Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2022YFA1104600) ve Çin Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LQ23H160011) tarafından desteklenmiştir.

1. 3D akustik montaj cihazının imalatı
<ol><li>Lazer kesim30 ile 1 mm kalınlığında dört adet PMMA tabakası hazırlayarak başlayın ve ardından iç genişliği 21 mm ve yüksekliği 10 mm olan kare bir oda oluşturmak için bunları birbirine yapıştırmaya devam edin.</li>
	<li>Ardından, biyomürekkep için bir tutucu görevi görmesi için haznenin altına 1 mm kalınlığında başka bir PMMA tabakası takın.</li>
	<li>Üç kurşun zirkonat titanat (PZT) dönüştürücüsünü (her biri 20 mm uzunluğunda, 10 mm genişliğinde, 0.7 mm kalınlığında ve birincil rezonans frekansı 3 MHz, Malzeme Tablosuna bakınız) sırasıyla odanın üç ortogonal duvarının dışına dikkatlice yapıştırın. Alt PZT dönüştürücünün haznenin altında ortalandığından emin olun.</li>
	<li>Her PZT dönüştürücünün iki iletken alanına lehim telleri.</li>
	<li>Son olarak, alt PZT'nin diğer tezgahlarla temas etmesini önlemek için cihazı içi boş bir tabana sabitleyin.</li>
</ol>2. Akustik montaj sisteminin kurulması
<ol><li>Akustik cihazı bir mikroskop tablasına monte ederek başlayın, odanın iç kısmının üstten görünüşlü gözlemine izin verin.</li>
	<li>Cihazın PZT transdüserlerinden arındırılmış yan tarafına, odanın iç kısmının yandan görünümünün gözlemlenmesini sağlayan bir dijital mikroskop yerleştirin.</li>
	<li>Üç PZT dönüştürücüsünden gelen kabloları seri olarak üç güç amplifikatörüne ve fonksiyon üreteçlerinin üç çıkış kanalına bağımsız olarak bağlayın (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Sinüzoidal dalga formu, frekans ve genlik gibi parametreleri belirterek her PZT dönüştürücü için fonksiyon üreteçlerindeki ayarları programlayın.</li>
	<li>Sterilizasyonu sağlamak için, akustik cihazın haznesini 5 dakika boyunca% 75 alkolle doldurun, ardından steril PBS solüsyonu ile iyice temizleyin. Daha sonra, odayı en az 1 saat boyunca temiz bir tezgahta UV ışığı ile ışınlayın.</li>
</ol>3. Hücre kültürü ve hasat prosedürü
<ol><li>Bir insan hepatoselüler karsinom hücre hattı olan C3A hücrelerini, %10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamını (DMEM) kullanarak bir T25 hücre kültürü şişesinde kültürleyerek başlayın (bkz.</li>
	<li>C3A hücreleri yaklaşık% 80 birleşmeye ulaştığında, hücre geçişini aşağıdaki gibi gerçekleştirin: ilk olarak, kültür şişesinin tabanını PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücre kültürü şişesine 2 mL %0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için 37 °C'de inkübe edin. 2 mL tam kültür ortamı ekleyerek tripsinizasyon işlemini durdurun.</li>
	<li>Hücre çözeltisini 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve bir hücre peleti elde etmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin.</li>
</ol>4. Bioink'in hazırlanması
<ol><li>0.3 g GelMA ve 0.025 g LAP'ı (Malzeme Tablosuna bakınız) 5 mL fosfat tampon çözeltisi (PBS) içinde çözerek% 0.5 (a / h) lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP) içeren% 6 (a / h) GelMA çözeltisi hazırlayın. Karışımı 47 °C'lik bir su banyosunda 1 saat bekletin.</li>
	<li>Hücrelerle karıştırmadan önce, sterilizasyon için GelMA çözeltisini 0.22 μm'lik bir filtreden (Malzeme Tablosuna bakınız) geçirin.</li>
	<li>Yukarıda bahsedilen hücre peletini (adım 3.3) hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Az miktarda hücreyi% 0.4 tripan mavisi çözeltisi ile boyayın ve ardından hücre sayımı için temiz bir hemositometre kullanın.</li>
	<li>2 × 106 hücre/mL hücre yoğunluğuna sahip biyomürekkebi hazırlamak için yukarıda elde edilen hücre yoğunluğuna göre hesaplanan uygun miktarda C3A hücresini sterilize edilmiş GelMA solüsyonu ile karıştırın.</li>
	<li>Birleştirilmiş hücre sferoidlerinin görselleştirilmesi için, C3A hücrelerini 2 μM hücre izleyici (DiO boyası, Malzeme Tablosuna bakınız) ile 37 °C'de 20 dakika inkübe ederek önceden boyayın. Daha sonra, etiketli hücreleri kullanmadan önce üç kez taze hücre kültürü ortamıyla yıkayın.</li>
</ol>5. Akustik cihazı kullanarak hücre sferoidlerinin montajı
<ol><li>Sterilize edilmiş hazneye 1 mL'den fazla biyomürekkebi pipetleyin. Sıvı yüzeyi ile hazne tabanı arasındaki yüz yüze mesafenin, akustik dalga boyunun yarısının tam sayı katı olduğundan emin olun. NOT: Eklenen biyomürekkebin hacmini ayarlayarak bu mesafe kontrol edilebilir. Akustik dalga boyu (λ), λ = c/f formülü kullanılarak tahmin edilebilir, burada c ortamdaki ses hızını temsil eder ve f, PZT dönüştürücünün frekansıdır.</li>
	<li>Fonksiyon üretecini ve gücü açın amplifier her bir PZT dönüştürücünün çalıştırılmasını başlatmak için. NOT: Optimum paralel hat hücresel modelini elde etmek için önce her bir PZT dönüştürücüsünün ayrı ayrı çalıştırılması önerilir. Bu, her bir PZT dönüştürücü için birincil rezonans frekansına yakın 0.001 MHz'lik bir adım boyutuna sahip bir frekans taraması gerçekleştirilerek elde edilebilir. Daha sonra, beklenen 3D noktalı hücresel modeli elde etmek için bu optimum sinyalleri aynı anda üç PZT dönüştürücüsüne de uygulayın. Her bir giriş sinyalini uygulamadan önce, hafifçe çalkalayarak hücrelerin biyomürekkep içinde eşit şekilde dağıldığından emin olun.</li>
	<li>Akustik olarak bir araya getirilen hücre agregalarını kapsülleyen bir 3D hidrojel iskele oluşturmak için mavi ışık (405 nm, 60 mW/cm2, 30 s) kullanarak biyomürekkebi çapraz bağlayın. Ardından, fonksiyon üretecini ve güç amplifikatörünü kapatın.</li>
	<li>3D hidrojel iskeleyi hazneden dikkatlice bir Petri kabına aktarın ve temiz bir tıraş bıçağı kullanarak küçük parçalara (örn. 2 mm × 2 mm × 2 mm) kesin.</li>
	<li>Yetiştirme için hücre kültürü ortamı ekleyin. NOT: Kültür ortamını her gün değiştirmeyi unutmayın.</li>
</ol>6. Hücre sferoidlerinin alınması
<ol><li>Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak iskelelerin farklı katmanlarında küresel oluşumu gözlemleyerek başlayın.</li>
	<li>3 günlük kültürden sonra, kültür ortamını çıkarın ve hidrojel iskeleleri PBS ile iki kez iyice yıkayın.</li>
	<li>İskeleleri, bir hücre inkübatöründe 30 dakika boyunca hücre kültürü ortamı ile 1: 200 seyreltmede 2 mL'den fazla GelMA lizis tamponu ile inkübe edin. Bu adım, hidrojel iskelelerini çözmeyi amaçlar.</li>
	<li>Çözeltiyi önceki adımdan bir tüpe aktarın ve ardından hücre sferoid peletini elde etmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve sonraki uygulamalar için peleti taze kültür ortamında yeniden süspanse edin.</li>
</ol>7. Küresel canlılık analizi
<ol><li>Hücre sferoidlerinin hidrojel iskeleleri içinde veya alınan sferoidlerde canlılığını canlı/ölü boyama kiti kullanarak değerlendirin (bkz.</li>
	<li>Numuneleri farklı kültür zaman noktalarında 1 μL Calcein-ve 2 μL Propidyum İyodür (PI) içeren 1 mL PBS çözeltisi ile 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Hidrojel iskelelerdeki numuneler için, bunları doğrudan PBS ile iki kez yıkayın. Alınan sferoidler için, bir küresel pelet elde etmek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleyin ve gözlemden önce iki kez yıkayın.</li>
	<li>Bir floresan mikroskobu kullanarak numuneleri gözlemleyin ve floresan görüntülerini yakalayın.</li>
	<li>Küresel canlılığı belirlemek için ImageJ kullanarak Calcein-ile boyanan alanın hem Calcein-hem de PI ile boyanan toplam alana oranını hesaplayın.</li>
</ol>

3D Akustik Montaj Cihazı Kullanarak Tek Tip Hücre Sferoidlerinin Ölçeklenebilir Üretimi

<ol>
	<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+tumor+application,+advantages,+and+disadvantages.">3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).</li><li>Decarli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+spheroids+as+a+versatile+research+platform:+formation+mechanisms,+high+throughput+production,+characterization+and+applications.">Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications.</a> Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).</li><li>Lee, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+spheroids+potentiating+cell-cell+and+cell-ECM+interactions+by+self-assembly+of+stem+cell+microlayer.">Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer.</a> Biomaterials. 165, 105-120 (2018).</li><li>Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+spheroids+as+building+blocks+towards+3d+bioprinting+of+tumor+microenvironment.">Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment.</a> International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).</li><li>Laschke, M. W., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+is+3D:+boosting+spheroid+function+for+tissue+engineering.">Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).</li><li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+drug+screening+based+on+massive+3d+tumor+cultures+using+micropatterned+array+chips.">Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips.</a> Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).</li><li>Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+microsystems+for+spheroid+and+organoid+studies.">Engineered microsystems for spheroid and organoid studies.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).</li><li>Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+multi-cellular+spheroids+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+acoustic+manipulation+of+living+cells+and+organisms+based+On+2D+array.">3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).</li><li>Armstrong, J. P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+anisotropic+muscle+tissue+using+acoustic+cell+patterning.">Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning.</a> Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).</li><li>Drinkwater, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perspective+on+acoustical+tweezers-devices,+forces,+and+biomedical+applications.">A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications.</a> Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).</li><li>Bouyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bio-Acoustic+Levitational+(BAL)+assembly+method+for+engineering+of+multilayered,+3d+brain-like+constructs,+using+human+embryonic+stem+cell+derived+neuro-progenitors.">A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors.</a> Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).</li><li>Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-assisted+biofabrication+and+bioprinting+of+preferentially+aligned+three-dimensional+cellular+constructs.">Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs.</a> Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+assembly+of+cell+spheroids+in+disposable+capillaries.">Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries.</a> Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+hydrogel+arrays+individually+encapsulating+acoustic+formed+multicellular+aggregates+for+high+throughput+drug+testing.">On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing.</a> Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acoustofluidic+focusing+and+separation+of+rare+tumor+cells+using+transparent+lithium+niobate+transducers.">The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers.</a> Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+acoustofluidic+fabrication+of+tumor+spheroids.">High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids.</a> Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).</li><li>Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+cell+spheroids+using+Standing+Surface+Acoustic+Wave+(SSAW).">Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW).</a> International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).</li><li>Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+waves+that+make+the+pattern:+a+review+on+acoustic+manipulation+in+biomedical+research.">The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research.</a> Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).</li><li>Harley, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+biofabrication+techniques+towards+functional+bioprinted+heterogeneous+engineered+tissues:+A+comprehensive+review.">Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review.</a> Bioprinting. 23, 00147 (2021).</li><li>Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+and+applications+of+surface+and+bulk+acoustic+wave+devices:+a+review.">Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review.</a> Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+holographic+cell+patterning+in+a+biocompatible+hydrogel).">Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel).</a> Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).</li><li>Miao, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fabrication+of+cell+spheroids+with+3D+acoustic+assembly+devices.">High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices.</a> International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).</li><li>Jeger-Madiot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+and+culture+of+Mesenchymal+Stem+Cell+spheroids+in+acoustic+levitation.">Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).</li><li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidic+assembly+of+3D+neurospheroids+to+model+Alzheimer's+disease.">Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer's disease.</a> Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).</li><li>Mei, J., Zhang, N., Friend, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+surface+acoustic+wave+devices+on+lithium+niobate.">Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).</li><li>Niculescu, A. G., Chircov, C., B&#238;rc&#259;, A. C., Grumezescu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+applications+of+microfluidic+devices:+a+review.">Fabrication and applications of microfluidic devices: a review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

3D akustik montaj cihazı gibi teknolojiler kullanılarak yüksek verime sahip hücre sferoidlerinin verimli ve istikrarlı üretimi, biyomedikal mühendisliğini ve ilaç taramasınıilerletmek için büyük umut vaat ediyor 1,2,3. Bu yaklaşım, basit prosedürlerle hücre sferoidlerinin seri üretimini basitleştirir.
Ancak, bu akustik cihazı kullanırken göz önünde bulundurulması gereken krit...

Konvansiyonel 2D kültür modellerine kıyasla daha fazla in vivo benzeri yapısal ve morfolojik özellikler sağlayan 3D in vitro kültür modelleri, doku mühendisliği, hastalık modellemesi ve ilaç taraması gibi çeşitli biyomedikal uygulamalarda umut verici sistemler olarak kabul edilmiştir 1,2,3. Bir tür 3D kültür modeli olarak, hücre sferoidleri tipik olarak hücre agregasyonuna atıfta bulunur ve gelişmiş hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimleri ile karakterize edilen 3D küresel yapılar oluşturur 4,5,6. Bu nedenle, hücre sferoidlerinin üretilmesi, çeşitli biyolojik çalışmalara olanak sağlamak için güçlü bir araç haline gelmiştir.
Sferoidleri elde etmek için asılı damla7, yapışkan olmayan plakalar8 veya mikrokuyu cihazları9 dahil olmak üzere çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Prensip olarak, bu yöntemler genellikle hücreler ve substrat arasındaki etkileşimleri en aza indirirken yerçekimi kuvveti gibi fiziksel kuvvetleri kullanarak hücre montajını kolaylaştırır. Bununla birlikte, genellikle emek yoğun süreçleri içerirler, düşük üretkenliğe sahiptirler veküresel boyut 10,11'i kontrol etmek için zorluklar oluştururlar. Daha da önemlisi, istenen büyüklükte ve homojenlikte yeterli miktarda sferoidlerin üretimi, spesifik biyolojik uygulamaları karşılamak için son derece önemlidir. Yukarıda belirtilen yöntemlerin aksine, akustik dalgalar, bir tür dış kuvvetle çalışan teknikolarak 12,13,14, dış kuvvetler yoluyla hücre agregasyonunu artırma ilkesine dayalı olarak, hücre sferoidlerinin yüksek kalite ve verimle seri üretimi için potansiyel göstermiştir 15,16,17,18. Elektromanyetik veya manyetik kuvvetlerin aksine, akustik tabanlı hücre manipülasyon teknikleri non-invaziv ve etiketsizdir, mükemmel biyouyumluluk ile sferoid oluşumunu sağlar19,20.
Yaygın olarak, duran yüzey akustik dalgaları (SAW'lar) ve toplu akustik dalgalar (BAW'lar) tabanlı cihazlar, karşılık gelen duran akustik alanlar 21,22,23 tarafından üretilen akustik düğümleri (AN'ler) kullanarak sferoidler oluşturmak için geliştirilmiştir. Özellikle, uygun üretim, kolay kullanım ve mükemmel ölçeklenebilirlik özelliklerine sahip BAW'lara dayalı akustik montaj cihazları, hücre sferoidlerininimalatında dikkat çekmiştir 24,25. Kısa bir süre önce, yüksek verim26 ile sferoidler üretme yeteneğine sahip, BAWS tabanlı basit bir akustik montaj cihazı geliştirdik. Önerilen cihaz, sırasıyla X/Y/Z düzleminde düzenlenmiş üç kurşun zirkonat titanat (PZT) dönüştürücüye sahip bir kare polimetil metakrilat (PMMA) odasından oluşur. Bu düzenleme, hücre montajını yürütmek için havaya kaldırılmış akustik düğümlerden (LAN'lar) oluşan bir 3B nokta dizisi modelinin oluşturulmasını sağlar. Yalnızca 1D veya 2D ANs 27,28,29 dizisi oluşturabilen daha önce bildirilen BAW'lar veya SAW'lar tabanlı cihazlarla karşılaştırıldığında, mevcut cihaz, jelatin metakriloyl (GelMA) çözeltisi içinde hızlı hücre agregası oluşumu için bir 3D nokta LAN dizisi sağlar. Daha sonra, hücre agregaları, üç günlük ekimden sonra fotokürlenmiş GelMA iskeleleri içinde yüksek canlılığa sahip sferoidlere olgunlaştı. Son olarak, aşağı akış uygulamaları için GelMA iskelelerinden tek tip boyuta sahip çok sayıda sferoid kolayca elde edildi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-&#956;m filter</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SLGSM33SS</td>
			<td>Used for GelMA solution sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm-cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>Used for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1RHD25</td>
			<td>Fluorescent cell observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO dye</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1038</td>
			<td>Dye used to stain cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430054</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td>Cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG5352</td>
			<td>For RF signal generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelMA</td>
			<td>Regenovo</td>
			<td>none</td>
			<td>Used to prepare bioink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelMA lysis buffer</td>
			<td>EFL</td>
			<td>EFL-GM-LS-001</td>
			<td>Used to dissolve GelMA scaffolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-U</td>
			<td>Cell observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>900889</td>
			<td>Used as photoinitiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live-Dead kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C2015M</td>
			<td>Cell vability analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010002</td>
			<td>Used as buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Prevent cell culture contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power amplifer</td>
			<td>Minicircuit</td>
			<td>LCY-22+</td>
			<td>Increase the voltage amplitude of the RF signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PZT transducers</td>
			<td>Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd.</td>
			<td>PZT-41</td>
			<td>Functional units for acoustic assembly device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>Used for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional acoustic assembly device for mass manufacturing of cell spheroids

Hücre küreleri, birçok biyolojik alanda geniş uygulama alanları kazanmış umut verici üç boyutlu (3D) modellerdir. Bu protokol, manevra kabiliyetine sahip prosedürler aracılığıyla bir 3D akustik montaj cihazı kullanarak yüksek kaliteli ve yüksek verimli hücre sferoidleri üretmek için bir yöntem sunar. Akustik montaj cihazı, her biri bir kare polimetil metakrilat (PMMA) odasının X/Y/Z düzleminde düzenlenmiş üç kurşun zirkonat titanat (PZT) dönüştürücüsünden oluşur. Bu yapılandırma, üç sinyal uygulandığında havaya kaldırılmış akustik düğümlerin (LAN'lar) 3B nokta dizisi modelinin oluşturulmasını sağlar. Sonuç olarak, jelatin metakriloyl (GelMA) çözeltisindeki hücreler, üç boyutta tek tip hücre agregaları oluşturarak LAN'lara sürülebilir. GelMA çözeltisi daha sonra UV ışınla kürlenir ve hücre agregalarının büyümesini destekleyen bir iskele görevi görmek üzere çapraz bağlanır. Son olarak, olgunlaşmış sferoid kütleleri elde edilir ve daha sonra GelMA iskelelerinin hafif koşullar altında çözülmesiyle elde edilir. Önerilen yeni 3D akustik hücre montaj cihazı, biyolojik alanda büyük potansiyel teknoloji sunan hücre sferoidlerinin ve hatta organoidlerin ölçeklendirilmesini sağlayacaktır.

3D in vitro culture models, which provide more in vivo-like structural and morphological characteristics compared to conventional 2D culture models, have been recognized as promising systems in various biomedical applications such as tissue engineering, disease modeling, and drug screening1,2,3. As one type of 3D culture model, cell spheroids typically refer to cell aggregation, creating 3D spheroidal structures characterized by enhanced cell-cell and cell-matrix interactions4,5,6. Therefore, fabricating cell spheroids has become a powerful tool for enabling diverse biological studies.
Various techniques, including hanging drop7, non-adhesive plates8, or microwell devices9, have been developed to obtain spheroids. In principle, these methods commonly facilitate cell assembly by utilizing physical forces such as gravitational force while minimizing interactions between cells and the substrate. However, they often involve labor-intensive processes, have low productivity, and pose challenges for controlling spheroid size10,11. Importantly, the production of spheroids with the desired size and uniformity in sufficient quantity is of utmost importance to satisfy specific biological applications. In contrast to the above-mentioned methods, acoustic waves, as one type of external-force-driven technique12,13,14, have shown potential for mass manufacturing of cell spheroids with high quality and throughput, based on the principle of enhancing cell aggregation through external forces15,16,17,18. Unlike electromagnetic or magnetic forces, acoustic-based cell manipulation techniques are non-invasive and label-free, enabling spheroid formation with excellent biocompatibility19,20.
Commonly, standing surface acoustic waves (SAWs) and bulk acoustic waves (BAWs)-based devices have been developed to generate spheroids, utilizing the acoustic nodes (ANs) produced by corresponding standing acoustic fields21,22,23. Particularly, acoustic assembly devices based on BAWs, with the merits of convenient manufacture, easy operation, and excellent scalability, have gained attention for fabricating cell spheroids24,25. We have recently developed a facile BAWs-based acoustic assembly device with the ability to generate spheroids with high throughput26. The proposed device consists of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber with three lead zirconate titanate (PZT) transducers arranged respectively in the X/Y/Z plane. This arrangement enables the creation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) for driving cell assembly. Compared to previously reported BAWs- or SAWs-based devices, which can only create a 1D or 2D array of ANs27,28,29, the present device enables a 3D dot-array of LANs for rapid cell aggregate formation within the gelatin methacryloyl (GelMA) solution. Subsequently, cell aggregates matured into spheroids with high viability within the photocured GelMA scaffolds after three days of cultivation. Finally, a large number of spheroids with uniform size were easily obtained from the GelMA scaffolds for downstream applications.

Yazar Spotlight: Yüksek Kaliteli 3D Hücre Küresel Kültürü için İskelesiz Akustik Montaj Yönteminin Geliştirilmesi 

Hücre sferoidlerinin seri üretimi için üç boyutlu akustik montaj cihazı

3D in vitro culture models, like cell spheroids, have been widely used in the fields of tissue engineering, disease modeling, and drug screening. Our research focuses on developing and invest per engineering method to fabricate spheroids or other 3D in vitro culture models with high quality for diverse biological studies. In the current protocol, the spheroids grew within the GelMA scaffold and are retrieved at the final layback, dissolving the scaffold, causing additional procedures.We will try to acoustically assemble cell aggregates in a cultural medium to enable them to grow within spheroids without scaffold. Compared to magnetic assembly techniques, acoustic waves can directly assemble cells in a label-free manner without potential toxic effects on cells. Besides, our protocol enables cell spheroids to be assembled in a three-dimensional array, substantially increasing throughput.

Bu çalışma, hücre kürelerinin seri üretimi için bir 3D akustik montaj cihazı tasarladı. Akustik cihaz, odanın dış yüzeyinde X-düzlemine ve Y-düzlemine bağlı iki PZT dönüştürücü ve odanın tabanında bir PZT dönüştürücü bulunan kare bir odadan oluşuyordu (Şekil 1A,B). PZT transdüserlerini harekete geçirmek için üç bağımsız sinüzoidal sinyal üretmek için iki fonksiyon üretecinden üç çıkış kanalı üç güç amplifikatörüne ba?...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Scaffold-Free Acoustic Assembly Method for High-Quality 3D Cell Spheroid Culture at JoVE.com

Hücre sferoidleri, biyolojik uygulamalar alanında potansiyel bir model olarak kabul edilmiştir. Bu makale, tek tip hücre sferoidlerinin sağlam ve hızlı üretimi için etkili bir yöntem sağlayan bir 3D akustik montaj cihazı kullanarak hücre sferoidlerini ölçeklendirilebilir şekilde üretmeye yönelik protokolleri açıklamaktadır.

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...

Hücre sferoidleri gibi 3D in vitro kültür modelleri, doku mühendisliği, hastalık modellemesi ve ilaç taraması alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Araştırmamız, çeşitli biyolojik çalışmalar için yüksek kalitede sferoidler veya diğer 3D in vitro kültür modelleri üretmek için mühendislik yöntemine göre geliştirmeye ve yatırım yapmaya odaklanmaktadır. Mevcut protokolde, sferoidler GelMA iskelesi içinde büyüdü ve son yerleştirmede geri alındı, iskeleyi çözerek ek prosedürlere neden oldu.Hücre agregalarını kültürel bir ortamda akustik olarak bir araya getirmeye çalışacağız ve böylece iskele olmadan sferoidler içinde büyümelerini sağlayacağız. Manyetik montaj teknikleriyle karşılaştırıldığında, akustik dalgalar, hücreler üzerinde potansiyel toksik etkiler olmaksızın hücreleri doğrudan etiketsiz bir şekilde birleştirebilir. Ayrıca, protokolümüz, hücre sferoidlerinin üç boyutlu bir dizide birleştirilmesini sağlayarak verimi önemli ölçüde artırır.

three-dimensional-acoustic-assembly-device-for-mass-manufacturing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

777 Görüntüleme.  Hangzhou Dianzi University. Hücre sferoidleri gibi 3D in vitro kültür modelleri, doku mühendisliği, hastalık modellemesi ve ilaç taraması alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Araştırmamız, çeşitli biyolojik çalışmalar için yüksek kalitede sferoidler veya diğer 3D in vitro kültür modelleri üretmek için mühendislik yöntemine göre geliştirmeye ve yatırım yapmaya odaklanmaktadır. Mevcut protokolde, sferoidler GelMA iskelesi içinde büyüdü ve son yerleştirmede geri alındı, iskel...

Video: Yazar Spotlight: Yüksek Kaliteli 3D Hücre Küresel Kültürü için İskelesiz Akustik Montaj Yönteminin Geliştirilmesi 

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

Biyomühendislik

Setting Up an Acoustic Assembly System and Cell Culture Harvesting for Generating Uniform Cell Spheroids

To begin, sterilize the chamber of the acoustic device with 75%alcohol for five minutes. Then, clean the device with sterile PBS and irradiate it with UV light for one hour. Mount the sterile acoustic device onto a microscope stage for top-view observation of the chamber's interior.Position a digital microscope on the side of the device that is free from PZT transducers, enabling side-view observation of the chamber's interior. Independently connect the wires from the three PZT transducers in series to three power amplifiers and three output channels of function generators. Program the settings on the function generators for each PCT transducer, specifying parameters such as sinusoidal waveforms, frequency, and amplitude.Culture 3CA cells in DMEM supplemented with 10%FBS and 1%penicillin streptomycin in a T25 cell culture flask. When the cells become 80%confluent, wash the culture twice with PBS. After removing the PBS, add two milliliters of 0.05%trypsin-EDTA to the flask and incubate at 37 degrees Celsius for cell detachment.Add two milliliters of complete cell culture medium into the flask to stop the trypsinization. Transfer the cell suspension to a 15-milliliter tube and centrifuge at 200 G for five minutes.

Tek tip hücre sferoidleri üretmek için bir akustik montaj sistemi ve hücre kültürü hasadı kurulması

Bioink Preparation, Acoustic Device Assembly, and Viability Analysis of Cell Spheroids

To prepare the bio ink solution mix an appropriate amount of C3A cell suspension with the sterilized gelMA solution. Prestain the C3A cell spheroids with two micromolar cell tracker solution at 37 degrees for 20 minutes. To wash the cells, first, remove the supernatin by centrifuging and then add fresh cell culture medium.Add at least two milliliters of bio ink into the sterilized acoustic device chamber. Turn on the function generator and power amplifier to initiate the actuation of each PZT transducer to generate a 3D array of cell aggregates. Crosslink the bio ink using blue light for 30 seconds to create 3D hydrogel scaffolds, encapsulating the assembled cell aggregates acoustically.Next, carefully transfer the 3D hydrogel scaffold from the chamber into a Petri dish. Cut it into small pieces using a clean razor, and then add cell culture medium into the Petri dish. Incubate the C3A cell spheroids at different culture time points in one milliliter of PBS containing one microliter of calcium am and two microliters of propidium iodide for 15 minutes at 37 degrees Celsius.Rinse the sample embedded in hydrogel scaffolds twice with PBS. For retrieved spheroids, perform centrifugation at 200 G for five minutes and wash twice with PBS. Using a fluorescence microscope, observe the spheroids and capture the images.The cell aggregates were arranged in the regular 3D dot array pattern with a green fluorescent signal. The assembled C3A gelMA aggregates gradually integrated and formed tight spheroids by day three, accompanied by an increase in spheroid diameter. The viability of the cell spheroids remained good before day three, but slightly decreased after a week of culture.The released spheroids maintained a good spherical morphology with a narrow size distribution along with desirable viability and expression of albumin.