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General Considerations for Blood Withdrawal

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Retro Orbital Bleed

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Tail Bleed

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Cardiac Blood Collection

14:15

Applications

16:07

Summary

Blutentnahme I

Quelle: Kay Stewart, RVT, RLATG, Anus; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. University of Notre Dame, IN

Blutentnahme ist eine häufige Anforderung für Forschungsstudien, die Mäuse und Ratten betreffen. Die Methode der Blutentnahme bei Mäusen und Ratten ist die Menge Blut benötigt, die Häufigkeit der Probenahme, der Gesundheitszustand des Tieres, entlüftet werden und der Schwierigkeitsgrad des Technikers abhängig. ¹ alle Methoden diskutiert-Retro-Orbital Sinus blutet, erste Rute Snip blutet und intrakardialen blutet-erfordern den Einsatz von einer Vollnarkose.

Vor dem blutenden Eingriff muss die Art der Probe erforderlich ermittelt werden. Experimentelle Verfahren könnte Vollblut, Plasma oder Serum erfordern. Für Vollblut muss die Probe ein Antigerinnungsmittel hinzugefügt werden. Plasma, das Fibrinogen und andere Gerinnungsfaktoren als getrennt von den roten Blutkörperchen enthält, kann aus einer Antikoagulanzien Probe extrahiert werden. Serum wird gewonnen durch Blutentnahme ohne ein Antigerinnungsmittel. Das Serum wird resultieren aus Zentrifugation der Probe, sobald ein Blutgerinnsel gebildet hat. Wie das Beispiel geronnen ist, wird das Serum Fibrinogen oder andere Gerinnungsfaktoren nicht enthalten. Plasma und Serum ergeben sich durch den Einsatz einer Zentrifuge bei 2200-2500 u/min für mindestens 15 Minuten laufen.

Für eine Probe, die Vollblut oder Plasma ergeben muss, muss eine geeignete Antikoagulans verwendet werden. Häufigsten verwendete Antikoagulantien für Versuchstiere sind Heparin, Natriumcitrat und Ethylenediamine Tetraacetic Säure (EDTA); die Auswahl basiert auf Forschungsbedarf. Sequester-eine flüssiger Form von EDTA, Heparin und Natriumcitrat-kann werden direkt in die Spritze zur Beschichtung von Oberflächen geladen. Dies ermöglicht Kontakt der Antigerinnungsmittel direkt wenn das Blut gezeichnet wird, helfen bei der Prävention von Blutgerinnung. Als Ratte Blut gerinnt schneller als die meisten Säugetierblut ist es wichtig, dass das richtige Verhältnis von Antigerinnungsmittel Blut zur Blutentnahme verwendet werden.

Nadelauswahl basiert auf der Größe des Tieres und die Website der Venenpunktion. In der Regel, je größer die Bohrung der Nadel, desto schneller die Probe gesammelt werden kann. Weniger Schäden an den Blutzellen ist ein weiterer Vorteil für größere Nadeln. Die größte Nachteil an großen Nadeln Bohrung ist jedoch die mögliche Beschädigung des Schiffes. An Mäusen und Ratten die Auswahl der Größe reicht von 20-29-g-Nadeln, die 0,5-1,5 Zoll in der Länge. Wenn eine Nadel zu lang ist, nicht nur ist es umständlich zu bedienen, aber mit den zusätzlichen Platz in der Nadel Blutgerinnung führen könnte. Die entsprechende Nadelstärke ist für jede Methode im Abschnitt "Vorgehensweise" aufgeführt.

Außerdem muss die Größe der erforderlichen Probe vorgegebenen. Aufgrund der geringen Größe der Maus oder Ratte muss der Höchstbetrag der Blutentnahme für ein Überleben bluten berechnet werden. Eine durchschnittliche Maus mit einem Gewicht von 25 Gramm hat eine gesamte Blutvolumen von 1,8 ml; die durchschnittliche Ratte mit einem Gewicht von 250 Gramm hat eine gesamte Blutvolumen von 16 ml. Für einen einzigen Blutprobe auf eine Maus oder Ratte ohne Flüssigkeitsersatz ist die maximale Blutvolumen, das sicher entfernt werden kann 10 % des gesamten Blutvolumens oder 7,7-8 µl/g. Somit ist für eine durchschnittliche Maus, 10 % seines Volumens Blut 193-200 µl. Für eine durchschnittliche Ratte von 250 Gramm, das entspricht bis zu 1,9-2,0 ml. Studien haben gezeigt, dass mehr als 15 % des Blutvolumens entfernen Hypovolämischen Schock führen kann. ^1,2 jedoch mit Flüssigkeitsersatz bis zu 15 % des gesamten Blutvolumens- oder 12 µl/g-kann entfernt werden. Für eine Maus 25 Gramm ist dies gleichbedeutend mit 300 µl; für eine Ratte 250 Gramm entspricht 3 ml. Für Flüssigkeitsersatz sollte die Flüssigkeit erwärmt und subkutan gegeben.

Ist es notwendig, mehrere Proben zu nehmen, sinkt das Blutvolumen gezeichnet. Die maximale Blutmenge, die pro Woche gezogen werden kann ist nicht mehr als 7,5 % des gesamten Blutvolumens oder 6 µl/g. Für eine Maus 25 Gramm entspricht dies 145-150 µl pro Woche. Für eine Ratte 250 Gramm entspricht dies 1,45-1,50 ml pro Woche. Ob Probenahme alle 2 Wochen stattfinden wird, kann bis zu 10 % des gesamten Blutvolumens (8 µl/g) gezogen werden. Dies ist gleichbedeutend mit 200 µl alle 2 Wochen für eine durchschnittliche Maus und bis zu 2,00 ml alle 2 Wochen für eine 250 Gramm-Ratte. Eine Studie an Ratten mit dem durchschnittlichen Gewicht von 250 Gramm, ergab, dass wenn Blut Volumen von 15-20 % entfernt wurden, es mehr als 29 Tage für Blutwerte dauerte zu normalisieren. ^1,2 für die wiederholte Blutentnahme Flüssigkeitsersatz erlaubt nicht für ein größeres Blutvolumen oder häufigere Blutentnahme, als es nur Volumen ersetzt. Das Tier braucht Zeit um Blutzellen wieder aufzufüllen.

Die Verwendung von Retro-Orbital Plexus ist eine gängige Praxis in der Vergangenheit gewesen. Jedoch haben viele Bedenken über die Menschlichkeit dieses Verfahrens ergeben. Während des Eingriffs kann übermäßige Bewegung des Hämatokrit Röhre einmal in der medialen Augenwinkel des Auges das umliegende Gewebe, was zu Schwellungen der Augenlider und/oder Bindehaut Membranen beschädigen. Das geschwollene Gewebe können den Augapfel zu ragen weit genug so dass Schließung des Augenlids behindert wird, was zu Hornhaut zu trocknen und zu Schäden führen. Schmerzen durch Schwellung auslösen kann, kratzen und Selbstverstümmelung, die Enukleation des Auges führt. Falsche Platzierung der Hämatokrit Röhre während einer Retro-Orbital bluten kann den Sehnerv, was zu Blindheit trennen. Wenn die Hämatokrit-Röhre in einem falschen Winkel fortgeschritten ist, kann das Auge aus der Umlaufbahn, so dass die Augenlider fallen hinter den Augapfel gezwungen werden. In diesem Fall ist es sehr schwierig, das Auge korrekt in die Steckdose zu ersetzen. Andere Probleme, die auftreten können, gehören Frakturierung der fragilen Umlaufbahn Knochen, Durchdringung des Augapfels, die Ergebnisse in den Verlust der Glaskörper oder die Bildung von einem Hämatom hinter dem Auge, das extreme Schmerzen durch den Druck auf das Auge führen können und Umgebung Strukturen. Trotz all dieser Bedenken wenn eine Fachkraft die Prozedur führt und das Tier ist vollständig mit einer Vollnarkose, wie Isoflurane Inhalat Anästhesie betäubt Retro-Orbital Blutungen erwiesenermaßen eine wirksame Methode des Blutes werden Kollektion bei Nagetieren.

Die anatomische Struktur der orbitalen Bereich unterscheidet sich zwischen der Maus und Ratte. Die Maus hat die Retro-Orbital Sinus-eine Sammlung von Schiffen, die Sinus in den orbitalen Bereich erstellen. In der Umlaufbahn des Auges Ratte ist ein Plexus von Schiffen, die hinter das Auge fließen; jedoch bilden sie keinen Sinus, wie in der Maus. Infolgedessen ist es einfacher, diesen Vorgang an Mäusen. Für wiederholte Bemusterung Sammlung über den Retro-Orbital-Plexus muss mindestens 10 Tage zwischen blutet das Gewebe im Bereich heilen zu lassen. Vollnarkose wird empfohlen, kann das Verfahren bei Mäusen ohne Vollnarkose durchgeführt werden, wenn eine ophthalmologische Lokalanästhetikum, wie Proparacaine oder Tetracaine, vor dem Eingriff angewendet wird. Ratten haben nicht den Retro-Orbital-Sinus, und weil ihre Membranen um die Umlaufbahn viel stärker sind, es zwingend erforderlich ist, um sie für dieses Verfahren zu betäuben.

Serielle Proben von einem kleinen Volumen können mithilfe eine Heck-Clip-Methode abgerufen werden. Die ersten Amputation der Rute muss auf eine Schwanzspitze, ca. 0,5-1,0 mm in der Länge bei Mäusen und Ratten 2,0 mm begrenzt werden. ¹ Rute Snip Verfahren zur Blutentnahme für serielle Sammlungen ermöglicht, durch Störung der Schorf oder Blutgerinnsel des Originals schneiden Sie am Ende der Rute. Weitere Amputation der Schwanzspitze ist in der Regel nicht notwendig. Mengen von Blut gesammelt Bereich von 20-100 µL für Mäuse und 75-150 µL für Ratten. Der gesammelte Betrag ist variabel zwischen Tieren und kann nach Alter, Gesundheitszustand und Gewicht beeinflusst werden.

Die Probe von einem Schweif Snip kann arteriellen und venösen Blut zusammen mit Gewebe Produktkontamination enthalten. Die Probenqualität verringert sich, wenn das Heck ist gestreichelt oder "gemolken", um mehr Blut zu erhalten. Um die Durchblutung zu erhöhen, kann die Rute mit warmen Kompressen, Wärmelampe oder Eintauchen in warmes Wasser beheizt werden. Druck auf die Schwanzspitze für Blutstillung angewendet werden sollen, und Tiere überprüft werden alle 5-10 Minuten um sicherzustellen, dass die Hämostase erreicht worden ist. Blutstillung wird oft mit wiederholten Sampling verzögert. Eine blutstillendes Pulver kann zur Blutstillung verwendet werden. Für die ersten Amputation ist Anästhesie (Vollnarkose oder lokaler) empfohlen. Nachfolgenden Blutungen sollten keine Anästhesie, erfordern, zumal die Tiere an das Verfahren gewöhnt werden. Anästhesie wird einen Tropfen des Blutdrucks, erschwert die Blutentnahme mit dieser Technik verursachen.

Eine Alternative zu einem Schweif Snip ist die Rute Schiff Nick. Dieses Verfahren ist leicht auf Mäuse und Ratten durchgeführt. Jedoch wie bei den Schweif Snip, können die Proben mit Gewebe-Produkte, vor allem in der Maus kontaminiert sein. Für Ratten eine Injektionsnadel in das Schiff eingefügt wird, und das Blut wird aus der Nabe der Nadel gesammelt. Eine Studie demonstriert die Verwendung von einem Druckverband oberhalb der Einstichstelle Nadel zur Blutentnahme Unterstützung. ³ Eine Spritze dient nicht das Blut aus dem Gefäß zu zeichnen, wie der Druck entsteht aus der Spritze das Schiff zusammenbrechen wird. Diese Methode kann auch für serielle Probenahme verwendet werden, da ein Gerinnsel entfernt werden, um die Site wieder zu bluten verursachen. Wie bei Heck-Scheren, ist es unerlässlich, die Blutstillung durch Druck auf die Seite und immer wieder geprüft das Tier alle 5-10 Minuten zu gewährleisten.

Studien erfordern oft, ein Nonsurvival, große Blutprobe, die über eine intrakardiale bluten oder der kaudalen Vena Cava durch Entbluten gesammelt werden. ⁴ etwa kann die Hälfte des gesamten Blutvolumens aus einer Maus oder Ratte durch Herzpunktion abgeholt werden. Dies entspricht 40 µl/g oder ca. 1 ml bei einer durchschnittlichen 25 Gramm-Maus. Eine 250 Gramm-Ratte würden ca. 10 ml Blut führen. Das Tier muss werden für Entbluten betäubt. Inhalat Anästhesie oder CO₂Narkose kann durch einen kompetenten Techniker verwendet werden; injizierbare Anästhesie kann auch verwendet werden. Es kann jedoch eine Abnahme der Blutdruck und Durchblutung, die die Menge an Blut verringern könnte.

Die Caudale Vena Cava-Methode erfordert, dass das Tier tief betäubt werden, um das Schiff chirurgisch freizulegen. CO₂ Narkose ist nicht ausreichend, wie das Herz schlägt sein muss und das Tier Atmung während der Blutentnahme. Während des Verfahrens kann zu schnellen Blutentnahme das Schiff auf die Abschrägung der Spritze, verschließen die Öffnung und verhindert Blutentnahme Zusammenbruch verursachen. Auch die Gefäßwände sind dünn, und so Bewegung der Hand und der Nadel muss vermieden werden, um Bruch oder Austritt von Blut aus der Einführungsstelle Eintrag zu verhindern. Als die Nadel durch die Haut nicht vorbei ist, führt diese Methode in der Auflistung einer sterilen Probe. Zusatztherapie Euthanasie Methoden müssen eingesetzt werden, um sicherzustellen, dass das Tier nicht aus der Narkose zu erholen. Diese Methode wird oft von Herz- oder aortalen Perfusion gefolgt.

Die intrakardiale-Methode durchgeführt, entweder mit dem Tier manuell zurückhaltend, sobald es narkotisierten (geschlossene Methode), oder das Herz chirurgisch entsprechend dem Protokoll für kaudalen Vena Cava Blut Erfassungsmethode (offene Methode) ausgesetzt werden kann. Für die geschlossene Methode sind Wahrzeichen für Nadelplatzierung der Nut durch den Brustkorb am Xiphoid Prozeß, linksseitig des Tieres gebildet.

1. Retro-Orbital bluten

Ausrüstung
1. Bereiten Sie eine Glasglocke oder Betäubungsmittel Induktion Kammer, eine betäubende Gas wie Isoflurane verwalten. Bei der Verwendung einer Glasglocke ist es unerlässlich, dass die flüssige Narkose nicht in Kontakt mit dem Tier zur Absorption durch die Haut zu vermeiden. Eine Plattform mit kleinen Löchern kann verwendet werden.
2. Microhematocrit Rohre, die 50-75 Mikroliter halten werden bevorzugt. Mylar umwickelte Rohre sind weniger wahrscheinlich, zwischen den Fingern des Betreibers zu brechen und gilt als eine Sicherheitsmaßnahme.
3. Mehreren Papier Handtuch dicken oder anderen isolierenden Materialien befinden sich auf der Arbeitsfläche, die Körperwärme des Tieres während des Verfahrens zu halten.
Vorbereitung und Positionierung des Tieres
1. Das Tier ist mit einer Inhalation Narkose, wie Isoflurane in einer Glasglocke oder Gas Narkose Induktion, Effekt betäubt.
2. Sobald das Tier vollständig betäubt ist, wird es entfernt und in seitlichen liegen.
3. Das Auge ist indem man einen Finger auf die Oberseite des Kopfes und entlang der Unterkiefer ragte, und ziehen die Haut zurück und nach unten.
4. Vermeiden Sie Druck auf die Luftröhre, wie das kann zusammenbrechen oder verdecken die Atemwege verursacht Tod durch Asphyxie.
Blutentnahme
1. Die Microhematocrit ist in der medialen Augenwinkel des Auges platziert und kaudal gerichtet in einem Winkel von 30-45° von der Ebene der Nase.
2. Druck und leichtes Drehen der Hämatokrit-Röhre. Dies wird Schnitt durch die Bindehaut Membranen und Bruch der okulären Plexus.
3. Das Blut fließt in die Hämatokrit-Röhre durch Kapillarwirkung.
4. Zu vermeiden, schieben so tief, dass Sie den Knochen an der Rückseite der okulären Hohlraum getroffen.
5. Sobald Blut zu fließen beginnt, behalten Sie Druck, ragte Auge bei.
6. Um mehrere Röhrchen Blut zu sammeln, es ist nicht notwendig, das nächste Rohr in das Okular Plexus, statt, wie das Blut fließen weiterhin und können gesammelt werden, wie es aus der medialen Augenwinkel kommt.
7. Um die Blutung zu stoppen, die Haut und lassen Sie das Auge in die Normalposition zurück. Druck auf die Umlaufbahn zur Blutstillung zu gewährleisten.

Abbildung 1. Retro-orbital Blutentnahme bei Mäusen.

(2) Tail bluten Verfahren: Tail Snip und Schweif Nick

Ausrüstung
1. Einem sterilen Skalpellklinge, vorzugsweise eine Nummer 11 Blade oder einer Rasierklinge einseitig wird verwendet, um die ersten Amputation für die Heck-Snip-Methode zu machen. Schere sollte nicht verwendet werden, da der Schnitt gemacht durch Scheren damit Gerinnung und Verringerung der Durchblutung zu fördern Zerkleinern ist. Für das Heck-Nick-Verfahren wird eine Nummer 11 oder 15 Skalpellklinge verwendet, um den Schnitt zu machen.
2. Eine Zurückhaltung-Rohr, das Ende der Maus zuzugreifen ist bereit.
3. Saugfähiges Küchenpapier oder Mull dienen als Substrat für die Durchführung der Schweif Snip.
4. Röhrchen oder Hämatokrit Röhren sind ebenfalls erforderlich.
5. Blutstillenden Puder sollte zur Blutstillung Unterstützung verfügbar sein.
Zurückhaltung
1. Das Tier wird in das Rohr so platziert, dass das Heck zugänglich ist. Für Broome Typ Wachstumsbefürworter wird das Tier Hinterteil zuerst in das Rohr gezogen. Für andere Röhren befindet sich das Tier zuerst Kopf.
2. Tiere sind in das Rohr gesichert, so dass sie nicht umdrehen oder der Rute zurückziehen.
3. Einige Mäuse werden die Rute Snip und Blut-Sammlung mit minimalem manuellen Zurückhaltung zulassen, wenn sie berechtigt sind, eine raue Oberfläche zu greifen.
4. Einige Ratten benötigen Inhalation Anästhesie für diese Methode der Blutentnahme.
Blutentnahme
1. Die Rute wird mit lauwarmem Wasser entfernen Schmutz und leichten Vasodilatation verursachen abgewischt. KEIN verwenden Sie heißes Wasser.
2. Für den Schweif Snip das Heck verlängert, und zum Ende der Rute (0,5-1 mm bis zu 2 mm für Ratten und Mäuse) wird mit dem Skalpellklinge geschnitten.
3. Für den Heck-Nick, erstreckt sich das Heck, und machte einen Schnitt mit dem Skalpellklinge ca. 2/3 der Abstand von der Bürzel, direkt über die seitlichen Schweif Vene.
4. Das Heck kann vom Rumpf bis zur Spitze, Durchblutung fördern streichelte; Allerdings wird dadurch die Qualität der Probe verringern.
5. Das Blut aus der Spitze oder Hämatokrit Röhren mit Nick gesammelt oder erlaubt, in einen Sammelbehälter Tropfen.

(3) kardiale Blutentnahme

Ausrüstung
1. Für eine Maus ist eine 3 cc Spritze mit einer Spurweite von 22-25 x 1" Nadel bevorzugt. Kleinere Spritzen haben nicht die gleichen Gegendruck und Blutentnahme schwieriger machen können. Kleiner als 25 Gauge Nadeln den Fluss von Blut, was zu erhöhter Blutgerinnung beschränken und Schäden an den Blutzellen. Nadeln kürzer als 1" können nicht erreichen das Niveau des Herzens, bei der Annäherung von der Membran an.
2. Für eine Ratte ist eine 10-12 cc Spritze mit einer 18-Gauge x 1.5" Nadel bevorzugt. Abhängig von der Größe der Ratte eine kleinere Spritze kann nicht halten das gesamte Blutvolumen gesammelt werden, und somit die Spritze während des Verfahrens geändert werden. Kleiner als 20 Gauge Nadeln beschränken den Fluss des Blutes, was zu erhöhter Blutgerinnung. Nadeln kürzer als 1,5" können nicht erreichen das Niveau des Herzens, bei der Annäherung von der Membran an.
3. Eine Blut-Sammelrohr von ausreichender Größe wird verwendet, um das Blut gesammelt zu halten.
Zurückhaltung
1. Angemessene Zurückhaltung ist entscheidend für den Erfolg dieser Methode. Das Tier wird durch das Genick mit dem Körper hängen senkrecht gehalten. Es ist wichtig, dass der Körper gerade um Durchbiegung des Herzens oder eine Verdrehung der Brust zu verhindern.
2. Eine alternative Position ist dorsal liegen, wenn die Nadel zwischen den Rippen des Tieres links platzieren. Dies ist besonders nützlich für sehr große Ratten oder wenn mehrere Tiere müssen entlüftet werden.

Abbildung 2. Kardiale Blutentnahme mit Maus vertikal gehalten.

Blutentnahme
1. Der Ansatz von der hinteren Seite, Punktion der Membran wird leichter erreicht, wenn die Maus oder Ratte durch das Genick vertikal gehalten wird.
  1. Die Nadel wird in die Kerbe nur auf der linken Seite des Tieres Xiphoid vorgeschoben.
  2. Die Nadel sollte parallel zur Wirbelsäule und nur unter den Rippen gelegt.
  3. Das Herz befindet sich etwa auf dem Niveau des Ellenbogens.
  4. Legen Sie die Nadel, Abschrägung, in der Brust, und das Herz zu durchbohren.
  5. Wenden Sie leichten Gegendruck mit der Spritze. Wenn die Nadel im Herzen ist, fließt Blut in die Spritze.
  6. Warten Sie, bis Blut Spritze gefüllt hat, vor dem Hinzufügen von zusätzlichen Gegendruck auf die Spritze.
2. Die seitlichen Ansatz von der linken Seite des Tieres erfordert Positionierung des Tieres in dorsal liegen.
  1. Der Einstieg ist gegen den Punkt des Ellenbogens auf der Brustwand gemessen. Das Herz befindet sich etwa auf dem Niveau des Ellenbogens.
  2. Die Nadel ist eingefügten senkrecht zur Ebene der Tabelle auf einen Punkt in der Mitte auf der Brustwand dorsoventrally gemessen.
  3. Legen Sie die Nadel, Abschrägung, in der Brust, und das Herz zu durchbohren.
  4. Wenden Sie leichten Gegendruck mit der Spritze. Wenn die Nadel im Herzen ist, fließt Blut in die Spritze.
  5. Warten Sie, bis Blut Spritze gefüllt hat, vor dem Hinzufügen von zusätzlichen Gegendruck auf die Spritze.

Abbildung 3. Kardiale Blutentnahme mit Maus in Position dorsal liegen.

Technische Tipps
1. Die normale Herz liegt mit der Spitze nach links zeigt. In seltenen Fällen kann das Herz aufgehoben werden, was zu Schwierigkeiten bei der Punktion des Herzes.
2. Übermäßigen Druck auf die Spritze kann das Herz Verschließen der Nadel Abschrägung und stoppen Blutfluss in die Spritze zusammenbrechen.
3. Anwenden von Gegendruck und es immer wieder die Freigabe initiiert Blutgerinnung in der Spritze.
4. Sanft Druck auf der Leber kann zusätzliche Blutvolumen in den Blutkreislauf, so dass es zur Auszahlung zur Verfügung erzwingen.

(4) hintere Hohlvene Blutentnahme

Ausrüstung
1. Eine TB-Spritze mit einem 25-29-Gauge-Nadel ist für die Blutentnahme in der Maus verwendet. Für Ratten ist eine 10-12 cc Spritze mit einer Spurweite von 22-25 x 1" Nadel erforderlich.
2. Eine chirurgische Plattform, Dissektion Tablett oder eine andere Oberfläche, das Tier zu sichern ist zusammen mit Krawatten, Klebeband oder Pins erforderlich, um die Gliedmaßen in Position zu bringen.
3. Injizierbare Anästhesie oder Inhalation Anästhesie ist notwendig. Wenn Sie einatmen Anästhesie verwenden, ist es wünschenswert, dass die Betäubung über eine Präzision Verdampfer mit einem Prüfkopf geliefert werden. Verfahren ist, dass mit einer Induktion Kammer ohne zusätzliche betäubende Gas-Lieferung nicht zur Verfügung ausreichend Zeit stellen wird für die Blutabnahme abgeschlossen sein, bevor das Tier belebt.
4. Iris-Schere für die Maus oder OP-Saal Sharp-stumpfe Scheren für die Ratte sind erforderlich, zusammen mit kleinen atraumatische Daumen Zange und einem 2 "x 2" Gaze-Schwamm.
Zurückhaltung
1. Wenn das Tier vollständig betäubt ist, vom Zeh kneifen oder Schweif Prise festgelegten, befindet sich das Tier im dorsalen liegen.
2. Die Gliedmaßen sind auf der Plattform mit Klebeband oder Stifte gesichert. Die Gliedmaßen sollte vom Körper ausgedehnt werden.
Widerrufsrecht
1. Die Haut wird angehoben und ein kleiner quer-Schnitt erfolgt durch die Haut oberhalb des Beckens bei Frauen oder oberhalb der Vorhaut bei Männern.
2. Der Punkt der Schere wird in den Schnitt gelegt, und ein Mittellinie Schnitt durch die Haut von der Becken/Vorhaut, die Xiphoid gemacht.
3. Die Haut spiegelt sich seitlich an jeder Seite. Stumpfe Dissektion möglicherweise notwendig, um ihn aus der darunter liegenden Muskeln zu lösen.
4. Der Muskel wird angehoben, und ein kleiner quer-Schnitt erfolgt durch den Muskel oberhalb der Haut Schnitt.
5. Der Punkt der Schere wird in den Bauchraum gelegt und ein Mittellinie Schnitt erfolgt durch den Muskel an der Xiphoid. Achten Sie darauf, die Schere Punkt nach oben, um zu vermeiden, schneiden alle Organe Winkel.
6. Schnitt quer entlang der Kurve der Rippen auf jeder Seite. Üben Sie besondere Vorsicht walten lassen, nicht, die Leber zu durchbohren.
7. Sanft bewegen den Darm des Tieres links um die hintere untere Hohlvene verfügbar zu machen.
8. Legen Sie einen Tupfer auf die Leber und ruhen Sie zeige- und Mittelfinger auf die Leber.
9. Mit der anderen Hand die Nadel, schräge nach oben, in die Vena Cava auf halbem Weg zwischen der Kreuzung der renalen Schiffe und den Beckenkamm Bifurkation.
10. Ziehen Sie langsam das Blut während der Druck auf die Leber.

Abbildung 4. Blutentnahme aus der hinteren Hohlvene.

Blutentnahme für Mäuse und Ratten kann mit einer Vielzahl von Techniken durchgeführt werden. Obwohl viele Faktoren, wie z. B. Stichprobengröße, Häufigkeit der Probenahme, sowie Größe und Alter des Tieres dies beeinflussen, ist die wichtigste Komponente der Spielstärke des Technikers Durchführung der Probenentnahme. Für die hier beschriebenen Methoden ist die ordnungsgemäße Verwendung von Anästhetika auch für Proben und das Wohlergehen der Tiere entscheidend.

Guidelines for the survival bleeding of mice and rats. 2010.
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Transcript

Blood collection is a common requirement for several research studies that involve mice and rats. The choice of method for blood withdrawal in these animals is dependent upon many factors like, the volume of blood needed, frequency of the sampling, health status of the animal to be bled, and the skill level of the technician.

Here, we will review these considerations and outline blood collection procedures including the retro-orbital eye bleed, tail snips and nicks, as well as intra-cardiac blood collection. For other methods, see the second video in this series.

Before delving into the blood withdrawal protocols, let's first review some general considerations including sample type, needle selection, and the maximum blood volume that can be collected. Prior to collecting blood from a mouse or a rat, the type of blood sample required must be determined. Experimental procedures could require whole blood, plasma, or serum.

If collecting whole blood, an anticoagulant must be added to the sample to prevent clotting. Commonly used anticoagulants include heparin, sodium citrate, and ethylenediamine tetraacetic acid, abbreviated as EDTA. Anticoagulants can be loaded directly into the syringe to coat the surfaces. This allows contact of the anticoagulant directly as the blood is drawn aiding in the prevention of clotting. Because rodent blood clots rapidly, it is essential that the correct ratio of anticoagulant to blood be used. Plasma collection requires centrifuging the whole blood WITH anticoagulant. Following the spin, the translucent liquid above the WBC and platelet layer is plasma. It contains fibrinogen and other clotting factors. On the other hand, serum is collected from whole blood sample WITHOUT anticoagulants. And because the sample has clotted, the serum, which is the top player, does not contain fibrinogen or other clotting factors.

Needle selection is based on the size of the animal and the site of the venipuncture. In general, large bore needles cause less damage to blood cells and enable more rapid blood collection; but are more likely to cause vessel damage. Needle length should also be considered. If a needle is too long, it could be awkward to use, or blood could begin to clot while still inside the needle. The choices of size ranges from 18 to 29 gauge and 0.5 to 1.5 inches in length. The appropriate needle size for each method will be discussed in the procedures section.

Lastly, because of the small size of rodents, there is a maximum amount of blood that can be collected from a single blood draw, which will not cause serious harm to the organism. Blood withdrawal could be without or with fluid replacement - usually done using 0.9% physiological saline. The upper limit in each case is listed in the text protocol below. Furthermore, some experiments require multiple sample collection and in such cases along with fluid replacement animal will need time in between to replenish blood cells as well. Again, there is a maximum amount that can be collected during serial collection, and the upper limits are listed in the protocol below.

After reviewing some general considerations, let's jump into the specific blood withdrawal techniques, starting with retro-orbital bleeding - a technique used by scientists to collect small volumes from the vessels near the eye. Note that the anatomical structure of the orbital area is different between the mouse and rat. The rats have a plexus of vessels that flow behind the eye, whereas the mouse has a collection of vessels that create a retro orbital sinus, which makes it is easier to perform this procedure in mice.

Begin by grabbing a tube for blood collection. Micro hematocrit tubes that hold 50-75 microliters are preferred. Lay down several paper towels or other insulating materials on the work surface. This is to maintain the animal's body heat during the procedure. Now anesthetize the animal using an inhalation anesthetic such as isoflurane. Once the animal is fully anesthetized, remove it from the chamber and place it down on its side that is in in lateral recumbency position. Next, place a finger on the top of the head and along the jaw line and pull the skin back and down to induce eye protrusion. Avoid applying pressure to the trachea as that may cause death by asphyxia. Subsequently, place the micro-hematocrit tube in the medial canthus of the eye and direct it caudally at a 30 to 45 degree angle from the plane of the nose. Apply pressure while gently rotating the tube. This will cut through the conjunctival membranes and rupture the ocular plexus or sinus. The blood will flow into the hematocrit tube by capillary action. Avoid pushing the tube so deep that you hit the bone at the back of the ocular cavity. Once blood begins to flow, maintain pressure to keep the eye protruded. To stop bleeding, release the skin and allow the eye to return to the normal position. Apply pressure to promote hemostasis. For repeated sample collection, allow a minimum of 10 days between the bleeds. This provides tissues some time to heal.

Although retro-orbital bleeding is a common procedure, there are many concerns about its humaneness. These include swelling due to excessive movement of the hematocrit tube. This in turn can cause the eyeball protrusion and impede closure of the eyelid resulting in corneal drying, damage, and pain, which can trigger scratching and self-mutilation. Improper placement of the hematocrit tube can sever the optic nerve resulting in blindness. Another possible complication is that the eye can be forced out of the orbit, allowing the eyelids to fall behind the eyeball. Furthermore, issues can arise from the fracturing of the fragile orbit bones, penetration of the eye globe resulting in the loss of vitreous humor, or the formation of a hematoma behind the eye that can result in extreme pain. Despite all of these concerns, if a skilled technician performs the procedure and the animal is fully anesthetized, retro-orbital bleeding is an effective method of blood collection in rodents.

Now let's review the considerations and procedures for tail bleeding, which allows collection of a serial samples of small volumes. The equipment needed for this procedure include a sterile number 11 scalpel. Scissors should not be used because the cut made by scissors is crushing, which can promote clotting and reduce blood flow. Other instruments are a restraint tube that allows access to the animal's tail; absorbent paper towels; collection or hematocrit tubes and styptic powder - to aid in hemostasis.

Start by securing the animal into the restraint tube. Then, wipe the tail with warm water to remove debris and to cause slight vasodilation. DO NOT use hot water.Extend the tail and with the scalpel blade snip the very end of the tail to collect the blood using hematocrit or collection tubes. The tail can be stroked or "milked" from rump to tip to encourage blood flow. This will, however, decrease the quality of the sample.

To stop bleeding, apply pressure to the tail tip with a gauze pad. The styptic powder may be used to achieve hemostasis. Check the animals every 5 to 10 minutes to ensure hemostasis has been achieved, which might be delayed after repeated sampling. The sample collected from a tail snip can contain both arterial and venous blood, along with tissue product contamination. However, this procedure for blood collection allows for serial collections by disrupting the scab or clot of the original cut at the end of the tail.

An alternative blood collection method to a tail snip is the tail vessel nick, which is relatively less invasive. For this, using the same scalpel blade, make a small cut directly over the lateral tail vein, approximately two-third the distance from the rump. As with tail snips, blood can be collected in collection or hematocrit tubes. And it is imperative to assure hemostasis by applying pressure to the site and rechecking the animal every 5-10 minutes. However, as with the tail snip, the samples may be contaminated with tissue products.

Often studies that require a non-survival large blood sample, which is accomplished through exsanguination via an intra-cardiac bleed or the caudal vena cava.

For intra-cardiac method in mice, you need a 3 cc syringe with a 22 -25 gauge 1 inch needle. And for rats, a 10-12 cc syringe with an 18 gauge 1.5 inches needle is preferred. See the protocol below to understand the why these needs and syringes are ideal.

Start by euthanizing the animal using carbon dioxide. Following euthanasia, hold the rodent by the scruff with the body hanging vertically. This restrain is critical as the body should be straight to prevent deflection of the heart or a twisting of the chest. Note that the heart is located approximately at the level of the elbow. The insertion side is in the notch just to the left of the xiphoid, parallel to the spine and under the ribs.

Insert the needle, bevel up, into the chest and puncture the heart. Apply slight backpressure with the syringe. If the needle is in the heart, blood will flow into the syringe. Wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Approximately half of the total blood volume can be collected from a mouse or rat by cardiac puncture. This is equivalent to approximately 1 mL of blood from an average mouse and approximately 10 mL of blood from an average rat

An alternative position is dorsal recumbency when using the lateral approach. In this case, place the needle between the ribs on the animal's left side. The point of entry is measured against the point of the elbow on the chest wall. Insert the needle, bevel up, perpendicular to the plane of the table at a point midway on the chest wall. Apply slight back pressure with the syringe. If the needle is in the heart blood will flow into the syringe. Again, wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Note that in either position, excessive backpressure may collapse the heart occluding the needle bevel and stopping blood flow into the syringe.

Another method to collect cardiac blood is through the caudal vena cava. The equipment needed for this procedure are an appropriate syringe with a correct size needle attached; scissors for opening the abdominal cavity, small atraumatic thumb forceps and gauze sponge. This technique requires that the animal be deeply anesthetized and maintained under anesthesia throughout the procedure. CO2 narcosis is not an option, as the animal heart must be beating for this procedure. Place the animal in dorsal recumbency position, and secure the limbs to the platform. The limbs should be extended away from the body.

Now lift the skin with forceps and use scissors to make a small transverse cut through the skin just above the pelvis in females or prepuce in males. Next, place the point of the scissors into the cut and make a midline incision through the skin from the pelvis or prepuce to the xiphoid. With the skin laterally reflected, lift the muscle and make a small transverse cut through the muscle, just above the skin cut.

Place the point of the scissor into the abdomen and make a midline incision through the muscle to the xiphoid. Be sure to angle the scissor point upward to prevent cutting any organs. Cut transversely along the curve of the ribs on each side. Be careful not to puncture the liver. Gently move the intestines to the animal's left to expose the posterior vena cava. Place a gauze pad on the liver and rest your index and middle fingers on it. With your other hand, insert the needle, bevel up into the vena cava, midway between the junction of the renal vessels and iliac bifurcation. Slowly withdraw the blood while applying pressure on the liver.

Avoid hand movement, as that might cause the vessel rupture. Also, too rapid blood withdrawal can cause the vessel to collapse onto the bevel occluding the opening and preventing blood collection. The main advantage of this technique is the ability to collect a sterile sample because the needle does not pass through the skin.

Lastly, let's look at some applications of these blood withdrawal techniques. Immuno-oncology is an emerging field, and researchers in this area often perform blood collection to study the immune cells at different stages of cancer development. For example, here researchers collected cardiac blood from cancer-bearing mice to isolate and quantify neutrophils at ten, twenty and thirty days following tumor engraftment.

On the other hand, blood composition is also frequently studied by physiologists. Like in this study, researchers were interested in evaluating kidney function in diabetic animals. In order to do that, these scientists first injected a dye into a diabetes animal model. Next, they then used tail snip method to collect blood at several time-points to evaluate dye concentration in blood, which was ultimately used to calculate glomerular filtration rate that highlighted the difference in kidney function following diabetes induction.

Lastly, stem cells researchers use blood samples to evaluate the success of incorporation of donor cells into the recipient's system. Here, the investigators first transplanted bone marrow cells from a male mouse into a wild type and genetically modified female animal via the tail vein injection. Next, they collected blood from the retro orbital sinus of the recipient mouse to study the genomic DNA of blood cells using polymerase chain reaction. This provided the percentage of donor cells engraftment in the two types of animals.

You've just watched JoVE's first installment on blood withdrawal techniques. Please see the next video in series to review how to perform other commonly employed techniques of blood collection in lab animals. As always, thanks for watching!

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