Yazarlar, bu çalışma için rıza gösteren ve örnek bağışlayan tüm kadınlara minnettardır.

Araştırma içeriği ve protokolü, Shenzhen Zhongshan Üroloji Hastanesi araştırma etik komitesi tarafından etik olarak gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Çalışmaya katılan tüm kadınlar (20-40 yaş) numune toplama ve kullanım için bilgilendirilmiş onam verdi.
1. Patolojik doku kazanımı
<ol><li>Doku toplama için ölçme cetveli, cımbız, gömme kaseti, gömme kağıdı ve kağıt mendil sepeti gibi araçları hazırlayın.</li>
	<li>Pipelle kateteri ile standart bir yaklaşım kullanılarak toplanan endometriyal doku miktarının (maş fasulyesinden daha büyük) yeterli olup olmadığını gözlemleyin.</li>
	<li>Endometrial dokuyu formalinden gömme kağıdına cımbızla aktarın ve endometrial doku boyutlarını bir cetvelle ölçün.</li>
	<li>Endometriyal dokuyu gömme kağıdı ile sarın ve bir gömme kasetine yerleştirin.</li>
	<li>Dehidrasyon için gömme kasetini doku sepetine yerleştirin.</li>
</ol>2. Doku dehidrasyonu
<ol><li>Doku sepetini kurutucunun reaksiyon odasına koyun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve rutin doku dehidrasyonu prosedürünü başlatın: 100 dakika formalin; 100 dakika formalin; 60 dakika boyunca% 75 alkol; 60 dakika boyunca% 85 alkol; 60 dakika boyunca% 95 alkol; 60 dakika boyunca% 100 alkol; 60 dakika boyunca% 100 alkol; 60 dakika boyunca% 100 alkol; 35 dakika boyunca ksilen; 20 dakika boyunca ksilen; 20 dakika boyunca ksilen; 80 dakika balmumu; 80 dakika balmumu; 80 dakika balmumu. İşlem yaklaşık 15 saat sürer.</li>
	<li>Doku dehidrasyon prosedürünün sonunda, kurutucunun reaksiyon odasını açın, doku sepetini çıkarın.</li>
</ol>3. Doku gömme
<ol><li>Numunenin boyutuna göre uygun bir gömme kalıbı çıkarın ve 70 ° C'de parafin mumu ile doldurun.</li>
	<li>Dokuyu hızlı bir şekilde kalıba yerleştirin ve doku kalıbın ortasına yerleştirilecek şekilde dikkatlice ayarlayın.</li>
	<li>Kalıbı düzgün bir şekilde soğutma plakasına taşıyın ve alttaki parafin sertleşirken dokuya hafifçe bastırın.</li>
	<li>Gömme kasetini kalıbın üzerine koyun ve daha fazla balmumu ile doldurun.</li>
	<li>Kalıbı soğutma plakasına yerleştirin ve parafin tamamen katılaştığında, takılı kaseti olan bloğu kalıptan çıkarın.</li>
</ol>4. Doku bölümleri
<ol><li>Bloğu mikrotomun numune klipsine yerleştirin, bıçağı tutucuya yerleştirin, blok düzlemi ile bıçak arasındaki açıyı ayarlayın, kesitin kalınlığını 4 μm'ye ayarlayın, el çarkını çevirin ve dilimlemeye başlayın.</li>
	<li>Bloktan birkaç ince kesit keserek uygun doku yüzeyini ortaya çıkarın. Sürekli ve eksiksiz bölümleri fırça ile çıkarın.</li>
	<li>Yeterli kesit kesildiğinde el çarkını döndürmeyi bırakın, ön uçtaki niteliksiz kısımları cımbızla çıkarın ve cızız ve fırça ile su banyosunda 42 °C su yüzeyindeki kesitleri yüzdürün.</li>
	<li>Bölümler tamamen düzleştikten sonra, ayrılma önleyici kızaklardaki bölümleri seçin ve 60 dakika pişirmek için 65 °C'de bir sürgü ısıtıcısına aktarın.</li>
	<li>Pişirme bittiğinde cam slaytları slayt ısıtıcısından çıkarın.</li>
</ol>5. İmmünohistokimyasal boyama
<ol><li>Birincil antikoru, antikor seyreltici ile çalışan bir çözeltiye seyreltin. Ayrıntılar için Tablo 1'e bakın.</li>
	<li>Seyreltilmiş antikor çözeltisini özel bir reaktif şişesine ve tespit kitini otomatik bir IHC boyama aletinin reaktif bölmesine koyun (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Slaytları özel bir örtü ile kaplı bir sürgü tutucuya yerleştirin ve bunları cihazın deneysel reaksiyon bölmesine yerleştirin.</li>
	<li>Cihaz, slayttaki reaktifi ve deneysel bilgileri otomatik olarak tanıdıktan sonra, immünohistokimyasal boyamayı başlatmak için Başlat düğmesine tıklayın. Deney yaklaşık 3 saat sürer.</li>
</ol>6. Slaydın dehidrasyonu ve sızdırmazlığı
<ol><li>İmmünohistokimyasal boyamadan sonra, slayt tutucuyu çıkarın, özel örtüyü çıkarın, lekeli slaytı slayt tutucuya koyun ve slayt üzerinde kalan boyayı temiz suyla yıkayın.</li>
	<li>Sürgü tutucuyu otomatik bir lamel üzerine aktarın (Malzeme Tablosuna bakın), dehidrasyon ve sızdırmazlık prosedürünü seçin ve çalıştırın.</li>
	<li>Dehidrasyon ve sızdırmazlıktan sonra slaytları çıkarın.</li>
</ol>7. Tarama slaydı
<ol><li>Slaytları panoramik patolojik görüntü tarayıcısının slayt rafına yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve panoramik patolojik görüntü taraması için alet slayt tarama bölmesine yerleştirin. Tarama 2 dakika sürer. Şekil 1'e bakın.</li>
</ol>8. Görüntülerin analizi
<ol><li>Görüntüyü içe aktar<ol><li>Patolojik görüntü analiz yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu) ve yeni bir klasör oluşturun. Analiz edilecek immünohistokimyasal görüntüleri içe aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Doku sınıflandırıcısı oluşturma<ol><li>Sırasıyla doku ve boş alanı tanımlamak için bir sınıflandırıcı eğitmek ve oluşturmak için birkaç doku ve boş ek açıklamayı işaretleyin.</li>
		<li>İşaret açıklaması sırasında yazılımın tanıma kapasitesini gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için gerçek zamanlı ayarlamayı kullanın. Tanıma zamanında değilse, ek açıklamayı işaretleyin ve doku tanıma doğru olana kadar tekrar eğitin.</li>
	</ol></li>
	<li>Analiz algoritması oluşturun<ol><li>Deney türüne göre yazılımdaki standart algoritmayı seçin: multipleks IHC.</li>
		<li>Tipik negatif ve pozitif pikseli seçerek hücre tanımanın renk parametrelerini ayarlayın. Bu temelde, çekirdek, sitoplazma ve hücre zarı parametrelerini ayarlayın ve görüntü için en uygun parametreler bulunana kadar hücre tanıma durumunu gerçek zamanlı olarak gözlemleyin.</li>
		<li>Pozitif hücre tanıma eşiğini ayarlayın ve uygun eşik ayarlanana kadar tanıma durumunu gerçek zamanlı olarak gözlemleyin.</li>
		<li>Algoritmada doku sınıflandırıcıyı seçin ve hücreleri dokular bazında tanımlamak için doku sınıflandırıcıdaki doku kısmını kontrol edin. Bu noktada bir analiz algoritmasının kurulması tamamlanmış olur.</li>
	</ol></li>
	<li>Görüntü analizini çalıştırın<ol><li>Analiz alanını seçin. Görüntüleri analiz etmek için yerleşik algoritmayı kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Yazılım analizi analizi bittikten sonra, doku tanıma, negatif ve pozitif hücre tanıma dahil olmak üzere görüntü tanımanın doğru olup olmadığını manuel olarak kontrol edin.</li>
	<li>Görüntü tanıma doğru değilse, algoritmayı ve parametre eşiğini yeniden ayarlayın ve başarılı olana kadar görüntü analizini yeniden çalıştırın. Analiz sonuçlarını dışa aktarın. Şekil 1'e bakın.</li>
	<li>Diğer bağışıklık hücreleri de yukarıdaki adımlara göre analiz edilebilir (bkz. Şekil 1). Farklı endometriyal immün belirteçlerin (CD56+uNK hücreleri, Foxp3+Tregs, CD68+ makrofajlar, CD163+M2 makrofajları, CD1a+DC'ler ve CD8+T hücreleri25,26) gerçek ekspresyonuna göre farklı analiz parametreleri ayarlayın.</li>
	<li>Yazılımın hesaplanması yoluyla, endometriyal immün hücrelerin oranını elde edin (bakınız Tablo 2). Tekrarlayan düşüklüğü olan hastaların endometriyumundaki çeşitli bağışıklık hücrelerinin seviyelerini değerlendirmek için bunu kullanın.</li>
</ol>

İmmünohistokimyasal Olarak Boyaralı Endometrial Dokunun Görüntü Analizi

<ol>
	<li>Practice Committee of the American Society for Reproductive. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+treatment+of+recurrent+pregnancy+loss:+a+committee+opinion.">Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion.</a> Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).</li><li>Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss.">Recurrent pregnancy loss.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98 (2020).</li><li>Kavvadas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Evaluation+of+CD3,+CD4,+CD8,+and+CD20+in+Decidual+and+Trophoblastic+Tissue+Specimens+of+Patients+with+Recurrent+Pregnancy+Loss.">Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss.</a> 12 (2), 177-193 (2022).</li><li>Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexplained+repeated+pregnancy+loss+and+T+helper+cells.">Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells.</a> European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).</li><li>Du, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+percentage+of+CD3(+)T+cells+and+pregnancy+outcome+in+women+with+recurrent+pregnancy+loss.">Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss.</a> Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).</li><li>Faas, M. M., de Vos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+NK+cells+and+macrophages+in+pregnancy.">Uterine NK cells and macrophages in pregnancy.</a> Placenta. 56, 44-52 (2017).</li><li>Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variety+of+opportunities+for+immune+interactions+during+trophoblast+development+and+invasion.">A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).</li><li>Meyer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chymase-producing+cells+of+the+innate+immune+system+are+required+for+decidual+vascular+remodeling+and+fetal+growth.">Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth.</a> Scientific Reports. 7, 45106 (2017).</li><li>Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+immune+cell+involvement+in+decidual+spiral+arteriole+remodeling+in+early+human+pregnancy.">Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).</li><li>Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+CD56++natural+killer+cells+in+women+with+recurrent+miscarriage:+a+histomorphometric+study.">Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study.</a> Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+uterine+natural+killer+cell+percentage+in+the+periimplantation+endometrium+from+fertile+women+and+women+with+recurrent+reproductive+failure:+establishment+of+a+reference+range.">Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).</li><li>Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+natural+killer+cells+in+peri-implantation+endometrium+from+women+with+repeated+implantation+failure+after+IVF.">Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF.</a> Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).</li><li>Laird, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+immune+cells+and+molecules+in+women+with+recurrent+miscarriage.">A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).</li><li>Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriages+and+the+association+with+regulatory+T+cells;+A+systematic+review.">Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review.</a> Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105 (2020).</li><li>Vallv&#233;-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endometrial+immune+environment+of+women+with+endometriosis.">The endometrial immune environment of women with endometriosis.</a> Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).</li><li>Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Function+and+Composition+Changes+of+Immune+Cells+During+Normal+and+Pathological+Pregnancy+at+the+Maternal-Fetal+Interface.">Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2317 (2019).</li><li>Hey-Cunningham, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+utilizing+flow+cytometry+and+immunohistochemistry+reveals+inflammatory+changes+in+local+endometrial+and+systemic+dendritic+cell+populations+in+endometriosis.">Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis.</a> Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).</li><li>Zhong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+Immune+Infiltration+in+Endometriosis+and+Their+Relationship+to+r-AFS+Stages.">Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages.</a> Frontiers in Genetics. 12, 631715 (2021).</li><li>Attems, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+consensus+criteria+for+the+evaluation+of+Lewy+pathology+in+post-mortem+brains:+a+multi-centre+study.">Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study.</a> Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+Assessment+of+Aging-Related+Tau+Astrogliopathy+(ARTAG).">Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG).</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).</li><li>Modis, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+changes+in+corneal+opacification+vary+depending+on+etiology.">Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology.</a> Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).</li><li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods,+utility+and+semiquantitative+assessment+I.">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li><li>Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quantitative+immunohistochemistry+method+for+precise+protein+measurements+directly+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+specimens:+analytical+performance+measuring+HER2.">A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2.</a> Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).</li><li>Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+Immunohistochemistry+and+Digital+Image+Analysis.">Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).</li><li>Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Immune+Cells+in+Recurrent+Spontaneous+Abortion.">The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion.</a> Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).</li><li>Diao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+endometrial+immune+cell-based+score+(EI-score)+for+the+prediction+of+implantation+success+for+patients+undergoing+IVF/ICSI.">New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI.</a> Placenta. 99, 180-188 (2020).</li><li>Hewitt, S. C., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology.+A+hand+to+support+the+implantation+window.">Cell biology. A hand to support the implantation window.</a> Science. 331 (6019), 863-864 (2011).</li><li>Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+chorionic+gonadotropin+and+Notch1+in+implantation.">The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).</li><li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Algars, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+and+location+of+tumor-infiltrating+macrophages+and+lymphatic+vessels+predict+survival+of+colorectal+cancer+patients.">Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients.</a> International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).</li><li>Carey, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+analysis+reveals+a+PD-L1-associated+microenvironmental+niche+for+Reed-Sternberg+cells+in+Hodgkin+lymphoma.">Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma.</a> Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).</li><li>Ascierto, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Mechanisms+of+Resistance+to+Anti-PD-1+Therapy.">Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).</li><li>O'Rourke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+peripherally+infused+EGFRvIII-directed+CAR+T+cells+mediates+antigen+loss+and+induces+adaptive+resistance+in+patients+with+recurrent+glioblastoma.">A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma.</a> Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).</li><li>Canesin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+the+WNT5A-mimicking+peptide+Foxy-5+effectively+reduces+the+metastatic+spread+of+WNT5A-low+prostate+cancer+cells+in+an+orthotopic+mouse+model.">Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model.</a> PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu protokol, RM hastalarının endometriyal immün hücrelerini kantitatif olarak analiz etmek için bir dijital immünohistokimya görüntü analiz platformu oluşturmuştur. Burada, RM hastalarında endometriyal immün mikroçevreyi değerlendirmek için altı endometriyal immün belirteç tespit edildi.
Orta luteal fazda alıcı bir endometriyum, başarılı implantasyon ve hamilelik için anahtardır27,28. Bu nedenle, endometriyal ...

Tekrarlayan düşük (RM), iki veya daha fazla ardışık gebeliğin kaybıdır ve son yıllarda klinisyenlerin dikkatini çeken kompleks bir hastalıktır. Doğurganlık çağındaki kadınlarda RM görülme oranı %1-%5'tir 1. Önceki çalışmaların sonuçları, immün faktörlerin RM 2,3,4,5 patogenezi ile yakından ilişkili olduğunu göstermektedir. Embriyo implantasyonu ve gelişimi için maternal-fetal arayüzde immün homeostazın sürdürülmesi gereklidir. Endometriyal bağışıklık hücreleri, bu homeostazı sürdürmek için trofoblast istilasını teşvik etmek, spiral arterleri yeniden şekillendirmek ve plasenta gelişimine katkıda bulunmak gibi çeşitli düzenleyici roller üstlenir 6,7,8,9.
RM'li kadınlarda anormal endometriyal immün hücreler daha önce bildirilmiştir. Sonuçlar, uterus doğal öldürücü hücrelerin (uNK'ler) yüksek yoğunluğu ile RM10,11,12 oluşumu arasında yakın bir ilişki olduğunu göstermektedir. RM'li kadınların endometriyumunda, canlı doğum yapanlara kıyasla artmış sayıda makrofaj bildirilmiştir13. Regülatör T hücreleri (Treg), embriyoya karşı maternal immün toleransta rol oynar ve RM hastalarının desiduasında seviyeleri ve işlevleri azalır14. Sitotoksisite T hücreleri (CTL) ve dendritik hücreler (DC'ler) de gebeliğin immün regülasyonunda rol oynar15,16. Bu nedenle, orta luteal faz sırasında lokal endometriyal immün hücrelerin kapsamlı bir kantitatif analizi, RM'nin patogenezinin daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilir. Endometriyal immün hücrelerin kantitatif analizi için bazı mevcut yöntemler, immün hücreleri çoklu belirteçlerle doğru bir şekilde etiketleyebilen akış sitometrisini kullanır17,18. Bununla birlikte, akım sitometrisinin klinik uygulaması sınırlıdır, çünkü sadece taze dokuda yapılabilir. Taze doku elde etmek ancak endometriyum için nadir görülen büyük miktarda fazla tümör mevcut olduğunda mümkündür. İmmünohistokimya, doku morfolojisini yerinde iyi gözlemleyebilir ve ayrıca çeşitli bağışıklık hücrelerini etiketleyebilirken, geleneksel immünohistokimyasal teknikler bağışıklık hücrelerinin kantitatif analizini gerçekleştiremez.
Konvansiyonel immünohistokimya deneyleri ile karşılaştırıldığında, endometriyumdaki immün hücrelerin kantitatif immünohistokimyasal analizi önemli klinik öneme sahiptir. IHC yoğunluk skorlaması genellikle dört puanlık bir ölçekte veya patolojik tanı ve araştırmalarda güçlü ve zayıf olarak sıralanır 19,20,21. Bununla birlikte, bu yarı nicel teknik özneldir, oldukça yanlıştır ve önemli gözlemci içi ve gözlemciler arası değişkenlik gösterir22. Olası bir çözüm, değerli olan makine öğreniminin uygulanmasıdır.dijital görüntü analizi23,24. Bu yaklaşım, kantitatif ölçümler sağlayarak, uterus dokusu içindeki bağışıklık hücresi infiltrasyonunun, dağılımının ve yoğunluğunun daha kesin bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bu nicel bilgi, menstrüel siklus sırasında ve çeşitli patolojik durumlarda bağışıklık hücresi popülasyonlarındaki dinamik değişiklikleri aydınlatmaya yardımcı olabilir. Genel olarak, endometriyumdaki bağışıklık hücrelerini immünohistokimya yoluyla kantitatif olarak analiz etme yeteneği, uterusun bağışıklık mikroçevresi hakkında değerli bilgiler sunar.
Bu nedenle, protokol, RM hastalarında orta luteal faz sırasında uNK hücreleri, Treg'ler, makrofajlar, DC'ler ve sitotoksik T hücreleri dahil olmak üzere endometriyal immün hücreleri kantitatif olarak analiz etmek için bir dijital immünohistokimya görüntü analiz platformu geliştirmeyi ve doğrulamayı amaçladı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated coverslipper</td>
			<td>Sakuraus</td>
			<td>DRS-Prisma-P-JCS&#38;Film-JC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163</td>
			<td>GrowGn Biotechnology</td>
			<td>NCL-L-CD163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1a</td>
			<td>Gene Tech</td>
			<td>GM357129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Gene Tech</td>
			<td>GT200529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-CD8-4B11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital pathology and</td>
			<td>Indica labs</td>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3</td>
			<td>YILIFANG biological</td>
			<td>14-477-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC stainer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>BOND III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis platform</td>
			<td>Indica labs</td>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Olympus life science</td>
			<td>VS200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

platform for quantitative detection of endometrial immune cells based on immunohistochemistry and digital image analysis

Tekrarlayan düşüklü (RM) hastaların endometriyal immün mikroçevresini değerlendirmek için, orta luteal faz sırasında endometriyal immün hücreleri kantitatif olarak analiz etmek için bir dijital immünohistokimya görüntü analiz platformu geliştirildi ve doğrulandı. Tüm endometrium örnekleri menstrüel siklusun orta luteal fazında toplandı. Parafine gömülü endometrial dokular 4 μm kalınlığında lamlar halinde kesitlere ayrıldı ve CD56+ uNK hücreleri, Foxp3+ Treg'ler, CD163+ M2 makrofajları, CD1a+ DC'ler ve CD8+ T hücreleri dahil olmak üzere endometriyal immün hücreleri saptamak için immünohistokimya (IHC) boyaması yapıldı. Panoramik slaytlar dijital slayt tarayıcı kullanılarak taranmış ve kantitatif analiz için ticari görüntü analiz sistemi kullanılmıştır. Endometrial immün hücrelerin yüzdesi, toplam endometriyal hücrelerdeki immün hücre sayısının bölünmesiyle hesaplandı. Ticari görüntü analiz sistemi kullanılarak, konvansiyonel görüntü analizi ile analiz edilmesi zor veya imkansız olan endometriyal immün hücrelerin kantitatif değerlendirmesi kolay ve doğru bir şekilde analiz edilebilmektedir. Bu metodoloji, bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşim ve farklı üreme yetmezliği hastaları için heterojenliği dahil olmak üzere endometriyum mikro çevresini kantitatif olarak karakterize etmek için uygulanabilir. Endometriyal immün hücrelerin kantitatif değerlendirilmesi platformu, RM hastalarının tanı ve tedavisi için önemli klinik öneme sahip olabilir.

Recurrent miscarriage (RM) is the loss of two or more consecutive pregnancies and is a complex disease drawing attention from clinicians in recent years.The incidence rate of RM in women of childbearing age is 1%-5% 1. Results of previous studies show that immune factors are closely associated with the pathogenesis of RM2,3,4,5. Maintaining immune homeostasis at the maternal-fetal interface is required for embryo implantation and development. Endometrial immune cells perform several regulatory roles to maintain this homeostasis, such as promoting trophoblast invasion, remodeling spiral arteries, and contributing to placenta development6,7,8,9.
Aberrant endometrial immune cells in women with RM have previously been reported. Results show a close association between the high density of uterine natural killer cells (uNKs) and the occurrence of RM10,11,12. An increased number of macrophages has been reported in the endometrium of women with RM, compared with those who had a live birth13. Regulatory T cells (Treg) play a role in maternal immune tolerance toward the embryo, and their level and function are decreased in the decidua of RM patients14. Cytotoxicity T cells (CTL) and dendritic cells (DCs) also play a role in the immune regulation of pregnancy15,16. Therefore, a comprehensive quantitative analysis of local endometrial immune cells during the mid-luteal phase could help to better understand the pathogenesis of RM. Some current methods for quantitative analysis of endometrial immune cells use flow cytometry which can accurately label immune cells with multiple markers17,18. However, clinical application of flow cytometry is limited because it can only be performed on fresh tissue. Obtaining fresh tissue is only feasible when a large volume of excess tumor is available, a rare occurrence for endometrium. Immunohistochemistry can observe tissue morphology well in situ and can also label various immune cells, while traditional immunohistochemical techniques cannot perform quantitative analysis of immune cells.
Compared to conventional immunohistochemistry experiments, quantitative immunohistochemical analysis of immune cells in the endometrium has important clinical significance. IHC intensity scoring is usually ranked on a four-point scale or strong and weak in pathological diagnostics and research19,20,21. However, this semi-quantitative technique is subjective, highly inaccurate, and demonstrates significant intra-observer and inter-observer variability22. One possible solution is the application of machine learning, which is valuable indigital image analysis23,24. By providing quantitative measurements, this approach enables a more precise assessment of immune cell infiltration, distribution, and density within the uterine tissue. This quantitative information can help to elucidate the dynamic changes in immune cell populations during the menstrual cycle and in various pathological conditions. Overall, the ability to quantitatively analyze immune cells in the endometrium through immunohistochemistry offers valuable insights into the immune microenvironment of the uterus.
Therefore, the protocol aimed to developed and validated a digital immunohistochemistry image analysis platform to quantitatively analyze endometrial immune cells including uNK cells, Tregs, macrophages, DCs and cytotoxic T cells during the mid-luteal phase in RM patients.

Yazar Spotlight: Endometriyal İmmün Hücrelerin Kantitatif Değerlendirmesi için Bir Protokol ile Üreme İmmünolojisini İlerletmek 

İmmünohistokimya ve Dijital Görüntü Analizine Dayalı Endometrial İmmün Hücrelerin Kantitatif Tespiti Platformu

Endometrial immün hücrelerin kantitatif olarak değerlendirilmesi ve insan kaynaklı operasyonel hataların neden olduğu kararsızlığın azaltılması için otomatik immünohistokimyasal tespit ve dijital kantitatif değerlendirme sistemi kullanılarak endometrial immün hücreler için dijital kantitatif analiz platformu kuruldu. İmmünohistokimya görüntü analiz platformu, tekrarlayan düşük (RM) olan hastaların endometriyal immün hücrelerini implantasyon penceresinde kantitatif olarak analiz etmek için k...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Reproductive Immunology with a Protocol for the Quantitative Evaluation of Endometrial Immune Cells at JoVE.com

Burada, implantasyon penceresinde tekrarlayan düşükleri olan hastaların endometriyal immün hücrelerini kantitatif olarak analiz etmek için bir dijital immünohistokimya görüntü analiz platformu geliştirildi ve doğrulandı.

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform ...

Şu anda, analizi belirli bir aralıkta stabilize etmek zordur. Deneyin kalite kontrolünü sürdürmek de zordur. Araştırmamız, immün organda anormal endometriyal duyarlılığı olan hastaların üreme yetmezliğinin nedenini bulmalarına yardımcı olabilir.Endometriyaldeki immün hücrelerin lokal oranı stabil ve tekrar tekrar tespit edilebilir. Bulgularımız, tekrarlayan implantasyon başarısızlığı olan hastalarda endometriyal duyarlılık değerlendirmesinin araştırma ilerlemesini destekleyebilir.

platform-for-quantitative-detection-endometrial-immune-cells-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

Platform for Quantitative Detection of Endometrial Immune Cells Based on Immunohistochemistry and Digital Image Analysis

789 Görüntüleme.  Shenzhen Zhongshan Urology Hospital. Şu anda, analizi belirli bir aralıkta stabilize etmek zordur. Deneyin kalite kontrolünü sürdürmek de zordur. Araştırmamız, immün organda anormal endometriyal duyarlılığı olan hastaların üreme yetmezliğinin nedenini bulmalarına yardımcı olabilir.Endometriyaldeki immün hücrelerin lokal oranı stabil ve tekrar tekrar tespit edilebilir. Bulgularımız, tekrarlayan implantasyon başarısızlığı olan hastalarda endometriyal duyarlılık değerlendirmesinin araştırm...

Video: Yazar Spotlight: Endometriyal İmmün Hücrelerin Kantitatif Değerlendirmesi için Bir Protokol ile Üreme İmmünolojisini İlerletmek 

To evaluate the endometrial immune microenvironment of patients with recurrent miscarriage (RM), a digital immunohistochemistry image analysis platform was developed and validated to quantitatively analyze endometrial immune cells during the mid-luteal phase. All endometrium samples were collected during the mid-luteal phase of the menstrual cycle. Paraffin-embedded endometrial tissues were sectioned into 4 &#181;m thick slides, and immunohistochemistry (IHC)staining was carried out for detecting endometrial immune cells, including CD56+ uNK cells, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2 macrophages, CD1a+ DCs, and CD8+ T cells. The panoramic slides were scanned using a digital slide scanner and a commercial image analysis system was used for quantitative analysis. The percentage of endometrial immune cells was calculated by dividing the number of immune cells in the total endometrial cells. Using the commercial image analysis system, quantitative evaluation of endometrial immune cells, which are difficult or impossible to analyze with conventional image analysis, could be easily, and accurately analyzed. This methodology can be applied to quantitatively characterize the endometrium microenvironment, including interaction between immune cells, and its heterogeneity for different reproductive failure patients. The platform for quantitative evaluation of endometrial immune cells may be of important clinical significance for the diagnosis and treatment of RM patients.

Here, a digital immunohistochemistry image analysis platform was developed and validated to quantitatively analyze the endometrial immune cells of patients with recurrent miscarriages in the window of implantation.