Name: the preparation of primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow for electroporation
Uploaded: 2009-01-06T23:59:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation at JoVE.com

<p class="jove_title"> Сбор костного мозга от бедра и голени </p><ol><li> Первый этап процедуры для сбора костного мозга от бедра и голени 6 - на 12-недельных мышей (мы используем BALB / с мышами, но вы можете сделать эту процедуру с любым мыши деформации). Во-первых, усыпить мыши СО <sub>2</sub> ингаляции (не будет показан). Урожай бедра и голени от задних ног каждого из них. Затем, с лезвием, разрезать каждый конец бедренной кости для удаления тазобедренных и коленных суставах и разоблачить мозга. </li><li> Таким же образом, сократить каждом конце голени, чтобы удалить коленного и голеностопного прилегающих районов и разоблачить мозга. </li><li> Возьмите 3 мл шприц с 26-иглы и залейте его RPMI с добавлением 10% FBS, пенициллин, стрептомицин, и бета-меркаптоэтанола (BME = 100 мкм). С помощью пинцета держать кости более чашки Петри содержащей RPMI СМИ. Вставьте иглу шприца в один конец кости и нажмите поршень, чтобы избавиться от костного мозга. Иглу шприца можно перемещать вверх и вниз внутри кости, чтобы избавиться от остаточных мозга. </li><li> Повторите процедуру для всех костей, а затем продолжить создание культур. </li></ol><p class="jove_title"> Создание культур </p><ol><li> Установить кости культур мозга, пипетки вспыхнул костного мозга вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить ткани в клеточной суспензии. </li><li> Место 70 микрон фильтр на вершине 50 мл коническую трубку, и добавить клеточной суспензии в фильтр. </li><li> Полоскание чашки Петри одно время с RPMI, а затем добавить промыть в фильтре 70 мкм. </li><li> Использование резиновых конце 1 мл шприца, перемалывать кости частей мозга, оставшиеся на начало 70-микронный фильтр. </li><li> Промойте фильтр один раз с RPMI. </li><li> После промывки фильтров, центрифуг клеточной суспензии при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут. </li><li> Промыть осадок клеток путем суспендирования в PBS. </li><li> Граф клеток с использованием гемоцитометра. Как правило, мы получаем ~ 90 миллионов клеток из костей одним кликом (две бедренные кости и две голени). После подсчета клеток, центрифуги их снова при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут. </li><li> Ресуспендируют клетки в небольшом количестве RPMI и аликвоту их в культуре ткани колбы, содержащие достаточно RPMI так, чтобы конечная концентрация составляет 1 млн. клеток в мл. </li><li> Добавить цитокинов способствовать развитию вашего типа клеток, представляющих интерес. В этом случае, цитокина интерлейкина-3 (IL-3 = 10 нг / мл) в целях содействия развитию базофилов и тучных клеток. Для приобретения базофилов, инкубировать в течение 10 дней. Для тучных клеток, инкубировать в течение 5 недель. При создании тучных клеток, средств массовой информации и IL-3 должен быть изменен раз в неделю. </li><li> Вот посмотрите, как тучные клетки должны появиться сразу после металлизации. Это изображение показывает дифференциацию тучных клеток мозга в базофилов и тучных клеток через 10 дней после того интерлейкина-3. </li><li> Как только желательный тип клеток получается, переходите к шагу электропорации. </li></ol><p></p><p class="jove_title"> Клетки Electroporating </p><ol><li> Для начала электропорации шаг, определить количество клеток в культуре колбу. </li><li> Клетки, как правило, электропорации при плотности 10 миллионов в мл, поэтому передача необходимого количества ячейки конических труб и труб центрифуге при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут. </li><li> После центрифугирования, аспирация СМИ, мыть клетки с 1X PBS, и вновь центрифуге при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут. </li><li> Аспирируйте PBS и добавьте Bio-Rad Гена Pulser электропорации буфера, чтобы сделать клеточную суспензию из 10 миллионов клеток на мл. </li><li> После ресуспендирования клеток, добавьте нужные ДНК плазмиды в конечной концентрации от 10 до 20 мкг на мл. </li><li> Алиготе 150 мкл суспензии клеток в лунки свой выбор на 96-луночного электропорации пластины. </li><li> Положите электропорации пластины в камере пластины MXcell и закрыть крышкой. </li><li> До трансфекции тучных клеток, электропорации протокол должен быть запрограммирован в MXcell за исключением использования предустановок или хранится протокол. Благодаря оптимизации экспериментов мы обнаружили, что высокая эффективность трансфекции тучных клеток происходит с помощью квадратных протоколов пульсовой волны. Мы будем меняться электропорации условий на пластине для доставки 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms и 350V/10ms импульсов прямоугольной волны в конденсатор на 2000мкФ и 1000 Ом. Как только протокол был установлен и загружен на устройства, нажмите «Пульс», чтобы electroporate клеток. </li><li> После электропорации завершения передачи клеткам планшета для культуры ткани. Как правило, мы передачи по 150 мкл электропорации образец хорошо в 48-луночного культуре ткани пластину, содержащую 300 мкл RPMI (с добавлением 10% FCS, пенициллин, стрептомицин, и бета-меркаптоэтанол) с 10 нанограмм на мл интерлейкина-3. Клетки инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° С, затем анализировали через 24 часа для выражения мнения и подавление. </li></ol><p class="jove_title"> ТранРезультаты sfection </p><p class="jove_content"> Флуоресцентное изображение микроскопии клеток после успешного электропорации с использованием 20 мкг на мл GFP плазмиды показан на видео. Использование электропорации MXcell системы трансфекции эффективности около 30% могут быть получены. Система позволяет варьировать условия для максимальной эффективности трансфекции, сохраняя жизнеспособность клеток. </p>

<p class="jove_content"> Поскольку все больше появляется геномной информации и новые инструменты, такие как миРНК разработаны, применение физиологически соответствующие клетки становится все более важным дальнейшее наше понимание болезни путей, белок-белковых взаимодействий и передачи сигнала. Первичные элементы получаются непосредственно из ткани или жидкости и культивируемых в лабораторных условиях. Эти клетки можно манипулировать различными способами, в том числе путем введения экзогенного генетического материала. Становится все более очевидным, что наиболее эффективным способом введения плазмидной ДНК или миРНК в первичные клетки электропорации. </p><p class="jove_content"> Электропорация выставляет клетках в электрические импульсы для того, чтобы временно увеличивают проницаемость клеточных мембран, тем самым позволяя экзогенных нуклеиновых кислот, чтобы войти в камеру. Этот метод трансфекции может быть оптимизирована, чтобы учесть различия между различными типами клеток / линии и, таким образом, могут быть использованы для трансфекции тучных клеток, а также любые другие костномозгового происхождения клетки. Кроме того, в отличие от вирусного-опосредованной трансфекции, электропорации не накладывает ограничений на размер трансфекции ДНК, не требуют серьезной подготовки. В отличие от липидных-опосредованной трансфекции, электропорации может быть менее токсичны и не приводит к эндосом захвата трансфекции нуклеиновых кислот. </p><p class="jove_content"> Bio-Rad разработана система MXcell электропорации специально для этих клеток. MXcell позволяет варьировать условия для максимальной эффективности трансфекции и жизнеспособности клеток. В целях оптимизации эффективности трансфекции и свести к минимуму гибель клеток, множество параметров, включая электропорации напряжения, емкости, сопротивления и длительности импульса можно регулировать и оценивать. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Gene Pulser MXcell Electroporation System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2670</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser Electroporation Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>165-2677</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

the preparation of primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow for electroporation

<p class="jove_content">Становится все более очевидным, что электропорации является наиболее эффективным способом введения плазмидной ДНК или миРНК в первичные клетки. Гена Pulser MXcell система электропорации и Джин Pulser электропорации буфера были специально разработаны для трансфекции нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих и трудных для трансфекции клеток, таких как первичный и стволовых cells.This видеоролике показано, как создать первичную гемопоэтических клеточных культур из мышиных костного мозга , а затем подготовить их к электропорации в системе MXcell. Начнем с выделения бедра и голени. Костный мозг с обеих бедра и голени затем собирают и культуры устанавливаются. Культивируемых клеток костного мозга, затем трансфекции и анализировали.</p>

Watch this Scientific Journal Video about The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation at JoVE.com

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

<p class="jove_content">Эта процедура описывает, как установить первичный гемопоэтических клеточных культур из мышиного костного мозга и сопровождается трансфекции с использованием генной Pulser MXCell электропорации системы.</p>

Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

<p>


<a class="grey_button" href="/video/1047">
ChineseVersion
</a>


</p>

Research

JoVE Journal

Biology

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Вывод гемопоэтических стволовых клеток мышей эмбриональных стволовых клеток

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Первичные культуры нейронов из мозга дрозофилы поздней стадии куколки

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Подготовка нейронных культур от Midgastrula этапе эмбрионы дрозофилы

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Electroporation of Mycobacteria

Электропорация микобактерий

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

Первичная диссоциированных мозга Допамин клеточных культур от грызунов Новорожденные

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing гемопоэтических клеток в костном мозге

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Первичные культуры и плазмиды электропорации мышей органа Корти.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Primary Cell Cultures from <em>Drosophila</em> Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Первичных клеточных культур из<em> Drosophila</em> Гаструла Эмбрионы

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Подготовка первичной Миогенный предшественников Cell / миобластов культур от базальной позвоночных линий

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Остеокластов Вывод из костного мозга мыши

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...