ELISPOT 분석: IFN-γ 분비 비장세포 검출

출처: 토냐 J. 웹^1
1 미생물학 및 면역학학과, 메릴랜드 의과 대학 및 말린과 스튜어트 그린바움 종합 암 센터, 볼티모어, 메릴랜드 21201

ELISPOT은 세포 면역 반응을 검출하는 데 사용되는 표준화되고 재현 가능한 분석입니다. 상기 분석법은 효소연계 면역흡소감분석법(ELISA)-기반 방법을 활용하여 반점에 의해 시각화될 수 있는 단세포 면역 반응을 검출하고, 따라서 이름 ELISPOT이다. ELISPOT은 1983년에, Czerkinsky에 의해, 항원 특이적 면역글로불린(1)을 생성하는 B 세포 혼종의 수를 열거하는 방법으로 처음 기술되었다. 동일한 그룹은 T 림프구를 생산하는 사이토카인의 주파수를 측정하기 위해 분석서를 더욱 개발하였다. 이제 ELISPOT은 임상 시험 및 백신 후보에서 항원 특이적 T 세포 면역을 측정하기위한 금 표준이되었습니다. 예를 들어, 예방 접종 후 또는 감염 중에 혈장 세포 및 메모리 B 세포는 보호를 제공하는 항체를 분비합니다. 전형적으로, 이들 B 세포 반응은 항원 특이적 항체의 혈청 티터를 측정하여 평가된다. 그러나, 이러한 유형의 분석은, 전형적으로 ELISA에 의해 측정된, 검출 가능한 혈청 항체 수준이 없는 경우에 존재할 수 있는 메모리 B 세포를 포함하지 않을 수 있습니다. 더욱이, 순환 메모리 B 세포가 병원균 재노출 에 따라 관찰된 신속하고 보호적인 항체 반응에 중요하다는 것이 잘 확립되어 왔으며, 따라서 이러한 세포를 검출할 수 있는 것이 중요하다. 따라서 항원 특이적 메모리 B 세포 반응을 명확하게 평가하기 위해 ELISA와 ELISPOT 모두 (2)를 사용해야 한다.

ELISPOT 분석은 관심있는 분비 단백질을 포착하기 위해 항체로 코팅된 멤브레인 안감 우물을 포함하는 플레이트를 사용합니다. 이어서, 플레이트는 단백질 생산을 유도하기 위해 세포와 자극으로 적재된다. 분비된 단백질은 표면에 코팅된 항체에 의해 포획됩니다. 적절한 잠복기 후, 세포는 제거되고 분비된 분자는 포획 항체에 비해 상이한 에피토프에 특이적인 생체개화 항체를 사용하여 검출된다. 다음으로, 스트렙타비딘 peroxidase가 첨가되고, 반점의 검출을 허용하는 기판의 첨가(도 1). 이 분석의 강도는 관심있는 단백질을 생산하는 세포의 수를 양량화 할 수 있다는 것입니다. 중요한 것은, 특정 단백질을 생성하는 세포의 총 수에 변화가 있는지 또는 인구 내의 개별 세포가 더 많은 단백질을 생성하는 경우에 평가할 수 있습니다. 더욱이, 운동학에 관한 정보를 제공할 수 있으며 항원 특이적 반응(antigen simulation)에 비해 전반적인 면역 활성화(미토겐 자극)를 평가하는데 사용될 수 있다. ELISPOT 분석은 미토겐성 또는 항원 특이적 활성화에 따라 300,000개의 세포 중 1개의 활성 세포를 검출할 수 있게 한다.

그림 1: ELISPOT 프로토콜 개요입니다.

이 분석의 주요 장점은 그- a입니다. 단순성 - 프로토콜은 비교적 간단하고 간단합니다. 그것은 기술 전문 지식이 필요하지 않습니다, b. 감도- 단일 세포 수준에서 면역 세포의 검출을 허용하고 유동 세포 측정, c와 같은 다른 방법에 비해 거의 세포가 필요합니다. 기능성 - 면역 기능에 관한 정량적 데이터를 제공합니다.

본 실험실 운동은 IFN-γ 분비-비장세포의 검출을 위한 ELISPOT 프로토콜을 보여 주지만, 위에서 언급한 바와 같이 B 세포(3)에 의한 항체 분비를 평가하는 데도 사용될 수 있다.