Name: analysis of physiologic e-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium
Uploaded: 2009-02-11T00:00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium at JoVE.com

건강 / 미 국립 암연 구소 (NCI) 그랜트 (찰스 J. Dimitroff에 RO1CA118124)의 국립 연구소,,이 프로젝트에 대해 자금은 미국 암 협회의 연구 학술 상, (찰스 J. Dimitroff에 06-024 - 01 - CSM)에 의해 제공되었으며 관절염과 Musculoskeletal 보건 / 국립 연구소 및 피부 질환 부여의 국립 연구소 (박사 토마스 S. Kupper에 P30 AR042689, 브리검 앤드 위민스 병원, 보스톤, MA).

1. 흐름 챔버에 대한 배양 접시에 hBMEC의 준비 (HBMEC - 60 세포) Monolayer <ol><li> 코트 35 37 4 박 20μg/ml의 fibronectin의 2ml (PBS)을 ° C로 3 시간 동안 X 10mm 조직 문화 요리 ° C. </li><li> 요리 fibronectin 솔루션을 기음과 1.5 X10 5 HBMEC - 60 세포를 추가 HEPES 및 글루타민과 함께 [매체 199 10% FBS 10 % 인간 세럼, 5 단위 / ML의 헤파린, 1ng/ml 재조합 인간 fibroblast의 성장 인자, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신] 요리와 그들이&gt; 90 % 합류로 성장할 수 있도록. (이 2 일이 소요) </li><li> 성장 미디어를 기음과, E - selectin 표현을 상향 조절, 4-6 시간에 대한 IL - 1β 50ng/mL 신선한 매체를 추가하십시오. 세포 monolayers 이제 분석을 압연에 대한 준비가되어 있습니다. 안티 - 인간의 E - selectin 모아브 (클론 BBIG - E4 (5D11)가) 37시 ~ 1 시간에 대한 20μg/ml에 추가할 수 있습니다 ° C.를 끄고, E - selectin 기능을 차단하려면 </li></ol> 2. 흐름 챔버에 대한 인간의 조혈 전구 KG1a 전지의 준비 <ol><li> 인간 조혈 전구 KG1a 세포는 글루타민과 함께 RPMI - 1640에 (1x10 6 셀 / ML) confluency로 성장와 10 % FBS / 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신과 흐름 챔버 분석에 사용하기 위해 술병에서 직접 pipetted입니다. </li><li> 휴대폰 번호는 hemacytometer 후 세포가 10mM HEPES (H / H 버퍼)와 2mM CaCl 2 HBSS 1 X 10 6 세포 / ML에서 다시 보류 아르를 사용하여 계산됩니다 </li><li> 세포 분석에 사용할 때까지 얼음에 저장됩니다. </li></ol> 3. 현미경, 병렬 플레이트 흐름 회의소와 주사기 펌프 (그림 1)의 준비 <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_7/1009_figure1.png" alt="그림 1" width="600" height="409" /> 그림 1. 병렬 플레이트 흐름 회의소 분석의 일러스트. 거꾸로 현미경, 하버드 주사기 펌프, 컴퓨터 / 카메라 및 병렬 플레이트 흐름 챔버는 효율적이고 재현성 세포 분석을위한 최적의 배열에 배치됩니다. <ol><li> 주사기 펌프로 거꾸로 현미경과 전원 전원 및 광원의 전원을 켜고 현미경에 10X 목표를 선택합니다. </li><li> 홀더에 50mL 원뿔 튜브를 삽입하고 H / H 및 2mM CaCl 2 입력합니다. </li><li> 50mL 원뿔 튜브 아래의 테스트 튜브 홀더에 넣어 5ml 플라스틱 테스트 튜브 </li><li> (주사기의 플런저과 몸 모두가 모두 확보되어 있는지 예정) 주사기 펌프에 60mL 주사기를 배치합니다. </li><li> 60mL 주사기 끝 3 방향 정류장 - 콕에 5mL 주사기를 연결 중지 - 수탉 3 방법을 첨부합니다. </li><li> 오른쪽에있는 입력 튜브, 뒤로 왼쪽과 진공관 출력 튜브와 함께 현미경 무대 플레이스 병렬 흐름 회의소 장치 (GlycoTech 주식 회사). </li><li> 병렬 플레이트 장치가 무대에 맞게 수 있도록 진공 야외 밸브에 진공 튜브를 연결합니다. (이 테스트 흐름 챔버에서 진공 스커트가 빵빵한 경우.) 공기 밸브를 끄십시오. </li><li> 출력 튜브 라인 (현미경의 가장 왼쪽에) 3 방향 중지 - 물건에 연결합니다. 장치는 현재 HBMEC - 60 monolayer 플레이트에 삽입하기위한 준비가되어 있습니다. </li><li> 현미경의 중심에 자리 HBMEC - 60 monolayer 판과 장소. </li><li> 진공 및 위치 monolayer 판은 중앙에있다 것과 같은 접시 위의 흐름 챔버 장치를 켭니다. </li><li> 부드럽게 HBMEC - 60 monolayer 판에 흐름 챔버 장치를 낮추고 흐름 챔버 장치가 다운 흡입 수 있습니다. (가 이스케이프 공기도 소리이어야하며이 시점에서 당신은 고무 가스켓을 압축 챔버에 압력을 적용해야 할 수도 있습니다.) </li><li> 일단 진공 곳에 입력 튜브 2mM CaCl 2와 H / H를 포함하는 50mL 원뿔 튜브로 (오른쪽)에 설립되었습니다. </li><li> 오픈 3 방향 정류장 - 콕에서 60mL 주사기와 장소 펌프로 흐름을 허용하는 &#39;펌프 모드. &quot; </li><li> 접시에있는 세포를 운반하지 않고 입력 / 출력 라인에서 공기를 제거하려면 액체가 장비에 도달 ML / 분 직전에 다음 신속하게 0.5으로 설정, 흡기 관을 채우기 위해 2mL/minute에서 설정 주사기 펌프를 사용합니다. 이 신중하게 설정하고 접시에서 monolayer 사하여 주실 공기 방울을 방지하기 위해 필수적인 주요 좋습니다. </li><li> 유체가 60ml 주사기, 흐름 챔버와 주사기 펌프로 이동을 볼되면 제일 먼저 처리 해달 흐름 챔버 사용할 준비가되었습니다. 이 설정은 최대 각 셀에 입력 실행 및 필요한 각 새 접시에 대해 반복됩니다. </li></ol> 4. NIS 요소를 사용하여 백혈구 롤링 이벤트 캡처 <ol><li> 바탕 화면에 열려 NIS 요소. </li><li> 보도 라이브 이미지에 대한 아이콘을 &quot;놀이&quot;. 자동 노출은 지금은 접시보다 쉽게​​ 볼 수 있도록하고 초점에 중요합니다. </li><li> 현미경은 세포 monolayer에 제대로 초점을 맞추고 있는지 확인합니다. </li><li> 현미경 1 프레임 / 초 및 조정 불빛에 일단 초점을 맞추고, 다시 설정 노출. 이미지가 컴퓨터에 표시하고 더 이상 낮은 조명 레벨로 인해 현미경 뷰파인더에서 확인할 수 없습니다. 라이트 히스토그램 그러면 광고 수배경 노출을 제거하거나 셀 선명도를 개선하기 justed. </li><li> 동영상 캡쳐에 이상적입니다 그림을 얻기 위해 2X2 빈 또는 라이브 빈 클릭하십시오 </li><li> 메뉴 표시줄에서 &quot;매크로&quot;을 클릭하고 &quot;포트에 쓰기&quot;를 선택, 선택 포트 &quot;com3,&quot;와 &quot;개방&quot;. (이것은 주사기 펌프와 협력하기 위해 포트를 엽니다. </li><li> 다음 피펫 입력 튜브 라인 근처 5ml 테스트 튜브에 KG1a의 세포 현탁액의 1mL 및 테스트 튜브의 맨 아래에 입력 튜브 라인을 넣으십시오. </li><li> 메뉴 표시줄로 이동은 &quot;캡처&quot;를 클릭, &quot;시간 저속 수집.&quot; </li><li> 새 메뉴가 나타납니다. 프로토콜 지속 2백10초을 선택하고,이 HBMEC - 60 세포 압연에 대한 프로그램의 길이입니다. (각 단계는 그림에게 펌프 프로토콜의 기간 동안 매초마다을하는 프로그램입니다. 또한 펌프를 시작합니다 com3 포트를 통해 명령을 보내도록 설정되어 있습니다.) 시간이 경과가 중단되면 펌프가 멈추지 않을거야 자체 및 재설정해야합니다. 이미지를 라이브로 돌아가려면 취소를 누릅니다. </li><li> 사용 설명서에 따라 &quot;프로그램 모드&quot;로 주사기 펌프를 설정합니다. (프로그램 모드가 특정 흐름 속도 (즉, 전단 응력 수준) 챔버 내에 이수하고 HBMEC - 60 세포 monolayer 이상 KG1a 세포 상호 작용을 지시하는 수동으로 프로그래밍 가능합니다.) hBMEC 세포에서 압연 KG1a 세포에 대한 설정했던 것은 같은 4.2 다인즈을 따릅니다 / 45 S에 대한 cm 2, 0.3 다인즈 / 60 s에 대한 cm 2, stepwise 증가 매 15의 4.2 다인즈 / cm 2 최대 </li><li> 챔버 벽의 전단 응력 (W 일)은 다음 등식에 따라 계산 : W ST / ML의 체적 유량입니다 Q μ는 매체의 예상 점도 (0.0076 P)입니다 = 6μQ / 2 B, S는이 cm에서 채널 높이 (가스켓 두께) (0.03 ㎝)이고, B는 cm (0.5 cm)의 채널 폭입니다. 유량은 주사기 펌프의 프로그램 모드를 사용하여 규제되었습니다. </li><li> 현미경과 컴퓨터는 이제 시간 저속도 촬영을 캡처하는 준비가되어 있습니다. 보도 자료를 획득 시작 컴퓨터에서 &quot;실행 시작&quot;. 프로그램을 실행하는 동안 (기포가가 없는지 확인) 매체의 입 / 출력 튜브가 가득 유지하기 위해 KG1a 세포가 들어있는 시험관에 미디어를 추가하십시오. </li></ol> 5. 터미널 Sialylation 및 E - selectin - 중재 KG1a 전지 5 표면 당단백질의 의존성. (; 5.1-5.5의 비디오 클립 그림 2) 롤링 <ol><li> 에 압연 KG1a 세포의 시금 비 자극 HBMEC - 60 세포. (대조군) KG1a 세포가 준비 이상 흐름 챔버에 주입되었다 라이브가 아닌 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 위에서 설명한. </li><li> HBMEC - 60 세포를 IL - 1β와 사전 처리의 롤링 KG1a 세포의 시금. (E - selectin - 의존도 제어) KG1a 세포가 이상 흐름 챔버로 준비하고 주입되었다 라이브 IL - 1β 자극 위에서 설명한 HBMEC - 60. </li><li> IL - 1β 그리고 중화 방지 인간 E - selectin 모압. (E - selectin - 의존도 제어) KG1a 세포가 라이브를 통해 흐름 챔버로 준비하고 주입되었다 IL - 사전 처리 HBMEC - 60 세포에서 압연 KG1a 세포의 시금 위에서 설명한 안티 - 인간의 E - selectin 모압을 무효화와 1β 자극 HBMEC - 60 pretreated. </li><li> IL - 1β 자극 HBMEC - 60의 롤링 sialidase - 소화 KG1a 세포의 시금. 37 1 시간에 대한 neuraminidase 0.1U/ml 장염 Cholerae ° C와 pretreated KG1a 세포가 이상 흐름 챔버로 준비하고 주입했다 IL - 1β 라이브 자극 위에서 설명한 HBMEC - 60. </li><li> IL - 1β 자극 HBMEC - 60의 롤링 프로 테아제 - 소화 KG1a 세포의 시금. 단백 분해 효소와 pretreated KG1a 세포는, 37에서 1 시간에 대한 0.2U/ml의 브로 멜 라인 ° C가 넘는 흐름 챔버로 준비하고 주입했다 IL - 1β 라이브 자극 위에서 설명한 HBMEC - 60. </li></ol> 6. NIS - 요소 - 캡처된 KG1a 세포의 KG1a 셀 및 그래프 롤링 데이터의 분석 <ol><li> 시간 순서가 취득 후 데이터를 저장합니다. </li><li> 메뉴 표시줄에서 &quot;측정&quot;탭으로 이동을 선택하십시오 &quot;임계값을 정의합니다.&quot; 원하는 세포가 붉은 색 있도록 막대를 이동합니다. &quot;모든 이미지&quot;다음 &quot;자&quot;를 선택하십시오. 전체 시간 경과 순서는 현재 보이는 붉은 구름 전지 수정해야합니다. </li><li> &quot;측정&quot;을 선택 이동 &quot;제한.&quot; (제한 사항은 사용자가 압연 세포를 대변하지 않습니다 thresholded 개체를 제외하실 수 있습니다. 이것은 주로 HBMEC - 60 monolayer 만든 배경입니다.) &quot;지역&quot;과 압연 세포에 대한 지역에 대한 입력 분 및 최대 값을 선택합니다. &quot;신장&quot;과이 단계를 반복합니다 &quot;순환성합니다.&quot; </li><li> &quot;측정&quot;을 선택하고 &quot;제한을 사용하여 바이너리를 생성&quot;을 선택하고, HBMEC - 60 세포 monolayer에 압연 세포의 NIS - 요소 소프트웨어 인식을 최적화하기 위해 제한 값을 설정합니다. </li><li> &quot;측정&quot;, &quot;필드 데이터&quot;를 선택한 다음 &quot;초기화 데이터&quot;를 선택으로 돌아갑니다. 이 메뉴를 닫습니다. </li><li> &quot;측정&quot;과 SE (으)로 돌아가기&quot;스캔 필드를&quot;lect. </li><li> 열기 &quot;법안&quot;은, &quot;필드 데이터&quot;, &quot;숫자 또는 개체&quot;를 선택하고 &quot;모든 필드&quot;를 선택하고 Microsoft Excel로 데이터를 내보낼 수 있습니다. </li><li> 다음 데이터 수집을위한 NIS - 요소 세포 인수를 준비하는 &quot;명확한 데이터&quot;를 선택하십시오. </li></ol> 결과 : <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_8/1009_figure3.png" alt="그림 3" width="600" height="382" /> 그림 3. KG1a 셀에서 E - selectin 바인딩 활동 병렬 플레이트 흐름 회의소 분석. sialidase이나 단백 분해 효소로 처리 KG1a 세포는 HBMEC - 60 세포를 IL - 1β와 사전 처리의 monolayers에 대한 효율성을 압연에 대해 분석했다. 실험 롤링 대조군도 아닌 IL - 1β 자극 HBMEC -60 세포 또는 압연 KG1a 세포 분석을 실시했다 IL - 1β 자극 반 인간 E - selectin 모아브 (5D11)을 중화 취급 HBMEC - 60 세포. 세포 회전 주파수는 세중의에서 수행하고 NIS - 요소 소프트웨어로 분석했다. (* 통계 의미, P는 &lt;0.001) physiologic 전단 응력 조건 하에서 내피 세포의 상호 작용 -이 비디오 기반의 보고서에서, 우리는 백혈구를 분석하는 방법에 대한 시각적 묘사를 제공했습니다. 백혈구 tethering을 중재하고, 같은 integrins 및 hyaluronan 수용체와 같은 수용체를 통해 중등 더 안정적인 구속력이 활동의​​ 노력에 필요한 접착제 행동을 압연에서 E - selectin 리간드 - 특히, 우리는 E - selectin의 역할을 분석. 거꾸로 현미경, 하버드 주사기 펌프, 비디오 카메라와 컴퓨터 / 셀 수집 하드웨어와 함께 사용하기위한 적응 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용하여, 우리는 실험 E - selectin 리간드 궁극적으로 실시 + KG1a 세포는 우리의 백혈구 모델과 hBMEC 세포로 사용되었다 (HBMEC - 프로 염증성 시토킨, IL - 1β로 자극 60), 우리 E - selectin + 인간 내피 세포 모델 (1-6)로 사용되었습니다. 이전에보고, 우리는에서 압연 강력한 KG1a 세포를 관찰 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 E - selectin에 의존 방식으로 (그림 3) (KG1a 세포가 압연에 비해 통계적으로 중요한 차이 전단 응력 수준의 범위에서 셀 비 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 세포). 비 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 세포에서 또는 압연 KG1a 세포로 구성되어 부정적인 컨트롤, IL - 1β 자극 반 인간 E - selectin mAb와 HBEMC - 60 세포 pretreated, 의존을 설명하기 위해 병렬로 진행되었다 롤링 활동 시토킨 자극과 E - selectin 표현 (그림 3). 비브리오 cholerae와 pretreated KG1a 세포뿐만 아니라, 압연 분석 neuraminidase (sialidase) 또는 브로 멜 라인, 표면 E - selectin 당단백질의 리간드를 소화 알려져 아닌 특정 프로 테아제와가 E - selectin 리간드에 대한 터미널 sialic 산성 잔류물 및 표면 당단백질의 중요성을 강조 활동 (2,3).

<ol>
	<li>Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukocytic+migration+to+inflamed+skin+with+a+novel+fluorosugar+modifier+of+cutaneous+lymphocyte-associated+antigen.">Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen.</a> J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 .</li><li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leukocyte+E-selectin+ligands,+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+and+E-selectin+ligand-1,+on+human+metastatic+prostate+tumor+cells.">Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells.</a> Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).</li><li>Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ameliorating+Skin-Homing+Receptors+on+Malignant+T+cells+with+a+Fluorosugar+Analog+of+N-acetylglucosamine:+P-selectin+Ligand+is+a+More+Sensitive+Target+than+E-selectin+Ligand.">Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand.</a> J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).</li><li>Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-homing+receptors+on+effector+leukocytes+are+differentially+sensitive+to+glyco-metabolic+antagonism+in+allergic+contact+dermatitis.">Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis.</a> J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).</li><li>Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+human+bone+marrow+endothelial+cells:+characterisation+of+new+cell+lines.">Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines.</a> Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).</li></ol>

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병렬 플레이트 흐름 챔버 분석 백혈구를 공부에 사용되는 시험 관내 분석 시스템의 전문입니다 - 유사한 전단 응력 조건 하에서 내피 접착 상호 작용 후 모세관 venule의 표면에 이수 사람. 백혈구 tethering을 중재하고 활성화 microvascular의 내피의 표면에 압연에서 E - selectin 리간드 - 여기로 우리의 시각적인 표현에 묘사된, 우리는 E - selectin의 역할을 조사하는이 시스템의 가치를 보여줍니다. 우리는 또한 프로 테아제, glycosidase이 시스템에서 E - selectin과 리간드의 역할을 elucidating에 대한 차단 항체 치료의 응용 프로그램을 공개. 이러한 분석은 매우 재현성 있으며, E - selectin 연구를위한 실험적인 근거 형태 도움말 - 생체내에서 E - selectin 리간드 기능을. 시토킨 - 활성 microvascular 내피 세포 (hBMEC 또는 인간 제대 정맥이나 피부 microvascular 내피 세포)의 monolayers와 세포 부착을 공부 이외에 assays은 기판으로 재조합 E - selectin 인간 또는 E - selectin - IG 키메라 분자를 정화 사용하여 수행할 수 세포 접착하십시오. 기타 접착제 상호 작용은 백혈구 (P) (L -) - selectin 및 혈소판 - selectin은 또한 병렬 플레이트 흐름 챔버 기술을 사용하여 assayed 수 있습니다 통해 중재. 세포 monolayer / 단백질 기판의 종류를 변화하거나 입력 백혈구 / selectin - transfectant 세포 모델의 조사는 physiologic 전단 응력 조건 하에서 이러한 상호 작용의 역할을 공부할 수 있습니다.

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F6178-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5 M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15575-038</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parallel-Plate Flow Chamber Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GlycoTech</td>
<td>31-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PHD2000 Programmable Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PHD 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35x10mm Tissue Culture Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD FALCON</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fibronectin , from human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>86088-83-7 F2006-2MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Interleukin-1_, Human; Recombinant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>I9401-5UG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS (Hank s Buffered Saline Solution)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medium 199 w/ HEPES & Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12320-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Innovative Research, Inc.</td>
<td>IPLA-SER1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abraxis Pharmaceutical Products</td>
<td>504011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant human fibroblast growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>233-FB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Test tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&D Systems	</td>
<td>BBA16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromelain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>B-4882</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
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analysis of physiologic e-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium

E - selectin은 피부, 뼈 및 염증 조직에 leukocytes 순환 모집을 시작하는 데 도움이 microvascular 내피 세포에 종류 - 1 막 단백질이다. E - selectin의 표현이 피부와 뼈가 microvessels에 제정되고 같은 염증 조직에서 IL - 1α 및 / TNF - α, microvessels 등 프로 염증 크린 시토킨에 의해 inducible 있습니다. 이 렉틴과 수용체는 mediates 특성 회전 동작의 결과를 순환 leukocytes에 탄수화물 카운터 - 수용체의 리간드와 상호 작용을 약한 구속력. 이러한 상호 작용은보다 안정 접착제 이벤트 및 diapedesis 활동, 백혈구 압연 활동의 특성화 및 백혈구 E - selectin의 리간드의 신분을 앞에 있기 때문에 백혈구 인신 매매 및 염증의 연구 및 안티 - 염증성 치료제의 개발 (1-5)의 주요 목표를했습니다 . 이 보고서의 목적은 physiologic 혈액 흐름 조건 E - selectin E - selectin의 리간드 상호 작용을 연구에 가장 널리 사용되는 기술의 시각, 포괄적인 설명을 제공하는 것입니다. 하버드 피부 질환 연구 센터와 함께 우리 연구실은 디지털 시각화하고 새 레코딩 소프트웨어, NIS - 요소와 함께 최첨단가 병렬 플레이트 흐름 챔버 장치를 사용합니다. 이 기술은 우리가 화면의 시각화뿐만 아니라 비디오 형식으로 기록 롤링 활동을 실시간으로 접착 이벤트를 분석할 수 있습니다. 같은 주파수, 전단 저항을 압연 및 바인딩 / 효율성을 tethering 같은 세포 접착 매개 변수, Excel 스프레드 시트에 수출 및 통계 분석의 대상, NIS - 요소 소프트웨어로 계산됩니다. 데모 여기에 제시, 우리는 살고 인간 골수 내피 세포 (hBMEC)에서 E - selectin에 의존 백혈구 압연 활동을 조사하기 위해 병렬 플레이트 흐름 챔버를 채용. 불후의 hBMEC 세포 라인, HBMEC - 60 세포, 우리의 내피 세포 모델 (6)로 사용하는 동안 E - selectin 리간드의 높은 수준을 표현하는 인간의 조혈 전구 KG1a 세포는, 우리 백혈구 모델로 사용되었습니다. 유도 및 시뮬레이션 네이티브 E - selectin 표현 흐름 챔버에서 HBMEC - 60 세포를 처음 IL - 1이 활성화되었습니다.하려면 우리의 비디오 프레 젠 테이션은 병렬 플레이트 흐름 분석 프로 테아제 또는 glycosidase을 구현하여 ascertained 수있는 흐름 챔버에 physiologic E - selectin - 중재 백혈구 압연 활동 및 백혈구 E - selectin 리간드 (S)의 기능 특성을 공부에 적합한 방법입니다했다 digestions.

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Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

이 보고서는 physiologic 전단 응력 하에서 백혈구 내피 상호 작용을 공부를위한 병렬 플레이트 흐름 챔버 분석의 시각적 묘사를 제공합니다. 이 방법은 트리거 백혈구가 내피 세포 표면에 롤링되는 내피 (E) - selectin과 E - selectin 백혈구 리간드의 역할을 조사에 특히 유용합니다.

Microvascular 내피에 Physiologic E - Selectin - 중재 백혈구의 롤링 분석

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