Generazione di anticorpi: produzione di anticorpi monoclonali attraverso l'utilizzo di ibridomi

Fonte: Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3e Thomas S. Griffith^1,2,3,4
1 Programma di laurea in microbiologia, immunologia e biologia del cancro, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Centro di Immunologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Dipartimento di Urologia, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Masonic Cancer Center, Università del Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Gli anticorpi policlonali sono definiti come una raccolta di anticorpi diretti contro diversi determinanti antigenici di un antigene o di più antigeni (1). Mentre gli anticorpi policlonali sono potenti strumenti per identificare le molecole biologiche, c'è una limitazione importante: non sono in grado di distinguere tra antigeni che condividono determinanti antigenici. Ad esempio, quando l'albumina sierica bovina viene utilizzata per immunizzare un animale, le cellule B con Ig di superficie diversa risponderanno a diversi determinanti antigenici sull'albumina sierica bovina. Il risultato è una miscela di anticorpi nell'antiserum. Poiché l'albumina sierica bovina condivide alcuni epitopi con l'albumina sierica umana in regioni evolutivamente conservate della proteina, questo antisiero dell'albumina sierica anti-bovina reagirà anche con l'albumina sierica umana. Pertanto, questo antiserum non sarà utile per distinguere tra albumine sieriche bovine e umane.

Sono stati adottati diversi approcci per superare il problema della specificità degli antisieri policlonali. Uno è assorbendo gli anticorpi indesiderati facendo passare l'antiserum attraverso una colonna cromatografica di antigeni immobilizzati (2). Questo metodo è noioso e spesso incapace di rimuovere completamente gli anticorpi indesiderati. Un altro approccio è quello di isolare le singole cellule B produttrici di anticorpi ed espanderle in coltura. Tuttavia, come la maggior parte delle normali cellule non trasformate, le cellule B non sopravvivono in coltura a lungo termine.

Per superare l'incapacità delle cellule B di sopravvivere in coltura, un approccio è quello di preparare un ibridoma a cellule mieloma-B. Nel 1847, Henry Bence-Jones scoprì che i pazienti con mieloma multiplo, un tumore linfoide, producevano una grande quantità di anticorpi (3). Le cellule B in questi pazienti sono diventate maligne e crescono in modo incontrollabile. Poiché le cellule B maligne sono derivate da un singolo clone, sono identiche e producono solo un singolo tipo di anticorpo(cioèun anticorpo monoclonale o mAb). Tuttavia, la maggior parte di queste cellule del mieloma producono anticorpi di specificità sconosciute. Nel 1975, fondendo una cellula di mieloma con una cellula B, Cesar Milstein e Georges Kohler sono riusciti a produrre un ibridoma che può essere coltivato indefinitamente in vitro e produce un numero illimitato di anticorpi monoclonali di nota specificità antigenica (4). Il razionale alla base del loro approccio è quello di combinare le proprietà immortali della cellula mieloma e le proprietà di produzione di anticorpi della cellula B. La loro tecnica ha rivoluzionato la produzione di anticorpi e fornisce un potente mezzo per l'identificazione e la purificazione di molecole biologiche utilizzando anticorpi monoclonali.

Generalmente, la preparazione di un anticorpo monoclonale richiede diversi mesi. La procedura generale include i seguenti passaggi:

1. Immunizzazione e screening del titolo anticorpale
2. Fusione di cellule B produttrici di anticorpi e cellule di mieloma
3. Crescita selettiva dell'ibridoma
4. Screening degli ibridomi per la produzione dell'anticorpo monoclonale desiderato
5. Clonazione limitando la diluizione - un processo in cui le cellule vengono diluite a una concentrazione per consentire statisticamente di aggiungere meno di 1 cellula ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Alcuni pozzedi finiranno con 0 cellule e alcuni avranno 1 cella. I pozzeggi con seme con 1 cellula alla fine cresceranno in una popolazione monoclonale di cellule.
6. Crescita dell'ibridoma e preparazione dell'anticorpo monoclonale

Questo protocollo si concentra sull'ultimo passo: la crescita dell'ibridoma e la preparazione dell'anticorpo monoclonale. L'anticorpo viene purificato dal surnatante di coltura mediante precipitazione del solfato di ammonio (spesso indicato come salatura) - un metodo comunemente usato per rimuovere le proteine da una soluzione. Le proteine in soluzione formano legami idrogeno, insieme ad altre interazioni idrofile, con l'acqua attraverso i loro gruppi polari e ionici esposti. Quando vengono aggiunte concentrazioni di ioni piccoli e altamente carichi (come ammonio o solfato), questi gruppi competono con le proteine per legarsi all'acqua. Questo rimuove le molecole d'acqua dalla proteina e diminuisce la sua solubilità, con conseguente precipitazione della proteina.