ELISPOTアッセイ:IFN-γ分泌脾細胞の検出

ソース: トーニャ・J・ウェッブ^1
1メリーランド大学医学部微生物学・免疫学科、マーリーン・スチュワート・グリーンバウム総合癌センター、ボルチモア、メリーランド州 21201

ELISPOTは、細胞の免疫応答を検出するために使用される標準化された、再現可能なアッセイです。このアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)ベースの方法を利用して、スポットで可視化できる単細胞免疫応答を検出し、ELISPOTという名前を付けます。ELISPOTは、1983年に、チェルキンスキーによって、抗原特異的免疫グロブリンを産生するB細胞ハイブリドーマの数を列挙する方法として説明された(1)。同じグループはさらに、Tリンパ球を産生するサイトカインの頻度を測定するアッセイを開発した。現在、ELISPOTは臨床試験やワクチン候補における抗原特異的T細胞免疫を測定するためのゴールドスタンダードとなっています。例えば、ワクチン接種後または感染中に、血漿細胞および記憶B細胞は保護を提供する抗体を分泌する。典型的には、これらのB細胞応答は、抗原特異的抗体の血清定量子を測定することによって評価される。しかしながら、このタイプの分析は、典型的にはELISAによって測定され、記憶B細胞を含んでおらず、検出可能な血清抗体レベルがない場合でも存在しうる。さらに、循環記憶B細胞は病原体再曝露後に観察される迅速かつ保護抗体応答にとって重要であることが確立されており、したがって、これらの細胞を検出できることが重要である。したがって、抗原特異的記憶B細胞応答を明確に評価するために、ELISAとELISPOTの両方を使用すべきである(2)。

ELISPOTアッセイは、目的の分泌されたタンパク質を捕捉するために抗体でコーティングされた膜裏地を含むプレートを使用しています。次いで、プレートに細胞と刺激をロードしてタンパク質産生を誘導する。分泌されたタンパク質は、表面にコーティングされた抗体によって捕捉されます。適切なインキュベーション時間の後、細胞が除去され、分泌された分子は、捕捉抗体と比較して、異なるエピトープに特異的であるビオチン化抗体を使用して検出される。次に、ストレプトアビジンペルオキシダーゼを添加し、続いてスポットの検出を可能にする基板を添加する(図1)。このアッセイの強さは、目的のタンパク質を産生する細胞の数を定量化する可能性がある。重要なのは、特定のタンパク質を産生する細胞の総数に変化があるかどうか、または集団内の個々の細胞がより多くのタンパク質を産生しているかどうかを評価できることです。さらに、運動学に関する情報を提供することができ、抗原特異的応答(抗原シミュレーション)に対する全体的な免疫活性化(ミトゲン刺激)を評価するために使用することができます。ELISPOTアッセイは、ミト原性または抗原特異的活性化後の300,000細胞中の1つの活性化細胞の検出を可能にします。

図 1: ELISPOT プロトコルの概要。

このアッセイの主な利点は、その単純さ-プロトコルは比較的簡単で簡単です。技術的な専門知識を必要とせず、b. 感度- それは単一細胞レベルで免疫細胞の検出を可能にし、フローサイトメトリーなどの他の方法と比較して非常に少数の細胞を必要とする、 c. 機能性- それは免疫に関する定量的データを提供します関数。

このラボ演習では、IFN-γ分泌脾細胞の検出のためのELISPOTプロトコルを示していますが、上記のアッセイとして、B細胞による抗体分泌を評価するためにも使用できます(3)。