抗体生成：使用杂交瘤生产单克隆抗体

资料来源：弗朗西斯·萨亚斯塔德^1，2，惠特尼·斯旺森^2，3和托马斯·格里菲斯^{1，2，3，4
1}明尼苏达大学明尼阿波利斯分校微生物学、免疫学和癌症生物学研究生课程，MN 55455
²明尼苏达大学明尼阿波利斯分校免疫学中心，MN 55455
³明尼苏达大学泌尿科，明尼阿波利斯，MN 55455
⁴共济会癌症中心，明尼苏达大学明尼阿波利斯分校，MN 55455

多边克隆抗体被定义为针对抗原或多种抗原的不同抗原决定子（1）的抗体的集合。虽然多克隆抗体是识别生物分子的有力工具，但有一个重要的局限性 - 它们无法区分具有抗原决定因素的抗原。例如，当牛血清白蛋白用于给动物接种疫苗时，具有不同表面Ig的B细胞对牛血清白蛋白上不同的抗原决定因素有反应。结果是抗血清中的抗体混合物。由于牛血清白蛋白与人类血清白蛋白在进化保存区域与人血清白蛋白共享一些表皮，这种抗牛血清白蛋白抗血清也会与人血清白蛋白发生反应。因此，这种抗血清对区分牛和人血清白蛋白没有用处。

为了克服多克隆抗血清的特异性问题，我们采取了几种方法。一种是通过通过固定抗原（2）的色谱柱吸收不需要的抗体。这种方法是乏味的，往往不能完全去除不需要的抗体。另一种方法是分离单个产生抗体的B细胞，并在培养中扩大它们。然而，像大多数正常未转化的细胞一样，B细胞在长期培养中无法存活。

为了克服B细胞在培养中生存的能力，一种方法是制备骨髓瘤-B细胞杂交瘤。1847年，亨利·本斯-琼斯发现多发性骨髓瘤（一种淋巴瘤）患者产生了大量抗体（3）。这些患者的B细胞已经变得恶性，并不受控制地生长。由于恶性B细胞来自单个克隆，它们相同，只产生一种类型的抗体（即单克隆抗体或mAb）。然而，这些骨髓瘤细胞大多产生未知特异性的抗体。1975年，塞萨尔·米尔斯坦和乔治·科勒通过将骨髓瘤细胞融合到B细胞中，成功地培育出一种可以在体外无限期培养的杂交瘤，并产生无限数量的已知抗原特异性的单克隆抗体（4）。其方法背后的原理是结合骨髓瘤细胞的不朽特性和产生B细胞的抗体特性。其技术彻底改变了抗体生产，为使用单克隆抗体识别和纯化生物分子提供了强有力的手段。

一般来说，制备单克隆抗体需要几个月。一般过程包括以下步骤：

1. 抗体皮毒的免疫和筛选
2. 产生抗体的B细胞和骨髓瘤细胞的融合
3. 杂交瘤的选择性生长
4. 筛选杂交瘤以产生所需的单克隆抗体
5. 通过限制稀释进行克隆 - 将细胞稀释到浓度以统计上允许向 96 孔板的孔中添加少于 1 个细胞的过程。有些井最终将有0个细胞，有些将有1个细胞。种子有1个细胞的井最终将长成单克隆细胞群。
6. 杂交瘤的生长与单克隆抗体的制备

该协议侧重于最后一步 - 杂交瘤的生长和单克隆抗体的制备。抗体通过硫酸铵沉淀（通常称为盐化）从培养上清液中纯化 - 一种常用的方法，从溶液中去除蛋白质。溶液中的蛋白质与其他亲水性相互作用一起通过暴露的极性组和离子组与水形成氢键。当加入小、高电荷离子（如铵或硫酸盐）的浓度时，这些组与蛋白质竞争与水结合。这从蛋白质中去除水分子，降低其溶解度，导致蛋白质沉淀。