Protokolümüz, ileri doku mühendisliği, ilaç geliştirme ve hastalık modelleme uygulamalarımız için kritik olan homojen doku sferoidlerinin verimli ve büyük ölçekli üretimini mümkün kıldığı için önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, büyük miktarlarda tek tip doku sferoidini hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde üretme yeteneğidir, yüksek hücre canlılığını sağlar ve çeşitli biyomedikal uygulamalarımız için çok önemli olan sferoid kalitesinden oluşur Hastaya özgü steroidler üreterek, bu teknik, hassas hastalık modellemesini ve moleküler ve davranışsal mekanizmaların anlaşılmasını sağlayan fizyolojik olarak doğru bir model sunar. kanser dahil. Bu yöntem, kanser araştırmaları, nörodejeneratif hastalık ve doku mühendisliği hakkında bilgi sağlayabilir ve çeşitli biyolojik sistemler hakkındaki anlayışımızı geliştirerek ilaç geliştirme ve kişiselleştirilmiş tıbba uygulanabilir.
Görme gösterimiz, cihaz yerleştirme ve hücre tohumlama gibi karmaşık adımları net bir şekilde gösterdiği, yaygın hataların önlenmesine yardımcı olduğu ve uygun tekniğin tutarlı sonuçlar için bir yastık olmasını sağladığı için kritik öneme sahiptir. Bir cam kapta% 2 agaroz jeli hazırlamak için agaroz tozunu bir x PBS'ye ekleyerek başlayın. Süspansiyonu dairesel hareketlerle homojenize edin.
Cam kabı bir mikrodalga fırına koyun ve süreyi 30 saniyeye ayarlayın. Mikrodalgayı her beş saniyede bir durdurun, cam şişeyi çıkarın ve çözeltiyi dairesel hareketlerle manuel olarak homojenize edin. Çözelti sıvı berrak bir duruma ulaşana kadar ısıtma işlemini gerçekleştirin.
Daha sonra, altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna altı mililitre agaroz çözeltisi ekleyin ve 15 dakika veya agaroz katılaşana kadar bekleyin. Ardından 3D baskılı biyo cihazı yavaşça sıvı agarozun üzerine yerleştirin ve 30 dakika veya agaroz katılaşana kadar bekleyin. Ardından cihazı agarozdan yavaşça çıkarın ve iki mililitre DMEM ortamı ekleyin.
Ortamı atmadan ve yeni DMEM ile değiştirmeden önce 10 dakika bekleyin. Yıkamayı üç kez tekrarlayın. Bittiğinde, iki mililitre DMEM ekleyin ve hücre tohumlama için altı oyuklu plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ve% 80 nem içeren bir inkübatöre yerleştirin.
Fare fibroblast hücrelerini hücre kültürü şişelerinde büyütün ve %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde 37 santigrat derecede,% 80 birleşme elde edilene kadar tutun. Daha sonra hücreleri bir x PBS ile yıkayın ve ayrışma enzimini ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ve% 80 nemde iki ila beş dakika inkübe edin.
Hücreler hücre kültürü şişesinden ayrıldıktan sonra, hücre ayrışma enzimini nötralize etmek için bir büyüme ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin ve hücreleri sayın. Bir tüpte alınan beş hücrenin gücüne 50 kez 10 kez, bir x PBS'den beş mililitre ekleyin.
Daha sonra, hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin. Bir mililitre hücre kültürü ortamı eklemeden ve çözeltiyi homojenize etmeden önce bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın. Daha önce hazırlanan altı oyuklu plakadan, iki mililitre ortamı çıkarın ve 3D baskılı biyo cihaz tarafından oluşturulan agaroz kalıbının merkezine bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Kuyucuğa bir mililitre hücre kültürü ortamı eklemeden önce hücrelerin mikro rezeksiyonlarda çökelmesi için 20 ila 30 dakika bekleyin. Doku sferoid oluşumu için altı oyuklu plakayı yaklaşık 24 ila 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. Silindirik mikro pimlerden oluşan 3D baskılı damga benzeri cihaz, foto kürlenebilir bir reçine kullanılarak stereolitografi yöntemiyle başarılı bir şekilde üretildi.
Cihaz basitti, sterilize edilmesi kolaydı, tekrar kullanılabilir ve farklı boyutlardaki kuyu plakaları ve Petri kapları için ayarlanabilirdi. 750 homojen mikro rezeksiyon kuyusu veya altı oyuklu plaka başına 4.716 üretti. Cihazın plaktan erken çekilmesi yapışık olmayan kalıbı bozmuş ve mikro rezeksiyon geometrisini bozmuştur.
Yapışık olmayan agaroz küfleri üzerine ekilen hücreler çökelmiş ve yaklaşık 24 saat sonra doku sferoidlerini oluşturmuştur. Bu metodoloji, şekillerini, boyutlarını ve canlılıklarını koruyarak sferoidlerin büyük ölçekli üretimini başarıyla gösterdi ve steroid kültürünü aylarca destekledi. Bu prosedürü düşündüğümde hatırlamam gereken en önemli şey, hava kabarcıklarını önlemek için cihazı dikkatlice yerleştirmek ve hücreleri rahatsız etmemek için nazikçe kültür ortamı eklemektir.
Bu prosedürü takiben ilaç testi ve gen ekspresyon analizi yapılabilir. İlaç etkinliği, iştah açıcı ve tedavilere genetik yanıt ile ilgili soruları yanıtlamak. Bu teknik, 3D biyo-baskı için kritik olan büyük ölçekli, yüksek kaliteli sferoid üretimine izin vererek doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta yeni araştırmalara olanak sağlayacak ve farmasötik ve kozmetik toksisite testi için hücre kalitesini ve miktarını artıracaktır.
