Geração de anticorpos: produzindo anticorpos monoclonais usando hibridomas

Fonte: Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3e Thomas S. Griffith^1,2,3,4
1 Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Imunologia e Biologia do Câncer, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Centro de Imunologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Departamento de Urologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centro de Câncer Maçônico, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Anticorpos policlonais são definidos como uma coleção de anticorpos direcionados contra diferentes determinantes antigênicos de um antígeno ou vários antígenos (1). Embora os anticorpos policlonais sejam ferramentas poderosas para identificar moléculas biológicas, há uma limitação importante - eles são incapazes de distinguir entre antígenos que compartilham determinantes antigênicos. Por exemplo, quando a albumina de soro bovino é usada para imunizar um animal, células B com diferentes ig de superfície responderão a diferentes determinantes antigênicos na albumina de soro bovino. O resultado é uma mistura de anticorpos no antissoro. Como o álbum de soro bovino compartilha alguns epítopos com albumina de soro humano em regiões evolutivamente conservadas da proteína, este antissoro anti-bovino também reagirá com a albumina de soro humano. Portanto, este antissoro não será útil para distinguir entre albuminas bovinas e humanas.

Várias abordagens foram tomadas para superar a questão da especificidade da antisera policlonal. Uma delas é absorver os anticorpos indesejados passando o antiserum através de uma coluna de cromatografia de antígenos imobilizados (2). Este método é tedioso e frequentemente incapaz de remover completamente os anticorpos indesejados. Outra abordagem é isolar células B produtoras de anticorpos individuais e expandi-las na cultura. No entanto, como a maioria das células não transformadas normais, as células B não sobrevivem na cultura de longo prazo.

Para superar a incapacidade das células B de sobreviver na cultura, uma abordagem é preparar um híbridoma de células mieloma-B. Em 1847, Henry Bence-Jones descobriu que pacientes com mieloma múltiplo, um tumor linfoide, produziam uma grande quantidade de anticorpos (3). As células B nesses pacientes tornaram-se malignas e crescem incontrolavelmente. Uma vez que as células B malignas são derivadas de um único clone, elas são idênticas e produzem apenas um único tipo de anticorpo (ou seja,um anticorpo monoclonal, ou mAb). No entanto, a maioria dessas células de mieloma produz anticorpos de especificidades desconhecidas. Em 1975, ao fundir uma célula de mieloma a uma célula B, Cesar Milstein e Georges Kohler conseguiram produzir um hibridoma que pode ser cultivado indefinidamente in vitro e produz um número ilimitado de anticorpos monoclonais de especificidade antigênica conhecida (4). A lógica por trás de sua abordagem é combinar as propriedades imortais da célula de mieloma e as propriedades produtoras de anticorpos da célula B. Sua técnica revolucionou a produção de anticorpos e fornece um meio poderoso para identificação e purificação de moléculas biológicas usando anticorpos monoclonais.

Geralmente, preparar um anticorpo monoclonal requer vários meses. O procedimento geral inclui as seguintes etapas:

1. Imunização e triagem de titer de anticorpos
2. Fusão de células B produtoras de anticorpos e células de mieloma
3. Crescimento seletivo do hybridoma
4. Triagem dos híbridos para produzir o anticorpo monoclonal desejado
5. Clonagem limitando a diluição - um processo pelo qual as células são diluídas a uma concentração para permitir estatisticamente que menos de 1 célula seja adicionada aos poços de uma placa de 96 poços. Alguns poços acabarão com 0 células e outros terão 1 célula. Os poços com semeadas com 1 célula eventualmente crescerão em uma população monoclonal de células.
6. Crescimento do hibridoma e preparação de anticorpo monoclonal

Este protocolo se concentra na última etapa - crescimento do hibridoma e preparação do anticorpo monoclonal. O anticorpo é purificado da cultura supernascida pela precipitação de sulfato de amônio (muitas vezes referido como salgadinho) - um método comumente usado para remover proteínas de uma solução. Proteínas em solução formam ligações de hidrogênio, juntamente com outras interações hidrofílicas, com a água através de seus grupos polares e iônicos expostos. Quando são adicionadas concentrações de íons pequenos e altamente carregados (como amônio ou sulfato), esses grupos competem com as proteínas para a ligação à água. Isso remove as moléculas de água da proteína e diminui sua solubilidade, resultando na precipitação da proteína.