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Overview
1:22
Principles of HPLC
5:05
Preparation of the Mobile Phase
6:08
Preparation of Component and Standard Solutions
7:25
HPLC Setup
9:25
Diet Soda Samples
10:16
Results
11:27
Applications
12:44
Summary
高速液体クロマトグラフィー (HPLC)
ソース: 博士ポール亭 - パデュー大学
高速液体クロマトグラフィー (HPLC) は、液体試料のコンポーネントを定量化する一般的に使用される重要な分析法です。この手法でソリューション (最初の段階) 多孔質微粒子のパッキングには表面にバインドされている 2 番目のフェーズが含まれている列をポンプでくまれます。2 つのフェーズにおける試料成分の異なる溶解性により、従ってこれらのコンポーネントの分離を作成する別の平均速度で列を移動するコンポーネントです。一方の列の段階は固定相と呼ばれる移動相ポンプのソリューションと呼びます。
静止したおよび/またはモバイル相採用の種類に応じて、液体クロマトグラフィーのいくつかのモードがあります。この実験は、逆相クロマトグラフィー固定相は非極性、移動相は極性を使用しています。採用する固定相は、3 μ m のシリカ粒子に結合して移動相はその溶出強度を変化させる追加極性有機修飾子 (アセトニ トリル) で緩衝水溶液 C18 炭化水素グループです。このフォームのシリカは、水溶性、アプリケーションの広い範囲を提供するサンプルに使えます。この実験ではダイエット飲料 (すなわちカフェイン、安息香酸、アスパルテーム) で頻繁に見られる 3 つの要素の混合物が分かれています。3 種の知られていた量を含む 7 つの準備ができてソリューションを使用し、彼らのクロマト グラムに記録されます。
高速液体クロマトグラフィーの実験では、高圧ポンプはインジェクターを介してリザーバから移動相を取る。それは成分の分離用逆相 C18 充填カラムを通過します。最後に、移動相は、220 nm で廃液ボトル終了吸光度が測定される検出器セルに移動します。インジェクターのポートから検出器まで移動するコンポーネントにかかる時間の量は、保存期間と呼ばれます。
液体クロマト グラフは、逆相カラムで分離を実行する、この実験で使用されます。柱寸法が 3 mm (内径) × 100 ミリメートルとシリカ C18 オクタデシルシラン (ODS) 修飾とはパッキング (3 μ m 粒子サイズ)。Rheodyne 6 ポート ロータリー射出バルブ最初の小さなループのサンプルを格納するため、バルブの回転によって移動相にサンプルを紹介します。
220 の波長吸収分光法による検出は nm。254 でこの実験を実行できる nm、検出器が変数でない場合。検出器からのデータは計測したデジタルマルチメータ (DMM) を使用して、アナログ電圧出力を持って、データ集録プログラム搭載コンピューターで読み取る。結果として得られるクロマト グラムは、サンプルのすべてのコンポーネントのピークを持っています。この実験では、すべての 3 つのコンポーネントは、5 分以内溶出します。
この実験は、単一移動相とのイソクラティック移動相と呼ばれるポンプを使用します。分離しにくいサンプルの場合は、グラデーションの移動相が使用できます。これは、初期の移動相は主に水性のものと、時間をかけて第二有機溶媒を徐々 に追加して全体的な移動相に。このメソッドは、コンポーネントの保持時間を削減し、ガスのクロマト グラフの温度勾配と同様に動作時間をかけてこの相の極性を発生させます。周囲温度の変動に伴う時エラー離れて任意の保持かかるどこ列は (通常は 40 ° C に加熱すると、いくつかのインスタンスがあります。
逆相 HPLC の充填カラム固定相は通常 C4、C8、または C18 パッキングします。C4 列は、C18 カラムは、ペプチドや低分子量の基本的なサンプルに対し大きな分子量の蛋白質のために主にです。
吸収分光法による検出は、成分の吸収スペクトルはすべて容易に利用できる、任意の検出方法では圧倒的に。いくつかのシステムの検出方法として電気化学的測定、電気伝導度や電流などを使用します。
この実験では、移動相は主に 20% アセトニ トリルと 80% (DI) 純水を精製しました。少量の酢酸は、微量の状態で静止した梱包段階で、シラノールを保つ移動相の pH を下げるに追加されます。これはテーリング、狭いピークを与えることから吸着ピークを低減します。その後、pH を上げるし、部品の保持時間を減らすを助けるのために 40% 水酸化ナトリウムで pH を調整します。
各グループは、濃度の異なる標準液 (表 1) を含む 7 バイアルのセットを使用します。各ピークを識別する最初の 3 の使用し、最後の 4 はコンポーネントごとに校正グラフを作成します。基準 1-3 は、校正チャートにも使用されます。
| 番号 | カフェイン (mL) | 安息香酸 (mL) | アスパルテーム (mL) |
| 1 | 4 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 4 | 0 |
| 3 | 0 | 0 | 4 |
| 4 | 1 | 1 | 1 |
| 5 | 2 | 2 | 2 |
| 6 | 3 | 3 | 3 |
| 7 | 5 | 5 | 5 |
表 1。在庫基準 (各標準の容量は 50 mL) 7、作業基準を準備するために使用のボリューム。
1. 移動相を作る
- 400 mL のアセトニ トリルを精製・ ディ ・水約 1.5 L に追加することによって移動相を準備します。
- 慎重に 2.4 mL の氷酢酸をこのソリューションに追加します。
- ・ ディ ・純水でメスフラスコに 2.0 L の総ボリュームへの解決策を希釈します。得られた溶液 pH 3.2 2.8 間が必要です。
- 水酸化ナトリウム 40% は、校正済みのデジタル pH メーターの使用と drop-wise を追加することで 4.2 に pH を調整します。非常にゆっくりと pH が 4.0 になったらを追加します。これは達成するために約 50 滴を取る必要があります。
- ドガのソリューションや、クロマト グラフ柱を差し込むことができる固体を削除する真空下で 0.47 μ m ナイロン 66 膜フィルターを介して移動相をフィルターします。可能性があります、列の入口で静止した段階のボイドが発生または紫外線吸光度と不安定性を引き起こして検出器セルにその方法を動作バブルを避けるために移動相をガス抜きが重要です。
2. コンポーネント ソリューションの作成
行わなければならない 3 つのコンポーネントは、カフェイン (0.8 mg/mL)、(1.4 mg/mL)、安息香酸カリウム、アスパルテーム (L-アスパルチル-L-フェニルアラニン メチルエステル) (6.0 mg/mL)。これらの濃度は、かつて同じ方法で希釈ソーダ サンプルで発見したレベルで基準を置きます。
- カフェインの 0.40 g を 500 mL のメスフラスコに追加し、DI 水で 500 mL のマークに希釈します。
- 安息香酸の 0.70 g を 500 mL のメスフラスコに追加し、DI 水で 500 mL のマークに希釈します。
- アスパルテームの 0.60 g を 100 mL のメスフラスコに追加し、DI 水で 100 mL のマークに希釈します。貯蔵中の分解を避けるために冷蔵庫にこのソリューションを配置します。
3. 7 標準溶液を作る
すべての 3 つのコンポーネントがある異なる分配係数、どのフェーズの両方との相互作用に影響を与える。分配係数が大きいほど長期間の保存で静止した段階のコンポーネントを費やしている多くの時間回検出器に到達。
- 次の表 1、ピペット 50 mL のメスフラスコに各コンポーネントの適切な量のグラフ。
- 各移動相の容積測定フラスコ 50 mL マークに原液を希釈します。
- サンプル ラックのラベル付きの小さな瓶に各標準溶液を注ぐ。
- 冷蔵庫、50 mL のメスフラスコに残りのソリューションと一緒にサンプルのラックに格納します。
4. 高速液体クロマトグラフィー システムの初期設定をチェックします。
- 廃棄ライン廃棄物コンテナー内にある、移動相にはリサイクルではなくを確認します。
- 移動相の流量を 0.5 mL/min に設定されていることを確認します。これは、すべてのピーク 5 分以内に溶出し、素敵な解像度を許可するのに十分遅いのに十分な高さです。
- 最小値と最大圧力と流量が溶剤配信システム (ポンプ) のフロント パネルに適切な値に設定されているを確認します。
- 最小圧力設定: 250 psi (これはリークが発生した場合、ポンプを遮断するです)。
- 最大圧力設定: 4,000 の psi (これは詰まりが形成された場合、破壊からポンプを保護するためには)。
- 検出器のフロント パネルの「ゼロ」を押します空白 (空白は純粋な移動相) を設定するために。
- 分析するとそのソリューションと注射器を埋める作業標準の 1 つの複数のボリュームとし、純水で 100 μ L のシリンジをすすいでください。関心の各成分のピークを識別することができます 3 単一コンポーネント サンプルを開始します。
5. 手動で注入サンプルとデータ収集
- インジェクター ハンドル荷重位置で、ゆっくりと中隔ポートを介してソリューションの 100 μ L を注入します。
- 300 のデータを収集するデータ収集プログラムが設定されていることを確認すべての 3 のピーク検出器から溶出するに十分な時間を可能にする s。
- トライアルを開始する準備ができたら、(移動相にサンプルを注入する) 挿入位置にインジェクター ハンドルを回転させるし、すぐにコンピューター データ収集プログラムに「試験開始」をクリックして。3 つの連続したピークの 1-3、1 つだけ基準 (図 1) の実行中に画面に表示されます。
- 一度 300 s が渡される、データ収集は、データ ファイルを保存するためのプロンプトを送信します。適切なファイルの名前 (例えばSTD #1) でデータを保存します。
- そのコンポーネントを識別するに使用されている個々 の試験のピークを秒単位で時間に注意してください。
- 鼻中隔からシリンジを外し、最初の実行から決定されたクロマト グラムあたりの同じ時間を使用して、残りの作業標準のごとにプロセスを繰り返します。
図 1。3 つの部品のクロマト グラム。左から右へ, 彼らが安息香酸、アスパルテーム、カフェインです。
6. ダイエット ソーダのサンプル
ダイエットコーク、ダイエットペプシ、コカコーラゼロは「未知数」彼ら残されている、中性化を取り除くために一晩に開いた容器に泡が HPLC システムに適していません。これは、サンプルの任意のガスの十分に取り除きます。
- プラスチック注射器にダイエット ソーダの約 2 mL を描画します。
- 場所にそれをねじることによってフィルター チップを経由ルアーロック注射器に接続します。
- フィルターを通して、小さなガラスの瓶に注射器で液体をプッシュします。これは分離カラムを詰まらせることができる可能性のある不要な粒子を取り除きます。
- 50% の高純度で、DI 水の同量の各サンプルを希釈します。
- サンプル ループに 100 μ L のサンプルを注入し、基準については同じパラメーターで試験を実行します。
7. 計算
- コンポーネント ソリューションの濃度、7 のサンプルのために作られた希釈に基づいて、標準のコンポーネントのすべての濃度を算出します。
- ピーク高さ ½ 高さ (図 2) の幅に等しい三角形法による各標準および未知の試料のクロマト グラムのピーク面積を決定します。彼らのそれぞれのピークを表示する各コンポーネントにかかる時間に基づいて各コンポーネントに対応するピークが決まったら、コンピューターのスプレッドシートにこれらのピークの面積を入力します。
- すべての 3 つのコンポーネントの基準の濃度 (mg/L) とピーク面積の検量線を作成します。
- 各校正曲線の最小二乗法フィットを決定します。
- サンプルのための高速液体クロマトグラフィー試験から示されるピーク面積からダイエット炭酸飲料の各コンポーネントの濃度を計算します。ダイエット ソーダは HPLC システムに注入する前に 2 倍に希釈したことに注意してください。
- ダイエット炭酸飲料の各コンポーネントの量を mg/L を計算します。
- 結果を基に、ソーダの 12 オンスの缶は、各コンポーネントのミリグラムを計算します。12 オンス = 354.9 mL を想定してください。
図 2。曲線のピーク高さと幅、乗算するが、基本的な例 (ピーク高さ × 幅 ½)。
HPLC クロマト グラムが標準 (図 3) の較正曲線に基づいてすべてのサンプルの 3 つのコンポーネントのそれぞれを定量化することができます。
この実験セットからこれらのダイエット ソーダの 12 オンス缶に各コンポーネントの次に掲げる金額が含まれていることが確認されました。
ダイエット コーラ: 50.5 mg カフェイン。217.6 mg のアスパルテーム。83.6 mg 安息香酸。
コーラ 0: 43.1 mg カフェイン。124.9 mg のアスパルテーム。85.3 mg 安息香酸。
ダイエット ・ ペプシ: 34.1 mg カフェイン。184.7 mg のアスパルテーム。79.5 mg 安息香酸。
当然、すべて 3 いた約同量の安息香酸、防腐剤だけだと。コーラ製品がもう少しカフェインとコーラ ゼロを持っていた他の 2 つの炭酸飲料よりもはるかに少ないアスパルテームいくつか調味料のクエン酸も含まれています。
次の数字は、カフェインや 12 オンス缶 (カフェイン含有量は、コカ ・ コーラとペプシのウェブサイトから取得されました 3 ダイエット炭酸飲料中のアスパルテームの実績。アスパルテーム コンテンツから得られた LiveStrong.com そして DiabetesSelfManagement.com.)。
ダイエット コーラ: 46 mg カフェイン。187.5 mg のアスパルテーム
コーラ 0: 34 mg カフェイン。87.0 mg のアスパルテーム
ダイエット ・ ペプシ: 35 mg のカフェイン。177.0 mg のアスパルテーム
計算例 (表 2)。
STD #1 中のカフェインの濃度: カフェインのコンポーネント ソリューションいた 500 mL = 0.500 L → 0.800 グラム/L = 0.800 mg/mL に希釈してカフェインの 0.400 g。
STD #1 人 50.0 mL に希釈してこの溶液 1 mL
0.800 mg/mL * (1.0 mL/50.0 mL) = 0.016 mg/mL = 16.0 mg/l.
STD #2 いた 50.0 mL に希釈してこの溶液 2 mL
0.800 mg/mL * (2.0 mL/50.0 mL) = 0.032 mg/mL = 32.0 mg/l.
3 校正グラフ (図 4) から結果は、次の数式。
カフェイン ピーク面積 = 0.1583* [カフェイン mg/L] - 0.574
アスパルテームのピーク面積 = 0.02696* [アスパルテーム mg/L] - 0.405
安息香酸のピーク面積 = 0.1363* [安息香酸 mg/L] - 1.192
ダイエット コーラ: カフェイン ピーク面積 10.68 を = = 0.1583* [カフェイン mg/L] - 0.574
[カフェイン mg/L] = (10.68 + 0.574)/(0.1583) = 71.1 mg/L 注入されたサンプルで。
サンプルの 2 倍希釈し、以来、ダイエット コーラはカフェイン 141.2 mg/L をしていた。
12 oz あたりの量ことができます = (141.2 mg/L) (0.3549 mL/12 oz 缶) = 50.5 mg カフェイン/することができます。
図 3。5 標準および 3 のサンプルの HPLC クロマト グラム。
図 4。3 つの部品のそれぞれの検量線。
表 2。較正曲線を生成するために使用される高速液体クロマトグラフィー試験データ テーブル。
高速液体クロマトグラフィーは、分離・検出、多くのアプリケーションで広く使われている手法です。ガス ・ クロマトグラフィー (GC) 必要サンプルは、彼らの気相と非揮発性化合物に最適です。非揮発性化合物には、糖、ビタミン、薬、代謝物が含まれます。また、各コンポーネントをさらに分析 (質量分析法) などを収集することができます非破壊です。移動相は、実質的に限定されない良好な分解能を達成するために pH の極性を変更ことができます。グラデーションの移動相を使用は、実際の試験の間にこれらの変更できます。
人工甘味料アスパルテームと関連付けられるかもしれない可能な健康問題の懸念がずっとあります。現在製品のラベルでは、ダイエット飲料内のこれらのコンポーネントの量は表示されません。このメソッドは、カフェインと安息香酸、これらの量を定量化できます。
他のアプリケーションを含める; 水中における農薬の量を決定します。アセトアミノフェンやイブプロフェンの痛み緩和剤タブレットの量を決定します。パフォーマンス向上薬選手の血流の存在があるかどうかを決定します。または単に犯罪ラボで薬の有無を判定します。これらのサンプルの濃度と多くの場合、コンポーネントの id をすぐに決定することができます、1 つの制限は、共同溶出の結果時間同一保持の近くにいくつかのサンプルがあることです。
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