Antikörper-Generierung: Herstellung monoklonaler Antikörper mit Hybridomen

Quelle: Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3, und Thomas S. Griffith^1,2,3,4
1 Mikrobiologie, Immunologie und Krebsbiologie Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Zentrum für Immunologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Institut für Urologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Freimaurerkrebszentrum, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Polyklonale Antikörper sind definiert als eine Ansammlung von Antikörpern, die gegen verschiedene antigene Determinanten eines Antigens oder mehrerer Antigene gerichtet sind (1). Während polyklonale Antikörper mächtige Werkzeuge zur Identifizierung biologischer Moleküle sind, gibt es eine wichtige Einschränkung - sie sind nicht in der Lage, zwischen Antigenen zu unterscheiden, die antigene Determinanten teilen. Wenn beispielsweise Rinderserumalbumin verwendet wird, um ein Tier zu immunisieren, reagieren B-Zellen mit unterschiedlicher Oberfläche Ig auf verschiedene antigene Determinanten auf Rinderserumalbumin. Das Ergebnis ist eine Mischung von Antikörpern im Antiserum. Da Rinderserumalbumin einige Epitope mit menschlichem Serumalbumin in evolutionär konservierten Regionen des Proteins teilt, wird dieses Anti-Rinder-Serumalbumin-Antiserum auch mit menschlichem Serumalbumin reagieren. Daher wird dieses Antiserum nicht nützlich sein, um zwischen Rindern und menschlichen Serumalbuminen zu unterscheiden.

Es wurden mehrere Ansätze ergriffen, um die Spezifische Problemaz der polyklonalen Antisera zu überwinden. Eine besteht darin, die unerwünschten Antikörper zu absorbieren, indem das Antiserum durch eine Chromatographiesäule von immobilisierten Antigenen (2) geleitet wird. Diese Methode ist mühsam und oft nicht in der Lage, die unerwünschten Antikörper vollständig zu entfernen. Ein weiterer Ansatz besteht darin, einzelne Antikörper produzierende B-Zellen zu isolieren und in der Kultur zu erweitern. Wie die meisten normalen untransformierten Zellen überleben B-Zellen jedoch nicht in der Langzeitkultur.

Um die Unfähigkeit von B-Zellen zu überwinden, in der Kultur zu überleben, besteht ein Ansatz darin, ein Myelom-B-Zellhybridom vorzubereiten. 1847 entdeckte Henry Bence-Jones, dass Patienten mit multiplem Myelom, einem Lymphtumor, eine große Menge an Antikörpern produzierten (3). B-Zellen bei diesen Patienten sind bösartig geworden und wachsen unkontrolliert. Da die bösartigen B-Zellen von einem einzigen Klon abgeleitet sind, sind sie identisch und produzieren nur einen einzigen Typ von Antikörpern(d. h.einen monoklonalen Antikörper oder mAb). Die meisten dieser Myelomzellen produzieren jedoch Antikörper unbekannter Spezifitäten. 1975 gelang es Cesar Milstein und Georges Kohler durch die Verschmelzung einer Myelomzelle mit einer B-Zelle, ein Hybridom zu produzieren, das in vitro unbegrenzt kultiviert werden kann und eine unbegrenzte Anzahl monoklonaler Antikörper bekannter antigener Spezifität produziert (4). Der Grund für ihren Ansatz ist es, die unsterblichen Eigenschaften der Myelomzelle und der Antikörper, die Eigenschaften der B-Zelle produzieren, zu kombinieren. Ihre Technik revolutionierte die Antikörperproduktion und bietet ein leistungsfähiges Mittel zur Identifizierung und Reinigung biologischer Moleküle mit monoklonalen Antikörpern.

Im Allgemeinen dauert die Herstellung eines monoklonalen Antikörpers mehrere Monate. Das allgemeine Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

1. Immunisierung und Screening von Antikörper-Titer
2. Fusion von Antikörper produzierenden B-Zellen und Myelomzellen
3. Selektives Wachstum des Hybridoms
4. Screening der Hybridome zur Herstellung des gewünschten monoklonalen Antikörpers
5. Klonen durch Begrenzung der Verdünnung - ein Prozess, bei dem Zellen zu einer Konzentration verdünnt werden, um statistisch zuzulassen, dass weniger als 1 Zelle in die Brunnen einer 96-Well-Platte aufgenommen wird. Einige Brunnen werden mit 0 Zellen enden und einige haben 1 Zelle. Die Brunnen mit 1 Zelle werden schließlich zu einer monoklonalen Population von Zellen heranwachsen.
6. Wachstum des Hybridoms und Herstellung monoklonaler Antikörper

Dieses Protokoll konzentriert sich auf den letzten Schritt - das Wachstum des Hybridoms und die Herstellung des monoklonalen Antikörpers. Der Antikörper wird aus dem Kulturüberstand durch Ammoniumsulfat-Fällung (oft als Aussalzung bezeichnet) gereinigt - eine häufig verwendete Methode, um Proteine aus einer Lösung zu entfernen. Proteine in Lösung bilden Wasserstoffbindungen, zusammen mit anderen hydrophilen Wechselwirkungen, mit Wasser durch ihre exponierten polaren und ionischen Gruppen. Wenn Konzentrationen von kleinen, hochgeladenen Ionen (wie Ammonium oder Sulfat) zugesetzt werden, konkurrieren diese Gruppen mit den Proteinen um die Bindung an Wasser. Dadurch werden die Wassermoleküle aus dem Protein entfernt und seine Löslichkeit verringert, was zu einer Ausfällung des Proteins führt.