Mevcut araştırma tarafından desteklenen bir ERC Advanced Grant Araştırmacı (Pa-CSC 233460), hibe sözleşmesi No 256974 (EPC-TM-NET) ve No 602783 (CAM-PAC kapsamında Avrupa Topluluğu&#39;nun Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) ), Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondó de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 &amp; PI12 / 02643) ve Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, İspanya). E. Lonardo Roche Bursu ile desteklenmiştir. M. Cioffi La Caixa predoctoral Bursu Programı tarafından desteklenmiştir.

İnsan PDAC tümörler yazılı bilgilendirilmiş onam (Comunidad de Madrid, İspanya (CP CNIO-CTC-11 ile elde edildi -. CI 11/103-E) immün yetmezliği olan farelere insan pankreas tümörlerinin implantasyonu Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayını gerektirir yanı sıra Kurumsal . Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ksenogref pankreas tümörü fare modellerinin usul kurumsal ve ulusal düzenlemelere uygun olarak yapılmalıdır (; Madrid, İspanya, burada Etik Instituto de Salud Carlos III Komitesi Protokolü PA 34_2012). 1. Kültür Medya <ol><li> Komple Orta hazırlayın. <ol><li> % 10 FBS, 100 ünite / ml penisilin / streptomisin ile RPMI ortamı Supplement. RPMI, 500 ml penisilin / streptomisin (10,000 U / ml, 100X) ısı ile inaktive edilmiş FBS 55 ml 6 mL ekleme için. </li><li> 4 ° C&#39;de komple ortam saklayın. </li></ol></li><li> CSCS Orta hazırlayın. <ol><li> Serumsuz DMEM / F12 Mediu&#39;yu Ek100 birim / ml penisilin / streptomisin ve 2 mM glutamin ile m. </li><li> 4 ° C&#39;de CSC orta saklayın. B27 (01:50) ve 20 ng / ml bFGF, taze her bir deney öncesi ortamına ilave edilir. NOT: B27 eklenmesi tümör küre oluşumunu arttırmak ve küre kültürlerin 32 çeşitli pasajlar sürdürmek için gösterilmiştir. ortam bileşimi çok önemli bir adımdır ve kültür, her hücre tipi için test edilmesi gerekir. Biz test kendini yenileme ve kürelerin farklılaşma kapasitesinin tavsiye ve flow sitometri CSC belirteçlerin ifadesini analiz (yani, CD133 + ve CD44 +). </li></ol></li><li> Ekstrasellüler Flux Assay Orta hazırlayın. <ol><li> Bu özel ortam vitaminler, aminoasitler ve diğer takviyeleri içeren, ancak glutamin, glikoz, pirüvat ve bikarbonat eksik bazal DMEM 5030 olduğunu. </li><li> Mevcut deneyi için, tam bir mitokondrial metabolik aktivite 2 mM glutamin, 8 mM glikoz ve 2 mM sodyum piruvat ile orta tamamlar. Not: Normal ortamı ihtiva eden bikarbonat tahlil sırasında pH varyasyonları tampon çünkü sodyum bikarbonat bulunmaması doğru kültüründe büyüyen hücre dışı asitleşme ölçmek için gereklidir. Buna ek olarak, bir bazal ortamın kullanımı (L-alanil-glutamin gibi) L-glutamin glikoz, ya da farklı deney koşulları ve / veya uygulamalar için gerekli olan sodyum piruvat konsantrasyonunun sıkı bir kontrol sağlar. </li></ol></li></ol> 2. Küre Testi ve Analiz Şekillendirme Not: Bütün doku kültür protokolleri ve manipülasyonlar, temiz, deterjan içermeyen ve steril cam kullanılarak büyük bir dikkat steril teknikler kullanılarak gerçekleştirilmesi gerekir. 37 ° C su banyosunda kullanımı öncesi sıcak tüm orta ve çözüm öncesinde (alternatif olarak, size orta ve çözümleri oda sıcaklığında önceden ısıtılmış kullanabilirsiniz). Daha önce 21 ayrıntılı olarak İnsan PDAC tümörleri edinin. <ol><li> İnsan PDAC gelen CSCS izolasyonu (Şekil1) <ol><li> Steril bir biyo-güvenlik kabini steril 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 ml ihtiva eden bir 60 x 15 mm kültür çanağı insan PDAC doku aktarın. Steril bir neşter ve forseps kullanarak - (5 mm 1) küçük parçalar halinde tümörün kıyma. </li><li> Kültür çanak steril 1X PBS 1 ml ekleyin ve doku tamamen ayrışmış kadar toz haline getirme adımı tekrarlayın, düzenli olarak bu 3-4 mermi gerektirir. Steril bir tüpe (üst 1X PBS ile 5 ml&#39;lik bir nihai hacme kadar) doku süspansiyonu aktarın ve mekanik olarak gentleMACS bir ayrıştırıcı ile homojen hale getirilir. </li><li> Kolajenaz ile homojenize doku 37 ° C&#39;de 60 dakika boyunca (2.5 mg / 1X PBS içinde kolajenaz ml kullanın) ve daha sonra 900 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj inkübe edin. Süpernatant boşaltacaktır ve tam ortam, 10 ml hücre pelletleri tekrar süspansiyon. 900 x g&#39;de 5 dakika boyunca 40 um süzgeç ve santrifüj yoluyla bir hücre süspansiyonu süzün. </li><li> Süpernatant Durusu ve tekrar süspansiyonkırmızı kan hücre parçalama tamponu, 5 ml (amonyum-klorid-potasyum, ACK) ile pelet ve inkübe </li><li> Jelatin kaplı tabak üzerine CSCS orta plaka pelet yeniden süspanse edin ve 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Bu adım hızla plaka takmak fibroblast hücrelerinin çoğu kaldıracaktır. </li><li> Inkübatörden plakasını çıkarın ve dikkatlice hücre süspansiyonu kurtarmak ve hemasitometre kullanarak canlı (tripan mavi-negatif) hücrelerin sayısını ölçmek. Bu amaç için, hafifçe süspansiyonu karıştırmak ve bir Eppendorf tüpüne süspansiyon 20 ul pipetle. Mikrosantrifüj tüpü içinde hücreler tripan mavisi (1 oranında 1) ve iyice karıştırın 20 ul ekle. Pipet hemasitometre üzerine karışımın yaklaşık 10 ul. </li><li> Canlı hücre sayımı için sayım odasının dört köşe kadran içindeki tüm açık hücreleri saymak. Not: Hücrelerin canlılığı ve verim tümör örneklerinin arasında önemli ölçüde değişebilir. PDAC için numuneler canlılığı düzenli betwe aralıkları45-70%, en-3 arasında bir çapı olan bir makroskopik tümör örneğinden doku parçaları - 5 mm, yaklaşık 5x10 6 canlı hücrelere vermelidir. </li></ol></li><li> Küre Oluşumu Testi ve Metformin Tedavisi <ol><li> Hücrelerin gerekli sayısı almak ve 2000 hücre / ml&#39;lik bir hücre konsantrasyonuna hazırlamak için CSCS ortamın uygun hacimde ekleyin. 1s daha uzun süre buz üzerinde hücre süspansiyonu tutmak ve kaplama için önce iyice karışık etmeyin. </li><li> Orta buharlaşmasını en aza indirmek için, nemlendirme için 24 oyuklu plaka ilk ve son satır 1X PBS içinde 500 ul ekle. Tümör küre orta 1 ml (2.000 hücre / ml) içinde oyuk başına 2000 hücre yoğunluğunda, ultra düşük bağlanma hücreleri plakalara hücreleri tohumu. Not: tümör tipleri arasında değişebilir, tümör küre oluşumu deneyleri için kullanılan hücre sayısı. </li><li> Aracın (negatif kontrol) ile ayrılmış her tedaviden 4 kuyu, metformin, örneğin., 3 mM ile en az 4 kuyu tedavi edin. Pl37 ° C&#39;ye ayarlanmış bir inkübatör hücrelerin As ve bir hafta boyunca% 5 CO2 ile hücreleri kaynağı. NOT: Orta tümör küre rahatsız oluşumunu sağlamak için değiştirilmemesi gerektiğini, ancak kültür ortamında stabil değil gibi günlük bazda büyüme faktörleri ile tepesinde olabilir. </li><li> Her gün tedavi bölümlerinin her birine metformin ya da araç, örneğin., 3 mM ekleyin. Daha büyük yapılar (Şekil 2) sayımı için sağlayan otomatik bir hücre sayacı kullanılarak 5 ve / veya 7 gün sonra oluşan tümör küreler sayısını değerlendirmek. Not: sırasıyla, -, - (120 um 80), en az 40 um olan, sadece tümörlü küreler dikkate alınmalıdır ve küçük olarak kategorize edilebilir (40 80 um) ya da büyük. Sonuçlar (örneğin, 2,000 hücre) tohumlanmış hücrelerinin ilk sayısına bölünmesiyle elde edilen tümör kürelerin yüzdesi olarak tasvir edilebilir. </li></ol></li><li> Birinci Nesil Tümör Küreler seri Pasajlanması <ol&gt; <li> Kuluçkalamadan 7 gün sonra, bir 40 mikron hücre süzgeci kullanılarak tümör küreler hasat ve oda sıcaklığında 900 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Tripsin kullanılarak tek hücre tümör kürelerin pelet ayrıştırmaları, ve daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi başka bir 7 gün boyunca (2.2) yeniden elde edilen tek bir hücre süspansiyonu hücreleri genişletme. </li></ol></li></ol> 3. Metabolizma Analizi (ROS üretimi ve Oksijen Tüketimi) <ol><li> ROS üretimi <ol><li> Bu ROS tespiti için bir, uygun fiyatlı, hızlı ve yaygın olarak kullanılan sonda olduğundan bu protokolde, ROS üretimini ölçmek için bir örnek olarak karboksi-DCFDA kullandık. Bununla birlikte, bu deney için kullanılabilecek çeşitli başka problar ve yöntemler bulunmaktadır. </li><li> Zaman ayrılan miktar için 2.2 açıklandığı gibi metformin ile tümör küreler davranın. Tedavinin sonunda, 40 mikron hücre süzgeci kullanılarak hasat tümör küreler, 5 dakika boyunca 900 x g&#39;de santrifüj hücreleri ve tryps 1 ml pelletiniiçinde. 37 ° C&#39;de 20 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Hücreler singularized sonra, 900 xg&#39;de santrifüj ve 2.5 uM karboksi-DCFDA içeren HBSS hücreleri tekrar süspansiyon. Karanlıkta 37 ° C sıcaklıkta 20 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li><li> Karboksi-DCFDA fotoğraf okside yalancı pozitif sonuç veren olabilir gibi akış sitometri analizine önce ışıktan lekeli hücreleri koruyan. Analize kadar buz üzerinde tüpler yerleştirin. Not: (. Ör. 488nm, Em 520 nm) reaktif oksijen ve azot türlerinin çeşitli reaksiyon FL1 tespit edildikten sonra karboksi-DCFDA floresan. </li></ol></li><li> Oksijen Tüketimi Ölçümü <ol><li> Bu protokol için, bir örnek olarak, Denizatı Biosciences&#39;den elde Ekstraselüler Akı Analyzer sistemi kullanacak. Kat, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bir hücre ve doku yapıştırıcı 22.4 ug / ml solüsyonu ile, istenen hücre kültürü plakası. Hücrelerin ekim öncesi 3 kez - su ile 2 kuyu durulayın. </li><li> Tedavi sonunda, hasat tümör küre 4 kullanılarak0 um hücre filtresi, santrifüj, 5 dakika boyunca 900 x g&#39;de hücreleri ve tripsin 1 ml pelletini. 37 ° C&#39;de 20 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> (150 ul son hacim), Sac /, bir 96 yuvalı plaka için 30,000 hücre yoğunluğunda hücre kültürü plakasının hücreleri singularized. 8 mM glikoz ve 2 mM sodyum piruvat içeren oksijen tüketimi deney ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 100 xg ulaşılıncaya kadar kuyuların spin santrifüj kuyunun dibinde hücreleri Santrifüj ve daha sonra fren kapalı olan santrifüj durmasına izin. Plaka yönünü tersine çevirmek ve işlemi tekrarlayın. 30 dakika boyunca CO2 ilavesi olmaksızın 37 ° C inkübatör plaka aktarın. </li><li> Bu arada, deney için kartuşu hazırlayın. Her iyi yüklemek için 4 farklı enjektörler (25 ul / port) vardır: <ol><li> Liman A: metformin. Içinde 3 mM nihai konsantrasyon elde etmek için, 175 olacak nihai hacim olarak 8x çözeltisi (24 mM) hazırlanmasıul bağlantı noktası A&#39;ya enjeksiyonundan sonra </li><li> Liman B: metformin. 3 mM ekleyin ve iyice 6 mM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için, bağlantı noktası B&#39;ye enjeksiyonundan sonra 200 ul olacak nihai hacim olarak 9 x çözeltisi (27 mM) hazırlanması </li><li> Liman C: metformin. 3 mM ekleyin ve iyice 9 mM nihai konsantrasyon elde etmek için, bağlantı noktası C arasında, enjeksiyondan sonra 225 ul olacak nihai hacim olarak 10 kat çözeltisi (30 mM) hazırlanması </li><li> Port D: rotenone 11 uM, kuyu (11x) nihai konsantrasyon olarak 1 mikrona elde etmek. Not: rotenone tamamen herhangi bir kalıntı mitokondriyal aktivitesini inhibe eder. </li></ol></li><li> Kartuşu kalibre ve hücre kültürü plakasını yükleyin. Karıştırma ve ölçüm standart protokolü ile tahlil gerçekleştirin. </li><li> (% 100 olarak ayarlanmış) rotenone elde edilen inhibisyon yüzdesi olarak metformin ile elde edilen toplam mitokondriyal solunumun inhibisyon yüzdesi hesaplanır. </li></ol></li></ol> 4.İmmün Farelerde İnsan Pankreas Kanseri için Xenograftlarında Modeli NOT: Sipariş deneyler 33 için böyle NOD-SCID, SCID-Bej veya NSG olarak dişi atimik çıplak ya da diğer, daha immün sistemi baskılanmış fare modellerinin yeterli sayıda. Deneyden önce tüm cerrahi aletler Otoklav ve onları kullanımdan önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Deri altı tümörleri için biz 8 tümörlerin toplam kanadını başına bir tümörü olan koşul başına 4 fare az kullanılır. <ol><li> Xenograftlarında Nakli <ol><li> İnsan pankreas kanseri doku örneklerinde tümör parçalarını hazırlayın. Petri kabı içine tümör aktarın ve doku tutmak için bir neşter ve forseps kullanarak (~ 8 mm 3, çapı 2 mm) küçük parçalar halinde doku teşrih. Jelatinimsi bir protein karışımı, elde edilen çözelti içine parçaları Dip buz üzerinde tutuldu. </li><li> % 3 isofluorane veya diğer inhalatif veya enjeksiyon anestezikler - 1 kullanarak fareleri anestezisi. NOT: Herhangi bir cerrahi proc başlamadan önceedure, fareler tamamen karın cildi uyararak bilincini kaybetti ya da kıymık forseps bir çift ile tows emin olun. Kuruluğunu önlemek için göz merhemi sürün. </li><li> Anestezi etkisi almıştır kez antiseptik etanol içeren cilt ile farelerin arkasını silin. Buprenorfini (0.05 mg / kg BW) önce post-operatif analjezi sağlamak için ameliyat uygulayınız. </li><li> 0.7 yapmak forseps geri cilt kaldırın - steril mikro makas ile 1.0 cm uzunluğunda bir kesi ve daha sonra açık açık bir hastada elde edilen pankreas kanseri dokusu bir parça sokulduğu küçük bir deri altı cep, (~ 8 mm 3) hazırlanması. </li><li> 2 cilt zımba - 1 ile yara kapatın. 7 gün sonra bunları çıkarın. Kafeslerine fareler dönün ve tekrar tam olarak aktif olana kadar bir ısıtma yastığı veya bir ısıtma lambası altında saklayın. </li><li> Tümör implantasyonu sonrası hunche, tümör büyümesi ve kırışık kürk morbidite kaynaklanan genel işaretler için en az iki haftalık fareler izleyecekd duruş ve hareketsizlik. </li><li> Tümörler, 200 mm3&#39;lük bir ortalama boyuta ulaştığında fareler, ilgili tedaviler için randomize edilmiştir. Ip enjeksiyonları (150 mg / kg BW) ile veya benzer tedavi etkileri ile içme suyu (150 mg / kg BW) ile günlük araç veya metformin yönetme. </li><li> Bir kumpas kullanarak tümör yükünü Monitör ve tümör haftada bir kez hacmi (tümör hacminin ölçümü = genişliği × nefes × 1/2 uzunluk) hesaplayın. </li><li> Tümörler çapı 1 cm ulaşmış ya da yukarıda belirtildiği gibi fareler şiddetli ağrı veya hastalık herhangi bir belirti gösteren başladıktan sonra fareler Kurban. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Whipple, C. A., Young, A. L., Korc, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+KrasG12D-driven+genetic+mouse+model+of+pancreatic+cancer+requires+glypican-1+for+efficient+proliferation+and+angiogenesis.">A KrasG12D-driven genetic mouse model of pancreatic cancer requires glypican-1 for efficient proliferation and angiogenesis.</a> Oncogene. 31 (20), 2535-2544 (2012).</li><li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li><li>Rahib, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projecting+cancer+incidence+and+deaths+to+2030:+the+unexpected+burden+of+thyroid,+liver,+and+pancreas+cancers+in+the+United+States.">Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States.</a> Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).</li><li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 62 (1), 10-29 (2012).</li><li>Burris, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+survival+and+clinical+benefit+with+gemcitabine+as+first-line+therapy+for+patients+with+advanced+pancreas+cancer:+a+randomized+trial.">Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine as first-line therapy for patients with advanced pancreas cancer: a randomized trial.</a> J Clin Oncol. 15 (6), 2403-2413 (1997).</li><li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erlotinib+plus+gemcitabine+compared+with+gemcitabine+alone+in+patients+with+advanced+pancreatic+cancer:+a+phase+III+trial+of+the+National+Cancer+Institute+of+Canada+Clinical+Trials+Group.">Erlotinib plus gemcitabine compared with gemcitabine alone in patients with advanced pancreatic cancer: a phase III trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group.</a> J Clin Oncol. 25 (15), 1960-1966 (2007).</li><li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III+randomized+comparison+of+gemcitabine+versus+gemcitabine+plus+capecitabine+in+patients+with+advanced+pancreatic+cancer.">Phase III randomized comparison of gemcitabine versus gemcitabine plus capecitabine in patients with advanced pancreatic cancer.</a> J Clin Oncol. 27 (33), 5513-5518 (2009).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+in+pancreatic+cancer+with+nab-paclitaxel+plus+gemcitabine.">Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.</a> N Engl J Med. 369 (18), 1691-1703 (2013).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+versus+gemcitabine+for+metastatic+pancreatic+cancer.">FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.</a> N Engl J Med. 364 (19), 1817-1825 (2011).</li><li>Gourgou-Bourgade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+FOLFIRINOX+compared+with+gemcitabine+on+quality+of+life+in+patients+with+metastatic+pancreatic+cancer:+results+from+the+PRODIGE+4/ACCORD+11+randomized+trial.">Impact of FOLFIRINOX compared with gemcitabine on quality of life in patients with metastatic pancreatic cancer: results from the PRODIGE 4/ACCORD 11 randomized trial.</a> J Clin Oncol. 31 (1), 23-29 (2013).</li><li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li><li>Garcia-Silva, S., Frias-Aldeguer, J., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+&amp;+pancreatic+cancer.">Stem cells &amp; pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 13 (2), 110-113 (2013).</li><li>Hermann, P. C., Mueller, M. T., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+stem+cells--insights+and+perspectives.">Pancreatic cancer stem cells--insights and perspectives.</a> Expert Opin Biol Ther. 9 (10), 1271-1278 (2009).</li><li>Hermann, P. C., Huber, S. L., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+cancer+stem+cells:+a+new+target+for+anti-cancer+therapy.">Metastatic cancer stem cells: a new target for anti-cancer therapy.</a> Cell Cycle. 7 (2), 188-193 (2008).</li><li>Hermann, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+cancer+stem+cells+determine+tumor+growth+and+metastatic+activity+in+human+pancreatic+cancer.">Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pancreatic+cancer+stem+cells.">Identification of pancreatic cancer stem cells.</a> Cancer Res. 67 (3), 1030-1037 (2007).</li><li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model.">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li><li>Gallmeier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+ataxia+telangiectasia-+and+Rad3-related+function+abrogates+the+in+vitro+and+in+vivo+tumorigenicity+of+human+colon+cancer+cells+through+depletion+of+the+CD133(+)+tumor-initiating+cell+fraction.">Inhibition of ataxia telangiectasia- and Rad3-related function abrogates the in vitro and in vivo tumorigenicity of human colon cancer cells through depletion of the CD133(+) tumor-initiating cell fraction.</a> Stem Cells. 29 (3), 418-429 (2011).</li><li>Hermann, P. C., Bhaskar, S., Cioffi, M., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+in+solid+tumors.">Cancer stem cells in solid tumors.</a> Semin Cancer Biol. 20 (2), 77-84 (2010).</li><li>Mueller, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+targeted+treatment+to+eliminate+tumorigenic+cancer+stem+cells+in+human+pancreatic+cancer.">Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).</li><li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal/Activin+signaling+drives+self-renewal+and+tumorigenicity+of+pancreatic+cancer+stem+cells+and+provides+a+target+for+combined+drug+therapy.">Nodal/Activin signaling drives self-renewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Met+is+a+marker+of+pancreatic+cancer+stem+cells+and+therapeutic+target.">c-Met is a marker of pancreatic cancer stem cells and therapeutic target.</a> Gastroenterology. 141 (6), 2218-2227 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restricted+cell+population+propagates+glioblastoma+growth+after+chemotherapy.">A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy.</a> Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).</li><li>Schepers, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+reveals+Lgr5++stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas.">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337 (6095), 730-735 (2012).</li><li>Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+mode+of+tumour+growth+by+clonal+analysis.">Defining the mode of tumour growth by clonal analysis.</a> Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).</li><li>Shaw, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+LKB1+mediates+glucose+homeostasis+in+liver+and+therapeutic+effects+of+metformin.">The kinase LKB1 mediates glucose homeostasis in liver and therapeutic effects of metformin.</a> Science. 310 (5754), 1642-1646 (2005).</li><li>Martin-Castillo, B., Vazquez-Martin, A., Oliveras-Ferraros, C., Menendez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+and+cancer:+doses,+mechanisms+and+the+dandelion+and+hormetic+phenomena.">Metformin and cancer: doses, mechanisms and the dandelion and hormetic phenomena.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1057-1064 (2010).</li><li>Honjo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+sensitizes+chemotherapy+by+targeting+cancer+stem+cells+and+the+mTOR+pathway+in+esophageal+cancer.">Metformin sensitizes chemotherapy by targeting cancer stem cells and the mTOR pathway in esophageal cancer.</a> Int J Oncol. 45 (2), 567-574 (2014).</li><li>Wurth, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+selectively+affects+human+glioblastoma+tumor-initiating+cell+viability:+A+role+for+metformin-induced+inhibition+of+Akt.">Metformin selectively affects human glioblastoma tumor-initiating cell viability: A role for metformin-induced inhibition of Akt.</a> Cell Cycle. 12 (1), 145-156 (2013).</li><li>Cufi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin-induced+preferential+killing+of+breast+cancer+initiating+CD44+CD24-/low+cells+is+sufficient+to+overcome+primary+resistance+to+trastuzumab+in+HER2++human+breast+cancer+xenografts.">Metformin-induced preferential killing of breast cancer initiating CD44+CD24-/low cells is sufficient to overcome primary resistance to trastuzumab in HER2+ human breast cancer xenografts.</a> Oncotarget. 3 (4), 395-398 (2012).</li><li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+targets+the+metabolic+achilles+heel+of+human+pancreatic+cancer+stem+cells.">Metformin targets the metabolic achilles heel of human pancreatic cancer stem cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76518 (2013).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+B27+supplement+on+promoting+in+vitro+propagation+of+Her2/neu-transformed+mammary+tumorspheres.">The effect of B27 supplement on promoting in vitro propagation of Her2/neu-transformed mammary tumorspheres.</a> J Biotech Res. 3, 7-11 (2011).</li><li>Ishizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-initiating+cells+are+rare+in+many+human+tumors.">Tumor-initiating cells are rare in many human tumors.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 279-282 (2010).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).</li><li>Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+murine+prostate+stem+cells.">Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (1), 181-186 (2007).</li><li>Seaberg, R. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rodent+neurogenic+regions:+the+ventricular+subependyma+contains+neural+stem+cells,+but+the+dentate+gyrus+contains+restricted+progenitors.">Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells, but the dentate gyrus contains restricted progenitors.</a> J Neurosci. 22 (5), 1784-1793 (2002).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Mol Cancer Ther. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+'side+population'+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct 'side population' of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Miranda-Lorenzo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+autofluorescence:+a+biomarker+for+epithelial+cancer+stem+cells.">Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells.</a> Nat Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir rakip bir ilgi var.

Birçok tümörler için CSC kavramının ortaya çıkışı ve sonraki doğrulama, ilaç geliştirme alanında daha etkin kanser tedavileri geliştirmek ve daha sonra hastalık nüks riskini azaltmak için potansiyeli olan, yeni bir ivme kazanmıştır. Ancak, CSC alan anlayışı CSC Kalkış ve yayılma ve tümör mimarisini şekillendiren ve metastaz teşvik rollerinden açısından elde edilecek bir erken devlet ve daha fazla ihtiyaçları halen. Bu bağlamda, tekrarlanabilir ve anlamlı CSC testlerin kullanılması yanı sıra elde edilen verilerin yorumlanması bilinçli CSC biyoloji anlayışımızı ilerletmek için önemli bir bileşeni temsil eder. Birçok biyolojik açılardan, küre oluşumu son derece değerli bir tahlil olarak ortaya çıkmıştır; yine de kullanıcıların düzgün bir şekilde deney sonuçlarını yorumlamak için kendi sınırlarının farkında olmalıdır. Önemli bir yönü bile küre forma değerlendirilmesi önce dikkateTaze bir hastada elde edilen örneklerde elde edilen sonuçları ortaya kanseri hücre çizgileri elde edilenlerden önemli ölçüde farklı olabilir çünkü tion veriler, incelenmiş numunenin çıkış noktasıdır. Klasik küre oluşum analizleri, ultra-bağlanma plakalar içinde klonal yoğunlukta tohum hücreleri ve epidermal büyüme faktörü mevcudiyetinde (EGF) ve / veya zenginleştirilmiş bazik fibroblast büyüme faktörünün (b-FGF) küre oluşumunu değerlendirmek ama serum içermeyen aracı madde 21 barındırır 34. kültür ortamı bileşimi de dikkate alınması gereken önemli bir konudur. Bizim deneyim biz serum yokluğunda B27, bFGF ve glutamin içeren DMEM / F12 farklılaşmamış koşullarda CSC, büyümek genişletmek ve korumak için optimal ortam olduğunu öğrendim. Biz bu kültür durumuna (orta ve süspansiyon) hücreler (CD133 +, CD44 + ve CD24 + dahil) kanser kök hücre belirteçleri yüksek miktarda ifade ve (CK farklılaşma ilişkili proteinleri ifade etmezler bulundu-20 Ve CK-19). Bu tahliller için temel varsayım biri her bir küre yani, bir küre, bir tek kök hücre genişlemesi sonucu, klonal olmasıdır. Ancak, küreler düşük ekim yoğunluğu 35, hatta sigorta eğilimli dinamik yapılar özünde vardır. Hücreleri Kaplama protokolde önemli bir adımdır ve kesinlikle toplama sorunu aşmak olabilir iyi bir hücrenin / yoğunluğudur. Ancak daha da ileriye dönük kriteri progenitörleri, bu düzenli, düşük intrinsik küre oluşum aktiviteleri için çok düşük bir küre oluşumu ile sonuçlanır ve aynı zamanda seyrelme etkisi nedeniyle sınırlı otokrin uyarılmasına bağlanabilir. Bizim deneyim biz kaplama hücrelerin sadece% 30 küreler oluşturmak mümkün olduğunu gözlemlemiştir. Biz tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için iyi en az 100 hücre / kullanmanızı öneririz. Büyüme CSC diğer kültür yöntemleri m göre, örneğin, bir katı ya da yarı katı 3D kültürleri (dayanmaktadıratrigel, kolajen ya da metilselüloz). Bu yöntemler, hücre hareketliliği ve daha sonra hücre toplanmasını 36 sınırlamak için kullanılmıştır. Ancak, bu matrislerin her birinin kendi sınırlamaları taşımaktadır. Örneğin, matrigel çözünebilir bodrum Engelbreth-Holm-Swan (EHS) izole zar tümördür ve özü birçok dokuda bulunan kompleks hücre dışı tümör ortamını andıran rağmen, genellikle mekanik işler birden fazla veya daha az tanımlanmış büyüme faktörleri içermiyor çok zor özgü düzenleyici elemanları çalışmaları. Dikkate başka nokta küre oluşturan kapasitesini ve kök hücre fonksiyonları değiştirilebilir terimler 34 olmamasıdır. Bazı kök ve projenitör hücreleri, in vivo olarak, kök / progenitör fonksiyonu dahil etmez, in vitro olarak küreler üretmek için bir küre-oluşturucu özelliği 37, başarısızlık sergiledikleri gösterilmiş olmasına rağmen. Örneğin, sessiz kök hücreler sadece tarafından sağlanan dışı ipuçlarına yanıt vermeyebilirBu in vitro kültür koşullarında seçilir. Böylece, in vitro ve tercihen seri Pasajlanması sırasında saflaştırılmış hücre popülasyonlarının, in vivo kendini yenileme kapasitesi, uzun vadeli, kanıtlamak ya da kök hücre fonksiyonunu çürütmek için değerlendirilmelidir. Bu bağlamda, ileriye dönük ve aynı zamanda kök ve progenitör hücrelerin farklı kesimlerinden yaymak için yeteneği küre oluşturan testinin önemli bir yönüdür ve CSC alan için son derece değerlidir, bu testte vermektedir; sürece sınırlamaları elde edilen verilerin yorumlanması için akılda tutulmalıdır gibidir. Küre oluşturan deneyleri yaygın retrospektif in vitro tek hücre düzeyinde kendini yenileme ve farklılaşma kapasiteleri dayalı kök hücreleri tanımlamak için kullanılmıştır. in vivo niş potansiyel kök hücrelerin izole edilmesini ve bunların soyu izin işaretlerinin bulunması saflaştırılmış popülasyonlarının fonksiyonel özellikleri tanımlanmasına izin verir. cküre oluşumu testinin ombination ve FACS katı doku hücreleri izole veya kültürde PDAC belirli alt popülasyonlar zenginleştirmek için başarılı bir stratejidir. Orijinal tümör heterojenitesini yansıtan kendini yenileme, farklılaştırmak ve bir tümör başlatmak: Örneğin, EpCAM, CD24 ve CD44 eşzamanlı ifadesi mümkün CSCS gösteren bir alt tanımlar. Hermann et al. CD133 + hücreleri artar çoğalma kapasitesi sahip ve CSC 15 özellikleri olduğunu gösterdi. Diğer belirteçler CSCS karakterizasyonu için kullanılmıştır: ALDH- 1 (aldehit dehidrojenaz-1) ifadesi, pankreas kanseri 38 derece tümörijenik hücreler ile ilişkilidir; DNA boya Hoechst 33342 dışlamak mümkün hücreler adlı yan nüfus (SP) hücreleri, tümörleri 39 başlatmak için sertifikalı kapasitesine sahiptir. Son zamanlarda, bir alt hücresel otofloresan bölmesi farklı tümör tipleri üzerinde özel bir CSC özellikleri ile insan hücrelerinden farklı bir popülasyonunu karakterize gösterdiBu markerlerin yok seçici CSCS saf bir nüfus karakterize görünse de hücrelerin daha rafine popülasyonları saflaştırmak 40., Belirteçlerin daha karmaşık kombinasyonları FACS için kullanılabilir olması gerekir. Birçok soru hala tümörlerin kökeni, ilerlemesi ve ilaç direnci CSCS kesin rolü hakkında kalır. Örneğin, tek bir CSC bir tümör başlatır ve nasıl tanımlamak için klonal evrim sorusunu çözmek için tek yol, hastalığın farklı evrelerinde hasta örnekleri analiz ve özellikle tedavi sırasında ve sonrasında CSCS numaralarını takip etmek olabilir. Bu sorulara cevap, biz katı tümörlerde CSCS bilgimizin anlamlı ilerleme ve sonuçta tümör ilerlemesi ve nüks önlemek için ilaç tedavilerine gelişebilir.

Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) en agresif solid tümörlerin biridir. Şu anda Batı toplumunda 4. en sık görülen kanser ilişkili ölüm ve (~ dünya çapında yılda 400.000 ölüme) önümüzdeki on yıl içinde 2. en sık nedeni mevcut hastaların tanısı% 90 3 Kasza yükselme zamanı tahmin edilmektedir % 5&#39;ten az bir 5 yıllık sağkalım sahip ilerlemiş hastalığı ile. Bu hayatta kalma oranı hayal kırıklığı giderek yoğun araştırma faaliyetleri 4 rağmen son 50 yıl içinde değişmeden kalmıştır. Cerrahinin potansiyel &#39;iyileştirilebilir&#39; hastalığı olan hastaların kalan% 10,% 80 5 yıl içinde nüks ölecek. Uzun yıllar boyunca ilerlemiş hastalık için standart tedavi gemsitabin monoterapisi olmuştur, ama bu sadece marjinal sağkalım avantajı 5 bahşeder. Ilavesi ile elde edilmiştir kısa vadeli sağkalım Küçük iyileştirmelererlotinib 6 veya kapesitabin 7, ancak sağkalım avantajı medyan genel sağkalım hala ~ 6 ay ile hafta sırayla olduğunu. Son zamanlarda, daha cesaret verici sonuçlar gemsitabin / nab -paclitaxel 8 ve FOLFIRINOX kombinasyonu rejimi 9,10 için ortaya çıkmıştır. Bu tedaviler, sırasıyla mütevazı 2 ve 4 ay medyan sağkalımı, ama son derece zehirli ve uzun vadeli kurtulan hala nadir bir istisna vardır. Tedavi iyileştirme potansiyeli sunuyor olsa da, bu pek çok hasta cevap veya sadece genel sağkalım içinde artan bir gelişme görünmüyor hangi zehirli rejimler vardır. Sonuç olarak, mevcut tedaviler tamamlamak ve roman, büyük olasılıkla modelli tedavi yaklaşımları geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. Tümör Heterojenite Kanser heterojenlik yalnızca farklı evrimsel altklonları withi sınırlı olmadığını giderek daha belirgin hale geliyorn Her tümör 11 değil, aynı zamanda her bir alt klon 12 içinde fenotipik ve fonksiyonel heterojenliği ve plastisite ile tahrik. Sözde kanser kök hücreleri (rulmanları) veya tümör teşvik hücreleri intraclonal heterojenite 13-16 sorumludur. Özellikle, CSCS her kanser alt klon 17 içindeki tüm farklılaşmış yavru doğuran hastalığın kökü temsil ettiğini, biz ve diğerleri tek hücreden aşağı, kesin kanıt sağlamıştır olan kanser hücresi bir alt temsil eder. Daha da önemlisi, bu hücreler metastatik davranışı için gerekli olan ve aynı zamanda da ilk tümör regresyonu (örneğin, NAB -paclitaxel) 15,18-20 indükleyebilen nispeten etkili ilaçlar ile tedavi sonrası hastalık nüks için önemli bir kaynağı temsil eder. Bu CSCS mutlaka iyi niyetli kök hücreleri temsil etmemektedir, ne de birçok durumda doku kök hücrelerinden kaynaklanan unutmayın önemlidir, ancak bunun yerine AKA varKök hücrelerin bazı özelliklerini edinilmiş. Örnek CSCS belirsiz kendini yenileme kapasitesi konvansiyonel kemoterapiye karşı dirençli hale donatılmıştır ve metastatik aktivite teşvik invaziv artmış göstermek için Bunların çoğu işlevsel, tanımlanmıştır. Fonksiyonel Kanser Kök Hücre Fenotipleri CSCS fonksiyonel fenotipi, sırasıyla bir seri küre oluşumu ve koloni oluşumu tahlilleri kullanılarak in vitro olarak test edilebilir kendini yenileme kabiliyetleri dayanmaktadır. Daha da önemlisi, tercih edilen özel bir uzun süreli tümöre neden olması arasında gösterge seri nakli sırasında nihai fonksiyonel bir okuma olarak in vivo tahliller sınırlayıcı seyreltme ile test edilebilir in vivo tümöre neden olarak kendini yenileme ayı yeteneğine CSCS. Ayrıca, CSC bölmesi içinde heterojenite sadece olmadığını metastaz doğuran özel yetenek taşıyan CSCS ayrı bir ICSI&#39;nin ile vardırin vivo tümorijenisite kendi münhasır doğrudan sonucu. Nitekim, metastastitic CSCS, birincil tümörün kaçmasına anoikis hayatta ve sonunda yerini değiştirmek ve ikincil siteler tohum yeteneği kazanır. Bu gelişmiş fonksiyonel özellikler metastazı tahlilleri kullanılarak modifiye işgali testleri ve in vivo olarak kullanılarak, in vitro olarak test edilebilir. Kanser Kök Hücreleri Hedefleme Bir CSC hedefleme stratejisi 21 ile kombine sürece biz ve diğerleri tedavileri hatta stroma hedefleme maddeler ile bir arada, farklılaşmış PDAC hücrelerinin toplu tümör odaklanan inandırıcı kanıtlar sağladı, tümör ilerlemesi ve sonraki sonuç üzerinde önemli bir etkisi yoktur, 22. Böylece, hastalığın ilerlemesi ve tedaviye direnç CSCS kritik fonksiyonları dayanarak, bu hücreler herhangi yeni bir tedavi yaklaşımının 18,20 için önemli bir bileşeni delalet, ama çok daha anlayışa o gerektirirCSCS düzenleyici makine f. CSCS ve daha farklılaşmış yavrularıyla genetik değişiklikler ile ilgili olarak aynı genetik yere durumları taşıyan, ancak CSCS ayrı ve dolayısıyla epigenetik kararlı gen ekspresyonu, pluripotent kök hücreleri ile bu payı modüllerini profilleri sergilemektedirler. Üreten uyarılmış pluripotent kök hücreler (Nanog, Oct3 / 4, Klf4 Sox2) yer alan genlerin çoğu sadece kanser ile bağlantılı değil, ama onların ifadesi çoğunlukla CSCS bölmeye sınırlıdır. Dahası, CSCS hedefleyen genetik araçlarını kullanarak kayıp fonksiyon-deneyleri ile CSCS fonksiyonel önemi artık iyice çeşitli kanser türleri 23-25 ​​için CSC konsepti kurduk. Bu yaklaşımların çoğu fare modellerine dayalı ve böylece kolayca kliniğe devredilemez edilirken, toplu tümör hücreleri ile birlikte CSCS hedef potansiyel klinik alaka için kanıt-of-concept sağlarlar. Vi yılında Kanser Kök Hücreleri incelenmesitro Onların Aşil &#39;Heel tanımak CSCS hedefleme için, yeni ve klinik olarak geçerli olan yollarını belirlemek için, bunların özellikleri düzenli in vitro incelenmiştir ve küre oluşumu yaygın olarak bu bağlamda kullanılır. Başlangıçta kendini yenileme ve farklılaşma kapasitesi de dahil olmak üzere, normal kök hücre biyolojisi, eğitim için geliştirilen bu deney daha sonra in vitro CSCS incelemek için adapte edilmiş ve PDAC 20 izole CSCS araştırmak için kullanılmıştır. Bu yüzden, eğer niyetli pankreas CSCS 21 içeren gösteren primer insan PDAC hücrelerinden oluşan tümör küreler CSCS tüm farklı özelliklerini taşıyan bulmuşlardır. Bu durumda, tümör küre deney in vitro daha etkin tedavileri için ekran için güçlü bir araç temsil eder, ancak sonuçlar ayrıca in vivo deneylerde daha sıkı olarak değerlendirilmesi gerekir. Nitekim, bu in vitro testi ile oluşturulan veriler inci gibi büyük bir dikkatle tedavi edilmelidirE tahlil önemli hata tabi olabilir. Oluşan küreler otomatik sayımı dahil oldukça standart protokoller, tekrarlanabilir ve öngörü veri sağlamak için oluşturulmalıdır. Bu bağlamda, son zamanlarda primer insan PDACs çeşitli bir kümesinden türetilen pankreas CSCS taranması için bu tahlil kullanılmıştır ve bu hücreler, anti-diyabetik bir bileşik, metformin metabolik yeniden programlama karşı oldukça hassas olduğu saptanmıştır. Daha önce, metformin AMP-aktive protein kinaz (AMPK) sinyal ve indirgenmiş protein sentezi ve hücre çoğalması 27 ile sonuçlanan mTOR 26 daha sonra inhibisyon, dolaylı aktivasyonu kanser hücresi genişlemesi inhibe ettiği gösterildi edilmiştir. Kütle, tümör uygulanan bu etkilere ek olarak, ve diğerleri, metformin hedef ve aslında bu meme, yemek borusu kanseri, glioblastoma ve pankreas kanseri 28-31 &lt;gibi katı tümörlerin bir dizi CSCS alt popülasyonu ortadan kaldırmak mümkün olduğunu bulmuşlardır/ Sup&gt;. Böylece, metformin halen karşılanmamış tıbbi ihtiyacı olan birçok kanser için umut verici ve güvenli yeni tedavi stratejisini temsil ediyor. Ayrıca, CSCS zenginleştirmek için bir yol olarak küre oluşumu kullanılarak, pankreas CSCS ilgili metforminin birincil etkileri AMPK aktivasyonunun bağımsız ve daha çok görünüşte alt-grup için öldürücü olduğu, (karmaşık I&#39;in inhibisyonu ile) mütevazı mitokondriyal toksisite dayanıyordu olduğunu gösterdi CSCS sadece. İkincisi biz hücresel düzeyde ilacın toksisite göstergeleri olarak kendi hücresel oksijen tüketimi ve mitokondriyal ROS üretimini değerlendirmek başardık. Daha sonra, bu in vitro veriler, klinik öncesi fare modellerinde doğrulanmıştır ve gerçekten de önemli ölçüde sağkalımı 31 uzamış neden olabilir. Burada sunulan metodoloji CSC metabolizması üzerindeki etkileri üzerine yapılan çalışmalar da dahil olmak üzere CSCS ilaç duyarlılık profilleri, hızlı nesil için izin verir. Şimdi kullanılan com hakkında deneysel ayrıntıları genişletilmiş sağlamaktamamlayıcı görevlerdir in vitro ve in vivo prosedürlerde.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Counting Chamber/Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific Co</td>
			<td>3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement</td>
			<td>Roche Innovatis</td>
			<td>AG CASY Model TTC 45,60,150 &#956;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS Dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Co</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes&#160;</td>
			<td>Miltenyi Co</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Ultra-low Attachment Plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm tissue culture dishes&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL polypropylene conical tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL polypropylene conical tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml sterile tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dishes, 10 cm dishes&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ul Hamilton Syringe&#160;</td>
			<td>Hamilton Syringe Co</td>
			<td>81075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV&#160;</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin solution, 100X&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metformin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D150959-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200 mM, 100X&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mM Sodium Pyruvate solution&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Assay medium&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100965-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution, 0.05%&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement 50x&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium/F12&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2&#39;,7&#39;-DichlorofluoresceinDiacetate)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C-369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% (vol/vol)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>IsoVet, Braun</td>
			<td>571105.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>35620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sterile Cotton tipped applicator</td>
			<td>&#160;Puritan medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF96e Extracellular Flux analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with CO2 input&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splinter forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying pancreatic cancer stem cell characteristics for developing new treatment strategies

Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) tümör başlaması, metastaz ve direnç radyo-kemoterapi ve sürücü gösterilmiştir münhasıran tümörijenik kanser kök hücrelerinin (rulmanları) bir alt kümesini içerir. Burada ankrajdan bağımsız koşullarda tümör küre gibi primer insan pankreas CSCS kültürlenmesi için belirli bir metodoloji tarif eder. Hücreler, bunların daha farklı yavrularıyla hayatta ve tek hücre tohumlama, aşağıdaki başlangıç ​​aşamasında prolifere yok iken CSCS için zenginleştirmek üzere serumsuz yapışmayan koşullarda büyütülür. Bu deney, tümör hücrelerinin bir popülasyon içinde bulunan CSCS yüzdesini tahmin etmek için de kullanılabilir. Oluşan tümör kürelerinin iki (35 ila 250 mikrometre arasında olabilir) boyutu ve sayısı kültürlenmiş kanser hücrelerinin dökme popülasyonları ya da taze hasat edilmiş ve dijeste tümör 1,2 ya barındırmıştır CSC aktivitesi gösterir. Bu tahlili kullanarak, son zamanlarda, metformin seçici pancreat ablates bulunduic CSCS; Daha sonra daha fazla pluripotense ilişkili genler / yüzey markerlerinin azalmış ekspresyonu gösteren ile doğrulanmıştır ve metformin ile muamele edilmiş hücrelerin in vivo tümöre neden olması indirgendi bir bulgudur. Preklinik gelişim için son adım olarak, metformin ile kurulan tümörleri taşıyan farelerin tedavi ve sağkalımı anlamlı uzamış bulundu. PDAC hastalarda metforminin kullanımının test klinik çalışmalar halen devam etmektedir (örneğin, NCT01210911, NCT01167738 ve NCT01488552). Mekanik olarak, biz metformin reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini arttırmak ve mitokondriyal transmembran potansiyeli azaltarak CSCS ölümcül bir enerji krizi indükler bulundu. Tersine,-CSCS metformin tedavisi ile elimine değil, tersine çevrilebilir, hücre siklüs hapsinden geçmiştir değildi. Bu nedenle, bizim çalışmamız potansiyel CSC hedef bileşiklerin belirlenmesi için bir tarama aracı olarak in vitro küre oluşumu potansiyeli için başarılı bir örnek olarak hizmet vermektedirs, ancak bu teknik yanlış keşifler ortadan kaldırmak için in vitro ve in vivo doğrulama de gerektirir.

Metformin seçerek Pankreas CSCS Hedefler Biz ilk CSCS in vitro kendini yenileme kapasitesine metformin tedavisinin fonksiyonel etkilerini inceledik. Bu amaçla, ameliyat sırasında rezeke PDAC dokulardan izole edilen primer insan pankreas kanseri hücreleri kullanılarak küre oluşumu deney gerçekleştirilmiştir. Biz metformin kuvvetle oluşan küreler (Şekil 1A) boyutunu azaldığını gözlemledik. Bu sadece CSCS için zenginleştirilmiş olarak hala alanlarda bulunan hücrelerin büyük bir kısmını temsil eden CSC progeny&#39;lerinden, genişleme inhibe ederek büyük olasılıkla oldu. Nitekim, uzun küreler olacak daha farklılaşmış progenlerinin daha kapsamlı genişleme Pasajlanması olmadan kültür. Bu nedenle önemli ölçüde C kendini yenileme kapasitesi güçlü inhibisyonunu gösteren doza bağımlı bir şekilde meydana gelen, aslında kendi boyutuna bakılmaksızın oluşturulan kürelerin sayısını azaltmak için, metformin bulunduSC&#39;ler (veriler gösterilmemiştir). Biz 3 mM&#39;de bu metformin anlamlı (Şekil 1B) oluşan kürelerin sayısı azaldı bulundu. Daha sıkı CSCS kendini yenileme kapasitesine metforminin uzun vadeli etkilerini incelemek amacıyla, biz sonradan ikincil ve üçüncül küreler haline getirilir birincil küreler pasajlanmağa. Sadece primer küreler metformin ile muamele edilmiş olmasına rağmen, ikinci ve üçüncü geçitlerde küreler oluşumu büyük ölçüde ve giderek metformin gerçekten geri dönüşümsüz CSCS (Şekil 1C) çoğunluğu ortadan kaldırmış karıştığı, indirgenmiştir. Böylece, veri primer pankreatik CSCS kendini yenileme kapasitesine metformin önemli tedavi edici etkiler göstermiştir ve böylece daha fazla mekanik yanı sıra in vivo çalışmalar yapmak için bizi teşvik etti. Metformin Mitokondriyal Oksijen Tüketimi engeller ve ROS Üretim İndükler Metformi yanaN, kısmen kompleks I aktivitesini inhibe ederek mitokondriyal zehir olarak hareket gösterilmiştir, bir sonraki küre türetilmiş hücrelerde hücresel oksijen tüketimi metformin akut etkilerini inceledik. Bu amaçla, iki temsili primer PDAC tümörlerinden türetilmiş hücreler seçilir ve 3 mM metformin (üç enjeksiyon) ve 1 uM rotenone (bir enjeksiyon) sıralı enjeksiyonunun ardından zaman içinde oksijen tüketimi ölçülmüştür. Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi, metformin enjeksiyonu farklı tümörlere arasında önemli farklılık, oksijen tüketiminde de hızlı ve doza bağlı bir azalmaya neden. Tamamen mitokondriyal oksijen tüketimini inhibe edebilen rotenon, I inhibitörü güçlü bir kompleks, enjekte edilerek, metformin işlenmesi üzerine kalıntı mitokondriyal aktivite hesaplanır. Kapasiteli korelasyon mitokondriyal oksijen tüketimi açısından metformin duyarlılık populasyona arasında ortalama bir değiştirmesi olarak tarif ROS üretimini indüklediğiKolayca (Şekil 2B, sağ panel) ölçülebilir metformin tedavisi (Şekil 2B, sol panel), sonra lation. Beklendiği gibi, oksijen tüketimi, inhibisyona en duyarlı olan primer hücreler de metformin tedavisi üzerine ROS üretiminin güçlü bir artış göstermiştir. Bu nedenle, bu metabolik in vitro deneyler, bir sonraki mitokondriyal ROS üretiminin artması ve apoptoz indüksiyonu, sonunda sonuçlanır mitokondriyal fonksiyon bağımlılığını inhibe ederek bu metformin hedefleri CSCS göstermektedir. Metformin kabinleri PDAC ilerlemesinde Vivo Biz nihayet PDAC farklı hastalardan elde edilen doku xenografts kullanılarak in vivo metformin etkilerini inceledi. Bu, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, metformin ile tedavi edilen farelerde, tümör ilerlemesinde önemli bir azalma gözlenmiştir, fakat hiçbir zaman tam tümörler DISAppeared (Şekil 3). Daha sonra, uzun süreli izlem tüm tümörlerin sırasında, sonunda tedavinin erken fazını kalan hücrelerin metformin direncini düşündüren nüks. Bununla birlikte, metformin, tek bir madde olarak uygulandığı zaman bile, önemli ölçüde tüm fareler hayatta kalma genişletilmiş. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig1.jpg" /> Şekil 1. metformin seçici CSCS Hedefleri. (A) metformin kürelerin boyutunu azaltmıştır. Kürelerin Örnek resim 7 gün sonra (sağ panel) için metformin belirtilen dozlarda ile muamele edildikten sonra elde edildi. Bilyeler (n≥6) (sol panel) miktarının, abscissas ekseni içinde belirtilen sayılar, tek tek tümör temsil etmektedir. (B) Apsislerdeki 7 gün (n≥6), belirtilen numaralar için varlığı veya metformin yokluğunda Küre formasyonu kapasitesieksen bireysel tümör temsil etmektedir. (C) primer pankreas kanser hücrelerinin ikincil ve üçüncül alanlarda CSC kendini yenileme kapasitesinin Temsilcisi grafiği. Küreler sadece 7 gün olmak üzere toplam ilk nesil küre oluşumu sırasında tedavi edildi (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52801/52801fig2.jpg" /> Şekil 2. Metformin Tedavisi İnhibe Eder Oksijen Tüketimi ve İndükler ROS üretimi. (A) metformin ilave küre kökenli hücrelerin oksijen tüketimini (OCR) inhibe eder. İki farklı PDAC sekonder küreler metformin ile muamele edildi ve OCR değişiklik hücre dışı akı analizi ile ölçülmüştür. Rotenone enjeksiyonu, toplam mitokondriyal OCR tüketimi için bir kontrol olarak kullanıldı.X-ekseni her kuyuya protein içeriği ile normalize oksijen / saat pmol oksijen tüketim hızını temsil eder. A (b) &#39;PDAC küre metformin ile 8 saat süre ile muamele edildi ve ROS üretimi karboksi-DCFDA kullanılarak akış sitometrisi ile değerlendirildi. Araziler sitometri Sol, temsili akışı. Doğru, üç bağımsız deneyler gelen verilerin özeti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52801/52801fig3.jpg" /> Şekil 3. In Vivo Metformin Stalls PDAC İlerleme. İki farklı PDAC ksenogref dokular immün sistemi baskılanmış farelere implante edildi ve ilk tümör almak doğrulandı sonra tedaviye tahsis edildi. Fareler, metformin (Met) ile muamele içme suyuna ilave edildi (150 mg / kg vücut Weight; günde su tüketimi) 5 ml dayanarak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies at JoVE.com

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

studying-pancreatic-cancer-stem-cell-characteristics-for-developing

Research

JoVE Journal

Medicine

19.4K Görüntüleme.  Spanish National Cancer Research Center. Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Video: Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

Kranial Radyoterapi neden Bilişsel Disfonksiyon Restorasyon Kök Hücre Transplantasyon Stratejileri

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

Tıp

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Sıralama Kök Hücre Tahliller ve Akış Primer Beyin Tümörü Doku İşleme

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

İnsan Nöroendokrin Tümör Terapi Çalışmaları Üç Boyutlu Model İnsan nöroendokrin tümör hücre hatlarında

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Pankreas Kanseri İlerleme Bioluminescent Ortotopik Model

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

İnsan Hücre Lines Kemorezistans Yumurtalık Kanser Kök Hücreleri Zenginleştirme

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Nöroprotektif Stratejileri Tedavi Faktörleri teslimi için tasarlandı Erişkin Kök Hücre Yüksek Verimli Karakterizasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local recurrence and distant metastasis. One hypothesis to explain this recurrence is the presence of cancer stem-like cells (CSCs) that present inherent chemo- and radio-resistance. In order to develop new therapeutic strategies, it is necessary to have experimental models that validate the effectiveness of targeted treatments and therefore to have reliable methods for the identification and isolation of CSCs. To this end, we present a protocol for the isolation of CSCs from human HNSCC cell lines that relies on the combination of two successive cell sortings performed by fluorescence activated cell sorting (FACS). The first one is based on the property of CSCs to overexpress ATP-Binding Cassette (ABC) transporter proteins and thus exclude, among others, vital DNA dyes such as Hoechst 33342. The cells sorted with this method are identified as a &#34;side population&#34; (SP). As the SP cells represent a low percentage (&#60;5%) of parental cells, a growing phase is necessary in order to increase their number before the second cell sorting. The next step allows for the selection of cells that possess two other HNSCC stem cell characteristics i.e. high expression level of the cell surface marker CD44 (CD44high) and the over-expression of aldehyde dehydrogenase (ALDHhigh). Since the use of a single marker has numerous limitations and pitfalls for the isolation of CSCs, the combination of SP, CD44 and ALDH markers will provide a useful tool to isolate CSCs for further analytical and functional assays requiring viable cells. The stem-like characteristics of CSCs was finally validated in vitro by the formation of tumorispheres and the expression of &#946;-catenin.

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Bir Baş-Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu subpopülasyonu olması Kök Hücre Özellikleri İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with radiotherapy. Experimental approaches to understanding mechanisms of salivary gland dysfunction and restoration have focused on in vivo models, which are handicapped by an inability to systematically screen therapeutic candidates and efficiencies in transfection capability to manipulate specific genes. The purpose of this salivary gland organotypic culture protocol is to evaluate maximal time of culture viability and characterize cellular changes following ex vivo radiation treatment. We utilized immunofluorescent staining and confocal microscopy to determine when specific cell populations and markers are present during a 30-day culture period. In addition, cellular markers previously reported in in vivo radiation models are evaluated in cultures that are irradiated ex vivo. Moving forward, this method is an attractive platform for rapid ex vivo assessment of murine and human salivary gland tissue responses to therapeutic agents that improve salivary function.

Using three-dimensional organotypic cultures to visualize morphology and functional markers of salivary glands may provide novel insights into the mechanisms of tissue damage following radiation. Described here is a protocol to section, culture, irradiate, stain, and image 50&#8211;90 &#956;m thick salivary gland sections prior to and following exposure to ionizing radiation.

Submandibular ve parotis tükürük bezlerinden Organotipik kültürlerin radyasyon tedavisi anahtar In vivo özellikleri

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...