抗体生成:ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の産生

ソース: フランシス V. シャアスタッド^1,2, ホイットニー・スワンソン^2,3,トーマス・S・グリフィス^1,2,3,4
1ミネソタ大学、ミネアポリス、MN 55455
²ミネソタ大学免疫学センター,ミネアポリス,MN 55455
³ミネソタ大学泌尿器科,ミネアポリス,MN 55455
⁴ミネソタ大学、ミネアポリス、MN 55455

ポリクローナル抗体は、抗原または複数の抗原の異なる抗原決定基に対して向けられた抗体のコレクションとして定義される(1)。ポリクローナル抗体は生体分子を同定するための強力なツールですが、1つの重要な制限があります - 抗原決定基を共有する抗原を区別することができません。例えば、ウシ血清アルブミンを使用して動物を免疫する場合、異なる表面Igを持つB細胞は、ウシ血清アルブミン上の異なる抗原決定要因に応答する。その結果、抗血清中の抗体の混合物が得られます。ウシ血清アルブミンは、タンパク質の進化的に保存された領域でヒト血清アルブミンといくつかのエピトープを共有するので、この抗ウシ血清アルブミン抗血清もヒト血清アルブミンと反応します。したがって、この抗血清は、ウシとヒト血清アルブミンを区別するのに有用ではないであろう。

ポリクローナル抗セラの特異性の問題を克服するためにいくつかのアプローチが取られています。1つは、固定化抗原のクロマトグラフィーカラムを通して抗血清を通過させることによって不要な抗体を吸収することである(2)。この方法は退屈であり、しばしば不要な抗体を完全に除去することができません。別のアプローチは、個々の抗体産生B細胞を単離し、培養中にそれらを拡大することです。しかし、ほとんどの正常な未形質細胞と同様に、B細胞は長期培養では生存しない。

培養中に生き残るB細胞の不能を克服するために、1つのアプローチは骨髄腫-B細胞ハイブリドーマを調製することである。1847年、ヘンリー・ベンス・ジョーンズは、リンパ球腫瘍である多発性骨髄腫患者が大量の抗体を産生することを発見しました(3)。これらの患者のB細胞は悪性になり、制御不能に成長している。悪性B細胞は単一のクローンに由来するので、それらは同一であり、単一のタイプの抗体(すなわち、モノクローナル抗体、またはmAb)のみを産生する。しかし、これらの骨髄腫細胞のほとんどは、未知の特異性の抗体を産生する。1975年、骨髄腫細胞をB細胞に融合することにより、セザール・ミルシュタインとジョージ・コーラーは、インビトロで無期限に培養し、既知の抗原特異性のモノクローナル抗体を無制限に産生できるハイブリドーマの産生に成功しました(4)。彼らのアプローチの背後にある根拠は、骨髄腫細胞の不滅の特性とB細胞の産生特性を組み合わせることである。彼らの技術は抗体産生に革命を起こさせ、モノクローナル抗体を用いた生体分子の同定と精製のための強力な手段を提供する。

一般に、モノクローナル抗体を調製するには数ヶ月を要する。一般的な手順には、次の手順が含まれます。

1. 抗体電化剤の免疫とスクリーニング
2. 抗体産生B細胞と骨髄腫細胞の融合
3. ハイブリドーマの選択的増殖
4. 所望のモノクローナル抗体を産生するためのハイブリドーマのスクリーニング
5. 希釈を制限することによりクローニング - 細胞が統計的に1未満の細胞を96ウェルプレートのウェルに追加することを可能にするために濃度に希釈されるプロセス。いくつかの井戸は0セルで終わり、いくつかは1セルを持つことになります。1細胞で播種された井戸は、最終的に細胞のモノクローナル集団に成長します。
6. ハイブリドーマの増殖とモノクローナル抗体の調製

このプロトコルは、ハイブリドーマの成長およびモノクローナル抗体の調製の最後のステップに焦点を当てています。抗体は、硫酸アンモニウム沈殿(しばしば塩漬けと呼ばれる)によって培養上清から精製される- 溶液からタンパク質を除去する一般的に使用される方法である。溶液中のタンパク質は、水素結合を形成し、他の親水性相互作用と共に、露出した極性およびイオン基を通る水と共に形成する。小さく、高荷電性の高いイオン(アンモニウムや硫酸塩など)を添加すると、これらの基は、水に結合するためのタンパク質と競合します。これは、タンパク質から水分子を除去し、その溶解性を減少させ、タンパク質の沈殿をもたらす。