of physiological conditions and how they may affect telomere length and vice versa. The technology is currently used to advance research in the field of telomere length biology are nanopore sequencing and more recently CRISPR Cas based measurement.Current experimental challenges are accurately measuring absolute telomere length and the changes in it. The same sample could give varying results when different methods of measuring telomere length are used. The research gap we address is the lack of a standard method to measure telomere length.Telomere restriction fragment analysis or TRF, is still the standard against which all new techniques are evaluated. Also, our optimized protocols helps in processing a higher number of samples with limited resources. Our findings will help advance research in the field of telomere length biologic by providing a reliable and relatively economical way to compare newer methods to the gold standard, which is TRF.Our laboratory will focus on the effects of small molecule inhibitors on telomere length. We will also study the impact that lifestyle diseases and telomere length have on on each other.

% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırılan ekstrakte edilmiş genomik DNA (gDNA), Şekil 1B'de gösterildiği gibi, numunenin TRF'lerin daha aşağı akış işlenmesi için kullanılabileceğini gösteren iyi bir bütünlük göstermiştir. TRF testi daha sonra her adımda gerekli olan çözelti hacimlerinin değiştirilmesiyle gerçekleştirilmiştir (bakınız Tablo 1 ve Tablo 2). TRF sinyali açıkça görülebiliyordu (Şek...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay at JoVE.com

Burada, tampon miktarları ve prob konsantrasyonları gibi TAGGG telomer uzunluğu tahlil kitinin çeşitli performans parametrelerinin optimizasyonuna odaklanarak, radyoaktif olmayan kemilüminesan tespiti kullanarak telomer uzunluğunu ölçme protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

Araştırmamızın kapsamı, çeşitli çalışma grupları arasındaki telomer uzunluğu farklılıklarının ölçülmesini içerir. Cevaplamaya çalıştığımız sorular, fizyolojik koşulların hastalıkları ve telomer uzunluğunu nasıl etkileyebilecekleri ve bunun tersi etrafında dönüyor. Teknoloji şu anda telomer uzunluğu biyolojisi alanındaki araştırmaları ilerletmek için kullanılmaktadır, nanopore dizilimi ve daha yakın zamanda CRISPR Cas tabanlı ölçümlerdir.Mevcut deneysel zorluklar, mutlak telomer uzunluğunu ve içindeki değişiklikleri doğru bir şekilde ölçmektedir. Aynı numune, telomer uzunluğunu ölçmek için farklı yöntemler kullanıldığında farklı sonuçlar verebilir. Ele aldığımız araştırma boşluğu, telomer uzunluğunu ölçmek için standart bir yöntemin olmamasıdır.Telomer kısıtlama fragmanı analizi veya TRF, hala tüm yeni tekniklerin değerlendirildiği standarttır. Ayrıca, optimize edilmiş protokollerimiz sınırlı kaynaklarla daha fazla sayıda numunenin işlenmesine yardımcı olur. Bulgularımız, yeni yöntemleri TRF olan altın standartla karşılaştırmak için güvenilir ve nispeten ekonomik bir yol sağlayarak telomer uzunluğu biyolojisi alanındaki araştırmaların ilerlemesine yardımcı olacaktır.Laboratuvarımız küçük molekül inhibitörlerinin telomer uzunluğu üzerindeki etkilerine odaklanacaktır. Ayrıca, yaşam tarzı hastalıklarının ve telomer uzunluğunun birbirleri üzerindeki etkisini de inceleyeceğiz.

optimization-performance-parameters-taggg-telomere-length

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

1.5K Görüntüleme.  SVKM's NMIMS Deemed-to-be-University. Araştırmamızın kapsamı, çeşitli çalışma grupları arasındaki telomer uzunluğu farklılıklarının ölçülmesini içerir. Cevaplamaya çalıştığımız sorular, fizyolojik koşulların hastalıkları ve telomer uzunluğunu nasıl etkileyebilecekleri ve bunun tersi etrafında dönüyor. Teknoloji şu anda telomer uzunluğu biyolojisi alanındaki araştırmaları ilerletmek için kullanılmaktadır, nanopore dizilimi ve daha yakın zamanda CRISPR Cas tabanlı ölçümlerdir.

Video: Yazar Spotlight: TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu  

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/65288.jpg

Kanser Araştırmaları

A2780 Cells Genomic DNA Isolation and Analysis

Begin by adding 500 microliters of the lysis buffer to the previously obtained A2780 cell pellet, and mix gently using a cut tip with a minimum opening diameter of two millimeters. Add 20 micrograms per milliliter of freshly prepared RNase and mix by gentle inversion. Incubate it at 37 degrees Celsius for 30 minutes.At the end of incubation, add proteinase K to a final concentration of 100 micrograms per milliliter and gently invert 10 times. Incubate again at 55 degrees Celsius for one hour inverting the tube every 10 minutes. Pipette 500 microliters of phenol:chloroform:isoamyl alcohol reagent into the tube and gently invert the tube about 20 times.Centrifuge it at 9, 391 G for 15 minutes at room temperature. Pipette the upper aqueous viscous layer into a new tube. Add an equal volume of chloroform and mix by gentle inversion.After centrifuging the tube once, collect the aqueous layer. Add an appropriate amount of five molar sodium chloride in the tube to increase the concentration by 0.2 moles. Add two volumes of 100%ethanol into the tube and invert it gently 20 times.Centrifuge at 15, 871 G for five minutes at room temperature. After discarding the supernatant, add 500 microliters of 70%ethanol. Centrifuge again at the same condition and then discard the supernatant.Once the pellet is air dried, add 50 microliters of sterile nuclease free water and let it rehydrate. Then mix the DNA by pipetting using the cut tip. Use UV spectrophotometry to measure the concentration of DNA.After digesting the DNA, separate it using 0.8%agarose. Submerge the agarose gel in 0.25 molar hydrochloric acid solution for 10 minutes at room temperature with gentle agitation. Then rinse the gel twice with distilled water.To denature the DNA, submerge the gel in a solution of sodium hydroxide and sodium chloride. Then rinse the gel twice with distilled water. To neutralize the DNA as demonstrated, submerge the gel in a solution of 0.5 molar hydrochloric acid and three molar sodium chloride at pH seven.The extractor genomic DNA showed good integrity indicating its use for further downstream processing of telomere restriction fragments.

A2780 Hücreler Genomik DNA İzolasyonu ve Analizi

Southern Blotting, Hybridization, and Chemiluminescence Detection of Genomic DNA Isolated from A2780 Cells

To perform southern blotting, start by cutting a nylon membrane into a 10 by 12 centimeter sized segment. Make a notch in the same position as the gel. Activate the membrane by dipping it in distilled water, followed by 20X sodium saline citrate buffer.Place a filter paper wick on a double inverted tray, set such that the ends touch the base of the outer tray. Place the gel over the filter paper. Then place the activated nylon membrane over the gel, ensuring that the notches overlap.Remove any air bubbles with a glass rod. Place a two centimeter heap of 9.5 by 11.5 centimeter sized cellulose filter paper, and another six centimeter heap of regular filter paper. Place a weight atop the setup for equal weight distribution.Fill the outer tray with 20X sodium saline citrate buffer, and leave it overnight for efficient transfer. After southern transfer, fix the transferred DNA on the membrane by UV crosslinking on a UV transilluminator. Wash the membrane twice with 25 milliliters of 2X sodium saline citrate buffer.To perform hybridization, incubate the membrane in 10 milliliters of the pre-warmed pre-hybridization buffer. Gently agitate the membrane manually at frequent intervals. Then incubate the blot in 10 milliliters of hybridization buffer at 42 degrees Celsius for three hours with gentle agitation.Wash the blot twice in 25 milliliters of stringent buffer for 10 minutes at room temperature with gentle agitation. Now wash the blot twice in 25 milliliters of pre-warmed stringent buffer at 50 degrees Celsius for 15 minutes with gentle agitation. Rinse with 15 milliliters of wash buffer for five minutes with gentle agitation at room temperature.Incubate the membrane in 10 milliliters of freshly prepared blocking solution for 30 minutes at room temperature with gentle agitation. Then place it in 10 milliliters of anti-digoxigenin conjugated with an alkaline phosphatase working solution. Wash the blot twice in the wash buffer at room temperature for 15 minutes.Now incubate in 10 milliliters of detection buffer for five minutes at room temperature. After removing the excess buffer, place the membrane on an acetate sheet with the DNA side facing up. Add approximately one to 1.5 milliliters of substrate solution dropwise on the membrane.Immediately place another acetate sheet on it and incubate for five minutes at room temperature. Squeeze out the excess substrate solution before imaging. Using a gel documentation imaging system, collect multiple unsaturated images at different time points for analysis.After southern blotting and hybridization, the telomere restriction fragments were clearly visible, indicated by a smear.