אליספוט אסאי: זיהוי של IFN-γ הפרשת טחול

מקור: טוניה ג'יי ווב^1
1 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מרילנד ומרכז הסרטן המקיף מרלן וסטיוארט גרינבאום, בולטימור, מרילנד 21201

ELISPOT הוא מדוקנן, ניתן לשחזור המשמש לזיהוי תגובות חיסוניות תאיות. הבחינה משתמשת בשיטה מבוססת בדיקה חיסונית הקשורה לאנזים (ELISA) כדי לזהות תגובות חיסוניות חד-תאיות שניתן לדמיין לפי כתמים, ומכאן השם ELISPOT. ELISPOT תוארה לראשונה בשנת 1983, על ידי צ'רקינסקי, כשיטה למנות את מספר ההיברידיות של תאי B המייצרות אימונוגלובולינים ספציפיים לאנטיגן (1). אותה קבוצה פיתחה עוד יותר את ההסתה כדי למדוד את התדירות של ציטוקינים המייצרים לימפוציטים T. עכשיו ELISPOT הפך תקן זהב למדידת חסינות תאי T ספציפיים אנטיגן בניסויים קליניים ומועמדים לחיסון. לדוגמה, לאחר חיסון או במהלך זיהום, תאי פלזמה ותאי זיכרון B מפרישים נוגדנים המספקים הגנה. בדרך כלל, תגובות תאי B אלה מוערכות על ידי מדידת טיטרים בסרום של נוגדנים ספציפיים לאנטיגן. עם זאת, סוג זה של ניתוח, נמדד בדרך כלל על ידי ELISA, לא יכול לכלול תאי זיכרון B, אשר יכול להיות נוכח גם בהיעדר רמות נוגדנים בסרום לגילוי. יתר על כן, זה כבר מבוסס היטב כי תאי זיכרון B במחזור חשובים לתגובה נוגדנים מהירה ומגנה שנצפו בעקבות חשיפה מחדש פתוגן, ולכן זה קריטי כדי להיות מסוגל לזהות תאים אלה. לכן, כדי להעריך בבירור תגובות תאי B זיכרון ספציפי אנטיגן, הן ELISA ו ELISPOT יש להשתמש (2).

ELISPOT assay משתמש בצלחת המכילה בארות מרופדות ממברנה מצופות בנוגדנים על מנת ללכוד חלבונים מופרשים של עניין. לאחר מכן, הצלחת עמוסה בתאים וגירויים כדי לגרום לייצור חלבון. החלבונים המופרשים נלכדים על ידי הנוגדנים המצופים על פני השטח. לאחר זמן הדגירה המתאים, תאים מוסרים והמולקולה המופרשת מזוהה באמצעות נוגדן ביוטינילציה ספציפי לאפיטופ אחר, בהשוואה לנוגדן הלכידה. לאחר מכן מתווסף סטרפטאבידין פרוקסידאז, ואחריו הוספת מצע המאפשר זיהוי של הכתמים (איור 1). הכוח של ההסתה הזו הוא שהוא מאפשר כמות מספר התאים המייצרים את החלבון המעניין. חשוב לציין, ניתן להעריך אם יש שינויים במספר הכולל של תאים המייצרים חלבון מסוים או אם תאים בודדים בתוך אוכלוסייה מייצרים יותר חלבון. יתר על כן, הוא יכול לספק מידע לגבי קינטיקה והוא יכול לשמש להערכת ההפעלה החיסונית הכוללת (גירוי מיטוגן) ביחס לתגובות ספציפיות אנטיגן (סימולציית אנטיגן). בדיקות ELISPOT יאפשרו את הזיהוי תא אחד מופעל בין 300,000 תאים לאחר הפעלה מיטוגנית או אנטיגן ספציפי.

איור 1: מבט כולל על פרוטוקול ELISPOT.

היתרונות העיקריים של ההסתייגות הזו הם שלה. פשטות - הפרוטוקול הוא פשוט יחסית ופשוט. זה לא דורש מומחיות טכנית, ב. רגישות - היא מאפשרת זיהוי של תאי מערכת החיסון ברמת התא הבודד ודורשת מעט מאוד תאים בהשוואה לשיטות אחרות כגון ציטומטריית זרימה, c. פונקציונליות - הוא מספק נתונים כמותיים לגבי תפקוד מערכת החיסון.

תרגיל מעבדה זה מדגים את פרוטוקול ELISPOT לגילוי של IFN-γ הפרשת-טחול, אבל כאמור לעיל הבדיקה הזאת יכולה לשמש גם כדי להעריך הפרשת נוגדנים על ידי תאי B (3).