Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82202473) tarafından desteklenmiştir.

Protokol adımlarına genel bakış Şekil 1'de gösterilmektedir. Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Medya hazırlığı
<ol><li>450 mL bazal kültür ortamı, 50 mL eksozomsuz fetal sığır serumu ve 5 mL üçlü antibiyotik kullanarak eksozomsuz ADSC için bir kültür ortamı hazırlayın.</li>
</ol>2. ADSC'lerin canlandırılması ve kültürlenmesi
NOT: ADSC'leri yeniden canlandırın.
<ol><li>Ultra temiz masanın UV radyasyonunu önceden açın ve 30 dakika dezenfekte edin.</li>
	<li>Ortamı önceden 37 °C'lik bir su banyosunda önceden ısıtın.</li>
	<li>Sıvı nitrojenden 2 tüp donmuş ADSC (P3) alın ve tamamen çözülene kadar 37 ° C'lik bir su banyosunda sabit sıcaklıkta çalkalayın. NOT: Kontaminasyonu önlemek için dondurucu borusunun açıklığı su ile temas etmemelidir.</li>
	<li>Kriyoprezervasyon tüpünü %75 alkol kullanarak dezenfekte edin ve ardından ultra temiz masaya taşıyın. Hücre süspansiyonunu bir pipet kullanarak aspire edin ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
	<li>Santrifüj tüpünü düşük hızlı bir santrifüj makinesine yerleştirin ve 250 x g'da 5 °C'de 4 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Dört adet 10 cm'lik kültür kabı hazırlayın ve her tabağa 9 mL orta boy koyun. Adını, hücre tipini, üretimini ve deney tarihini işaretleyin ve ardından bunları 37 °C termostatik hücre inkübatörde önceden ısıtın.</li>
	<li>Santrifüj tüpünü dezenfekte edin ve ultra temiz masaya taşıyın. Süpernatanı bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>4 mL ortam ekleyin ve çözeltiyi (1 x 105 hücre / mL) eşit şekilde dağılana kadar hafifçe çalkalayın. NOT: Süpernatanı çıkarırken hücre peletini ortadan kaldırmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Her yemeğe 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Bulaşıkları çapraz yöntemle çalkalayın. NOT: Plakayı düz bir yüzeye yerleştirin ve 5-6 tekrar için çapraz bir düzende (yukarı, aşağı, sola ve sağa hareket ettirerek) çalkalayın. Merkezde hücre birikimine neden olabileceğinden dairesel hareketlerden kaçının.</li>
	<li>Optik mikroskopla hücreleri 40x büyütmede gözlemleyin ve ardından bulaşıkları inkübatöre yerleştirin. NOT: Hücreleri gözlemlemenin birincil amacı, eşit olmayan dağılım sonraki büyümeyi etkileyeceğinden, eşit dağılıp dağılmadıklarını belirlemektir.</li>
	<li>Hücreler için değişim ortamı hazırlayın.<ol><li>Ultra temiz masanın UV radyasyonunu önceden açın ve 30 dakika dezenfekte edin.</li>
		<li>Ortamı önceden 37 °C'lik bir su banyosunda önceden ısıtın.</li>
		<li>Optik mikroskop altında 40x büyütmede hücre durumunu gözlemleyin. Birleşme seviyesi yaklaşık% 50'dir. NOT: Birleşme seviyesi, hücreler duvara yapıştıktan ve tamamen gerildikten sonra hücrelerin kapladığı alanın petri kabının yüzey alanına oranı olarak hesaplanır.</li>
		<li>Dezenfeksiyondan sonra kültür kabını ultra temiz masaya (Biyogüvenlik seviyesi 2) aktarın ve ortamı çıkarın.</li>
		<li>Her kültür kabını 2 mL PBS çözeltisi ile iki kez nazikçe durulayın.</li>
		<li>Her yemeğe 10 mL orta boy ekleyin. Bulaşıkları kuluçka makinesine aktarın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Süpernatan ADSC'lerin toplanması ve EV'lerin çıkarılması
<ol><li>Ultra temiz masanın UV radyasyonunu önceden açın ve 30 dakika dezenfekte edin.</li>
	<li>Hücre durumunu mikroskop altında gözlemleyin. Birleşme seviyesi yaklaşık% 80'dir.</li>
	<li>Dezenfeksiyondan sonra çanağı ultra temiz masaya aktarın. Süpernatanı bir pipetle dikkatlice toplayın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. NOT: Hücreler dondurulabilir veya atılabilir. Sterilite gerekli değilse, ameliyat masasında aşağıdaki adımlar gerçekleştirilebilir. Bu noktada, deneme duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başlatılabilir. Deney durdurulursa, süpernatanı bir haftadan fazla olmamak üzere 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın. EV'lerin aktivitesini etkileyebileceğinden uzun süreli depolama önerilmez. En uygun yaklaşım, EV'leri hemen çıkarmaktır.</li>
	<li>Asılı hücreleri çıkarmak için santrifüjleyin (300 x g, 10 dakika, oda sıcaklığında). Süpernatanı bir pipetle toplayın. NOT: Dökmeyin. Peletin emilmesini önlemek için biraz süpernatan bırakın.</li>
	<li>Hücresel kalıntıları (2000 x g, 10 dk, 4 °C) çıkarmak için santrifüjleyin, ardından süpernatanı bir pipetle toplamaya devam edin. NOT: Önemli noktalar adım 3.4'teki ile aynıdır.</li>
	<li>Büyük parçacıkları ve hücre kalıntılarını gidermek için süpernatanı 0.22 um membranla filtreleyin. NOT: Filtrasyondan önce filtre membranını nemlendirmek için süpernatanı 2 mL steril PBS ile filtreleyin.</li>
	<li>Ultrasantrifüj makinesinde santrifüjleyin (10.000 x g, 30 dk, 4 °C).</li>
	<li>Daha sonra, peleti çıkarmak ve süpernatanı toplamak için 1,00,000 ° C'de 70 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. NOT: Elde edilen EV'ler, saflıklarını artırmak için birçok kez santrifüjleme ile saflaştırıldı. Pelet çıplak gözle görülemeyebilir. Bu nedenle, pelet toplanmasını önlemek için pipeti nazikçe çalıştırmak ve altta biraz süpernatan bırakmak çok önemlidir.</li>
	<li>Süpernatanı bir pipetle çıkarın. Peleti PBS ve santrifüj (1,00,000 x g, 70 dk, 4 °C) ile yeniden süspanse edin. NOT: Pelet çıplak gözle görülemeyebilir. Bu nedenle, süpernatanı bir pipetle aspire ederken, EV'lerin saflığını en üst düzeye çıkarmak için süpernatanı nazikçe ve iyice çıkarmak çok önemlidir.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve EV peletini elde edin. 1 mL PBS ile tekrar süspanse edin, 1 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve sonraki algılama için 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın. NOT: Pelet çıplak gözle görülemeyebilir. Sonuç olarak, süpernatanı bir pipetle aspire ederken, EV'nin saflığını en üst düzeye çıkarmak için süpernatanı nazikçe ve iyice çıkarmak çok önemlidir. Numunelere uzun süre ihtiyaç duyulmayacaksa, -80 °C'lik bir buzdolabında saklayın.</li>
</ol>

İnsan ADSC'lerinden Hücre Dışı Veziküllerin Ultrasantrifüj Tabanlı İzolasyonu

<ol>
	<li>Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine:+Looking+forward.">Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464 (2021).</li><li>Xin, H., Li, Y., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/miRNAs+as+mediating+cell-based+therapy+of+stroke.">Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke.</a> Front Cell Neurosci. 8, 377 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue+origin+effect+of+extracellular+vesicles+on+cartilage+and+bone+regeneration.">The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration.</a> Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).</li><li>Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+adipose+tissue-a+potential+role+in+obesity+and+type+2+diabetes.">Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202 (2017).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+biological+effects+of+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+were+markedly+increased+by+low-intensity+ultrasound+stimulation+for+promoting+diabetic+wound+healing).">Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing).</a> Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).</li><li>Mou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+from+human+adipose-derived+stem+cells+for+the+improvement+of+angiogenesis+and+fat-grafting+application.">Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application.</a> Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+bone+immobilized+with+human+adipose+stem+cells-derived+exosomes+promotes+bone+regeneration.">Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).</li><li>Han, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+inhibit+the+fibrosis+of+fibrotic+buccal+mucosal+fibroblasts+via+the+microRNA-375/foxf1+axis.">Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis.</a> Stem Cells Int. 2021, 9964159 (2021).</li><li>Brezgin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technological+aspects+of+manufacturing+and+analytical+control+of+biological+nanoparticles.">Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles.</a> Biotechnol Adv. 64, 108122 (2023).</li><li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Character+comparison+of+abdomen-derived+and+eyelid-derived+mesenchymal+stem+cells.">Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells.</a> Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).</li><li>Gan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+improve+liver+fibrosis+by+regulating+the+miR-20a-5p/TGFBR2+axis+to+affect+the+p38+MAPK/NF-&#954;B+pathway.">Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-&#954;B pathway.</a> Cytokine. 172, 156386 (2023).</li><li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+and+imaging+of+exosomes+by+transmission+electron+microscopy.">Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (131), e56482 (2018).</li><li>Han, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+exosomes+derived+from+hypoxia-preconditioned+adipose+mesenchymal+stem+cells+promotes+neovascularization+and+graft+survival+in+fat+grafting.">Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting.</a> Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).</li><li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles.">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).</li><li>Lamparski, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+clinical+grade+exosomes+derived+from+dendritic+cells.">Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells.</a> J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).</li><li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+from+blood+plasma:+Qualitative+and+quantitative+comparison+of+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography+methods.">Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+extracellular+vesicles+by+three-dimensional+dynamic+culture+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells.</a> J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235 (2022).</li><li>Eguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+with+cancer+stem+cell-like+properties+secrete+exosomes+and+HSP90+in+a+3D+nanoenvironment.">Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment.</a> PLoS One. 13 (2), e0191109 (2018).</li></ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir mali çıkarı yoktur.

Resmi deney süreci sırasında, en iyi deneysel sonuçları elde etmek için birkaç nokta çok önemlidir. Önceki deneyimlerimize dayanarak, mümkün olan en iyi hücre durumunu sağladıkları için geçiş 3-6 ADSC'lerin tercih edilmesi önerilir. P3'ten önce, kırmızı kan hücreleri, endotel hücreleri ve diğer çeşitli hücreler taranmamış olabilir. P6'dan sonra, hücreler yavaş yavaş yaşlanabilir ve bu da salgılanan EV'lerin durumunu etkileyebilir. İkinci olarak, mümkün olduğu kadar çok EV'nin yet...

Çoğu ADSC yağ dokusundan türetilir ve miyokard, kemik ve deri1 dahil olmak üzere çeşitli doku ve organların rejenerasyonunu ve yeniden inşasını teşvik ettiği gösterilmiştir. Son araştırmalar, ADSC'lerin rejeneratif fonksiyonunun hücreler arası temasa ve hücrelerin parakrin etkilerine bağlı olabileceğini düşündürmektedir2. Parakrin etkisi, hücrelerin kısa mesafelerde etkileşime girmesi ve bilgi aktarması için önemli bir araçtır ve bu işlev, hücre dışı veziküller (EV'ler) aracılığıyla sağlanır.
EV'ler, hücreler tarafından üretilen, çapı 40 nm ila 160 nm arasında değişen (ortalama yaklaşık 100 nm ile) çift katmanlı zar yapılarıdır. Sitokin üretimi, hücre proliferasyonu, apoptoz ve metabolizma gibi farklı hücresel fonksiyonları etkilerler 3,4. Kemik rejenerasyonunun teşvik edilmesi, oral mukozal doku rejenerasyonu, doku nakli sonrası yağ dokusu sağkalımı ve cilt yara onarımı dahil olmak üzere ADSC EV'lerin işlevleri üzerine çok sayıda çalışma yapılmıştır 5,6,7,8. ADSC EV'lerin rejeneratif tıptaki muazzam potansiyeli açıktır. EV'leri süpernatanttan çıkarmak ve ayırmak için santrifüjleme, çökeltme, moleküler büyüklük, afinite ve mikroakışkanlara dayalı teknikler gibi çeşitli yöntemler mevcuttur. Ultrasantrifüjleme yöntemi, EV'leri izole etmek için yaygın olarak altın standart olarak kabul edilir9. EV ayırma için ultrasantrifüjlemenin temel prensibi, numunedeki partiküllerin değişen sedimantasyon katsayılarına sahip olması ve bunun sonucunda bunların farklı ayırma katmanlarında sedimantasyon ve agregasyon ile sonuçlanması gerçeğine dayanmaktadır. Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme sırasında önlemleri vurgulayan ayrıntılı bir protokol henüz oluşturulmamıştır.
Bu nedenle, bu çalışma, ADSC kültürünü, süpernatant koleksiyonunu ve EV'lerin ultrasantrifüj prosedürlerini ve kilit noktalarını mantıklı bir bilgi akışı ve açık, resmi bir dille objektif bir şekilde özetlemektedir. Bu, gelecekteki deneyler için değerli bir referans sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>4652</td>
			<td>0.22 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal Medium For Cell Culture</td>
			<td>OriCell</td>
			<td>BHDM-03011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)</td>
			<td>OriCell</td>
			<td>HUXMD-05002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>Lx70-S8F2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Speed Centrifuge</td>
			<td>Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>SC-3612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-nr-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1410</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and characterization of extracellular vesicles from human adipose-derived mesenchymal stem cells

İnsan yağ kaynaklı mezenkimal kök hücreler (ADSC'ler), çeşitli doku ve organların yenilenmesini ve yeniden yapılandırılmasını teşvik edebilir. Son araştırmalar, rejeneratif işlevlerinin hücre-hücre temasına ve hücre parakrin etkilerine atfedilebileceğini düşündürmektedir. Parakrin etkisi, hücrelerin, hücre dışı veziküllerin (EV'ler) taşıyıcı olarak işlevsel bir rol oynadığı kısa mesafelerde etkileşime girmesi ve bilgi aktarması için önemli bir yoldur. Rejeneratif tıpta ADSC EV'ler için önemli bir potansiyel vardır. Bu yöntemlerin etkinliği hakkında çok sayıda çalışma bildirilmiştir. EV'lerin çıkarılması ve izole edilmesi için çeşitli yöntemler şu anda santrifüjleme, çökeltme, moleküler boyut, afinite ve mikroakışkanlar gibi ilkelere dayalı olarak tanımlanmaktadır. Ultrasantrifüjleme, EV'leri izole etmek için altın standart olarak kabul edilir. Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme sırasında alınacak önlemleri vurgulamak için titiz bir protokol hala mevcut değildir. Bu çalışma, ADSC kültürü, süpernatan toplama ve EV ultrasantrifüjlemesinde yer alan metodolojiyi ve önemli adımları sunmaktadır. Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme uygun maliyetli olmasına ve daha fazla tedavi gerektirmemesine rağmen, düşük geri kazanım oranı ve EV agregasyonu gibi bazı kaçınılmaz dezavantajlar vardır.

Most ADSCs are derived from adipose tissue and have been demonstrated to promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs, including the myocardium, bone, and skin1. Recent research suggests that the regenerative function of ADSCs may be due to intercellular contact and the paracrine effects of the cells2. The paracrine effect is an important means for cells to interact and transfer information over short distances, and this function is achieved through extracellular vesicles (EVs).
EVs are double-layer membrane structures produced by cells, with a diameter ranging from 40 nm to 160 nm (with an average of about 100 nm). They affect different cellular functions, such as cytokine production, cell proliferation, apoptosis, and metabolism3,4. Numerous studies have been conducted on the functions of ADSC EVs, including promoting bone regeneration, oral mucosal tissue regeneration, adipose tissue survival after tissue transplantation, and skin wound repair5,6,7,8. The enormous potential of ADSC EVs in regenerative medicine is evident. Various methods exist for extracting and separating EVs from the supernatant, such as techniques based on centrifugation, precipitation, molecular size, affinity, and microfluidics. The ultracentrifugation method is widely considered the gold standard for isolating EVs9. The fundamental principle of ultracentrifugation for EV separation is based on the fact that particles in the sample have varying sedimentation coefficients, resulting in their sedimentation and aggregation in distinct separation layers. Nevertheless, a detailed protocol emphasizing precautions during ultracentrifugation has not yet been established.
Therefore, this study objectively outlines the ADSC culture, supernatant collection, and EVs ultracentrifugation procedures and key points with a logical flow of information and clear, formal language. This provides a valuable reference for future experiments.

Yazar Spotlight: İnsan ADSC'lerinden Hücre Dışı Veziküllerin Ekstraksiyonu ve Saflaştırılmasının Standardizasyonu ve İyileştirilmesi

İnsan Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu

Our research focuses on the preparation and purification of extracellular vesicles from human adipose-derived mesenchymal stem cells. The problem we want to solve is how to standardize this process and improve the purification efficiency. Currently, there are many technologies used to extract extracellular vesicles, such as ultracentrifugation, ultrafiltration, volume exclusion chromatography, polymer precipitation, immunoaffinity capture, microfluidic technology, and so on.However, ultracentrifugation is recognized as a gold standard, admittedly. In the future, we will focus on the application of extracellular vesicles as vectors, including carrying MRNA, plasmids, and other small molecules and transfecting them into cells.

İlk olarak, ADSC'ler, morfolojileri10 ve yüzey antikorları dahil olmak üzere karakterize edildi ve tanımlandı. Şekil 2A'ya dayanarak, ADSC'lerin bir iğ şeklinde düzenlendiği ve yoğun büyümeden sonra bir girdap oluşturduğu açıktır. Kültürlenen hücreler adipojenik, osteojenik ve kondrojenik hücrelere ayrıldı ve Yağ Kırmızısı O, Alizarin Kırmızısı ve Alcian Mavisi11 ile boyandı. İndüklenmiş farklılaşma deney...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Standardizing and Improving the Extraction and Purification of Extracellular Vesicles from Human ADSCs at JoVE.com

Bu protokol, insan yağ kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (ADSC'ler) kültürlenmesinden ve süpernatantın toplanmasından ultrasantrifüjleme kullanılarak hücre dışı veziküllerin (EV'ler) çıkarılmasına kadar tüm prosedürleri açıklar.

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research ...

Araştırmamız, insan adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerden hücre dışı veziküllerin hazırlanması ve saflaştırılmasına odaklanmaktadır. Çözmek istediğimiz sorun, bu sürecin nasıl standartlaştırılacağı ve arıtma verimliliğinin nasıl artırılacağıdır. Şu anda, ultrasantrifüjleme, ultrafiltrasyon, hacim dışlama kromatografisi, polimer çökeltme, immünoaffinite yakalama, mikroakışkan teknolojisi vb. gibi hücre dışı vezikülleri çıkarmak için kullanılan birçok teknoloji vardır.Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme, kuşkusuz altın bir standart olarak kabul edilmektedir. Gelecekte, MRNA, plazmitler ve diğer küçük moleküllerin taşınması ve hücrelere transfekte edilmesi de dahil olmak üzere hücre dışı veziküllerin vektörler olarak uygulanmasına odaklanacağız.

purification-characterization-extracellular-vesicles-from-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

387 Görüntüleme.  Chinese PLA General Hospital. Araştırmamız, insan adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerden hücre dışı veziküllerin hazırlanması ve saflaştırılmasına odaklanmaktadır. Çözmek istediğimiz sorun, bu sürecin nasıl standartlaştırılacağı ve arıtma verimliliğinin nasıl artırılacağıdır. Şu anda, ultrasantrifüjleme, ultrafiltrasyon, hacim dışlama kromatografisi, polimer çökeltme, immünoaffinite yakalama, mikroakışkan teknolojisi vb. gibi hücre dışı vezikülleri çıkarmak için kul...

Video: Yazar Spotlight: İnsan ADSC'lerinden Hücre Dışı Veziküllerin Ekstraksiyonu ve Saflaştırılmasının Standardizasyonu ve İyileştirilmesi

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research suggests that their regenerative function may be attributed to cell-cell contact and cell paracrine effects. The paracrine effect is an important way for cells to interact and transfer information over short distances, in which extracellular vesicles (EVs) play a functional role as carriers. There is significant potential for ADSC EVs in regenerative medicine. Multiple studies have reported on the effectiveness of these methods. Various methods for extracting and isolating EVs are currently described based on principles such as centrifugation, precipitation, molecular size, affinity, and microfluidics. Ultracentrifugation is regarded as the gold standard for isolating EVs. Nevertheless, a meticulous protocol to highlight precautions during ultracentrifugation is still absent. This study presents the methodology and crucial steps involved in ADSC culture, supernatant collection, and EV ultracentrifugation. However, even though ultracentrifugation is cost-effective and requires no further treatment, there are still some inevitable drawbacks, such as a low recovery rate and EV aggregation.

This protocol describes all procedures, from culturing human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) and collecting supernatant to extracting extracellular vesicles (EVs) using ultracentrifugation.

Tıp

Resuscitation and Culture of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells (ADSCs) for Extracellular Vesicle Extraction

To begin, retrieve two cryopreservation tubes containing frozen human adipose-derived mesenchymal stem cells at passage three from liquid nitrogen. Agitate them in a 37 degree Celsius water bath until fully thawed. Then disinfect the tubes using 75%alcohol.Place the disinfected tubes on an ultra-clean table. Using a pipette, aspirate the cell suspension and transfer it to a 15 milliliter centrifuge tube. Centrifuge the tube in a low speed centrifuge at 250 G and four degrees Celsius for five minutes.Meanwhile, prepare four 10-centimeter culture dishes and add nine milliliters of medium to each dish. Mark the name, cell type, generation, and the experiment date on each dish. Then preheat them in a 37 degree Celsius thermostatic cell incubator.Once the five minute centrifugation is over, disinfect the centrifuge tube before moving it to an ultra-clean table. Using a pipette, remove the supernatant and add four milliliters of medium to achieve the desired cell concentration. Gently agitate the solution until it is evenly dispersed.Next, add one milliliter of cell suspension to each preheated dish and shake it by agitating the same on a level surface in a cross pattern. Observe the cells at 40x magnification under an optical microscope before placing the dishes into the 37 degree Celsius incubator. On day two, observe the cell state under the optical microscope at 40x magnification before proceeding for exchange medium preparation.After disinfection, transfer the culture dishes to an ultra-clean table with Biosafety Level 2. Remove the medium from each culture dish. Rinse the dish gently with two milliliters of PBS solution twice and add 10 milliliters of medium to each dish.Transfer the cells to the incubator until they're ready for supernatant collection.

Hücre Dışı Vezikül Ekstraksiyonu için Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerin (ADSC'ler) Resüsitasyonu ve Kültürü

Extracting Extracellular Vesicles (EVs) from Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell Culture

To begin, collect the supernatant from the human adipose-derived mesenchymal stem cell culture once the cells are 80%confluent. Collect the supernatant carefully using a pipette and transfer it to a 50 milliliter centrifuge tube. Centrifuge the tube at 300 x g for 10 minutes at room temperature to remove suspended cells, then use a pipette to collect the supernatant without disturbing the pellet.Centrifuge the supernatant at 2000 x g for 10 minutes at four degrees Celsius to remove cellular debris. Collect the resultant supernatant with a pipette and filter it through a 0.22 micron membrane to remove large particles and cell debris. Subject the filtrate to ultra centrifugation at 10, 000 x g for 30 minutes at four degrees Celsius.Then perform a final centrifugation at 100, 000 x g for 70 minutes at four degrees Celsius. Using a pipette, remove the supernatant without collecting the pellet. Resuspend the pellet in PBS before centrifuging the tube at 100, 000 x g for 70 minutes at four degrees Celsius.Remove the supernatant and resuspend the obtained pellet of extracellular vesicles, or EVs, in one milliliter of PBS. Finally, transfer the EV suspension to a one milliliter centrifuge tube and store it at four degrees Celsius until further analysis. Transmission electron microscopy clearly revealed the cup-shaped structure of the EVs with a bilayer membrane.Nanoparticle tracking analysis indicated that they have a particle size distribution of around 50 to 150 nanometers. Western blot analysis showed that the characteristic marker proteins of EVs were expressed smoothly.