ELISPOT-Assay: Nachweis von IFN-γ-sezernierenden Splenozyten

Quelle: Tonya J. Webb^1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimore, Maryland 21201

ELISPOT ist ein standardisierter, reproduzierbarer Assay, der verwendet wird, um zelluläre Immunantworten zu erkennen. Der Test nutzt eine enzymgebundene Immunosorbent Assay (ELISA)-basierte Methode, um einzellige Immunreaktionen zu erkennen, die durch Flecken visualisiert werden können, daher der Name ELISPOT. ELISPOT wurde erstmals 1983 von Czerkinsky als Methode zur Aufzählung der Anzahl von B-Zell-Hybridomen beschrieben, die antigenspezifische Immunglobuline produzieren (1). Dieselbe Gruppe entwickelte den Assay weiter, um die Häufigkeit von Zytokin produzierenden T-Lymphozyten zu messen. Jetzt ist ELISPOT zu einem Goldstandard für die Messung der antigenspezifischen T-Zell-Immunität in klinischen Studien und Impfstoffkandidaten geworden. Zum Beispiel sezernieren Plasmazellen und Speicher-B-Zellen nach der Impfung oder während einer Infektion Antikörper, die Schutz bieten. Typischerweise werden diese B-Zell-Antworten durch Messung von Serumtitern antigenspezifischer Antikörper bewertet. Diese Art der Analyse, die in der Regel mit ELISA gemessen wird, kann jedoch keine Speicher-B-Zellen enthalten, die auch ohne nachweisbare Serumantikörpervorhanden sein können. Darüber hinaus ist es erwiesen, dass zirkulierende Gedächtnis-B-Zellen für die schnelle und schützende Antikörperreaktion wichtig sind, die nach der erneuten Exposition von Erregern beobachtet wird, daher ist es wichtig, diese Zellen erkennen zu können. Daher sollten zur eindeutigen Beurteilung antigenspezifischer Speicher-B-Zell-Antworten sowohl ELISA als auch ELISPOT verwendet werden (2).

ELISPOT Assay verwendet eine Platte mit membrangefütterten Brunnen, die mit Antikörpern beschichtet sind, um sezernierte Proteine von Interesse zu erfassen. Dann wird die Platte mit Zellen und Reizen beladen, um die Proteinproduktion zu induzieren. Die sezernierten Proteine werden von den an der Oberfläche beschichteten Antikörpern erfasst. Nach entsprechender Inkubationszeit werden Zellen entfernt und das sezernierte Molekül wird mit einem biotinylierten Antikörper nachgewiesen, der im Vergleich zum Capture-Antikörper spezifisch für ein anderes Epitop ist. Als nächstes wird Streptavidinperoxidase hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe eines Substrats, das die Detektion der Flecken ermöglicht (Abbildung 1). Die Stärke dieses Assays ist, dass es einem erlaubt, die Anzahl der Zellen zu quantitieren, die das Protein von Interesse produzieren. Wichtig ist, dass man beurteilen kann, ob sich die Gesamtzahl der Zellen, die ein bestimmtes Protein produzieren, verändert oder ob einzelne Zellen innerhalb einer Population mehr Protein produzieren. Darüber hinaus kann es Informationen über Kinetik liefern und kann verwendet werden, um die allgemeine Immunaktivierung (Mitogen-Stimulation) relativ zu antigenspezifischen Reaktionen (Antigensimulation) zu bewerten. Der ELISPOT-Test ermöglicht den Nachweis einer aktivierten Zelle unter 300.000 Zellen nach mitogener oder antigenspezifischer Aktivierung.

Abbildung 1: ELISPOT-Protokollübersicht.

Die Hauptvorteile dieses Assays sind seine- a. Einfachheit- das Protokoll ist relativ einfach und unkompliziert. Es erfordert keine technische Expertise, b. Sensitivität- es ermöglicht den Nachweis von Immunzellen auf einzelzellebener Ebene und erfordert sehr wenige Zellen im Vergleich zu anderen Methoden wie Durchflusszytometrie, c. Funktionalität - es liefert quantitative Daten über Immunzellen funktion.

Diese Übungseinheit zeigt das ELISPOT-Protokoll zum Nachweis von IFN-Sezersplenozyten, aber wie oben erwähnt, kann dieser Test auch zur Beurteilung der Antikörpersekretion durch B-Zellen verwendet werden (3).