יצירת נוגדנים: ייצור נוגדנים חד שבטיים באמצעות היברידיות

מקור: פרנסס נגד סג'אאסטד^1,2,ויטני סוונסון^2,3ותומאס ס. גריפית'^1,2,3,4
1 מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, ותוכנית לתואר שני בביולוגיה של הסרטן, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
² המרכז לאימונולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
³ המחלקה לאורולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
⁴ מרכז הסרטן הבונים החופשיים, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455

נוגדנים פוליקלונליים מוגדרים כאוסף של נוגדנים המכוונים נגד דטרמיננטים אנטיגניים שונים של אנטיגן או מספר אנטיגנים (1). בעוד נוגדנים פוליקלונליים הם כלים רבי עוצמה לזיהוי מולקולות ביולוגיות, יש מגבלה חשובה אחת - הם אינם מסוגלים להבחין בין אנטיגנים החולקים דטרמיננטים אנטיגניים. לדוגמה, כאשר אלבומין סרום בקר משמש לחיסון בעל חיים, תאי B עם משטח שונה Ig יגגיב דטרמיננטים אנטיגניים שונים על אלבומין סרום בקר. התוצאה היא תערובת של נוגדנים באנטיריום. מכיוון שארבומין בסרום בקר חולק כמה אפיטופים עם אלבומין בסרום אנושי באזורים השמורים אבולוציונית של החלבון, זה סרום אנטי-בקר אלבומין אנטי-וירוס יגיב גם עם אלבומין סרום אנושי. לכן, תרופה זו לא תהיה שימושית להבחנה בין אלבומינים של בקר וסרום אנושי.

מספר גישות ננקטו כדי להתגבר על בעיית הספציפיות של אנטי-זירה פוליקלונלית. האחת היא על ידי ספיגת הנוגדנים הלא רצויים על ידי העברת האנטי-אנרגיה דרך עמוד כרומטוגרפיה של אנטיגנים משותקים (2). שיטה זו היא מייגע ולעתים קרובות לא מסוגל להסיר לחלוטין את הנוגדנים לא רצויים. גישה נוספת היא לבודד תאי B בודדים המייצרים נוגדנים ולהרחיב אותם בתרבית. עם זאת, כמו רוב התאים הרגילים ללא תימוץ, תאי B אינם שורדים בתרבית ארוכת טווח.

כדי להתגבר על חוסר היכולת של תאי B לשרוד בתרבות, גישה אחת היא להכין היברידית של תאי מיאלומה-B. בשנת 1847, הנרי בנס-ג'ונס גילה כי חולים עם מיאלומה נפוצה, גידול לימפואידי, ייצרו כמות גדולה של נוגדנים (3). תאי B בחולים אלה הפכו ממאירים וגדלים ללא שליטה. מכיוון שתאי B הממאירים נגזרים משיבוט יחיד, הם זהים ומייצרים רק סוג אחד של נוגדן (כלומר,נוגדן חד שבטי, או mAb). עם זאת, רוב תאי מיאלומה אלה מייצרים נוגדנים של פרטים לא ידועים. בשנת 1975, על ידי היתוך תא מיאלומה לתא B, הצליחו סזאר מילשטיין וז'ורז ' קולר לייצר הכלאה שניתן לתרבות ללא הגבלת זמן במבחנה ומייצרת מספר בלתי מוגבל של נוגדנים חד שבטיים של ייחודיות אנטיגנית ידועה (4). הרציונל מאחורי הגישה שלהם הוא לשלב את המאפיינים האלמותיים של תא המיאלומה ואת הנוגדן המייצר תכונות של תא B. הטכניקה שלהם חוללה מהפכה בייצור הנוגדנים ומספקת אמצעי רב עוצמה לזיהוי וטיהור של מולקולות ביולוגיות באמצעות נוגדנים חד שבטיים.

בדרך כלל, הכנת נוגדן חד שבטי דורשת מספר חודשים. ההליך הכללי כולל את השלבים הבאים:

1. חיסון וסינון של טיטר נוגדנים
2. היתוך של תאי B המייצרים נוגדנים ותאי מיאלומה
3. צמיחה סלקטיבית של ההיברידית
4. הקרנת ההיברידיות לייצור הנוגדן החד שבטי הרצוי
5. שיבוט על ידי הגבלת דילול - תהליך לפיו תאים מדוללים לריכוז כדי לאפשר סטטיסטית פחות מתא אחד להתווסף לבארות של צלחת 96-well. כמה בארות בסופו של דבר עם 0 תאים וחלקם יהיו 1 תא. בארות עם זרעים עם תא אחד בסופו של דבר יגדלו לתוך אוכלוסייה חד שבטית של תאים.
6. צמיחת ההיברידיות והכנת נוגדן חד שבטי

פרוטוקול זה מתמקד בשלב האחרון - צמיחת ההיברידיות והכנת הנוגדן המונוקלונלי. הנוגדן מטוהר מן התרבות supernatant על ידי משקעים אמוניום גופרתי (המכונה לעתים קרובות מלח החוצה) - שיטה נפוצה של הסרת חלבונים מפתרון. חלבונים בתמיסה יוצרים קשרי מימן, יחד עם אינטראקציות הידרופיליות אחרות, עם מים דרך הקבוצות הקוטביות והאיוניות החשופות שלהם. כאשר מוסיפים ריכוזים של יונים קטנים וטעונים מאוד (כגון אמוניום או סולפט), קבוצות אלה מתחרות עם החלבונים לקשירה למים. זה מסיר את מולקולות המים מן החלבון ומקטין את המסיסות שלה, וכתוצאה מכך משקעים של החלבון.