Generación de anticuerpos: Producción de anticuerpos monoclonales mediante hibridomas

Fuente: Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3y Thomas S. Griffith^1,2,3,4
1 Programa de Posgrado en Microbiología, Inmunología y Biología del Cáncer, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Centro de Inmunología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Departamento de Urología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centro De Cáncer Masónico, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Los anticuerpos policlonales se definen como una colección de anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos de un antígeno o varios antígenos (1). Si bien los anticuerpos policlonales son herramientas poderosas para identificar moléculas biológicas, hay una limitación importante: son incapaces de distinguir entre antígenos que comparten determinantes antigénicos. Por ejemplo, cuando se utiliza albúmina sérica bovina para inmunizar a un animal, las células B con diferentes superficies Ig responderán a diferentes determinantes antigénicos en la albúmina sérica bovina. El resultado es una mezcla de anticuerpos en el antisuero. Debido a que la albúmina sérica bovina comparte algunos epítopos con albúmina sérica humana en regiones evolutivamente conservadas de la proteína, este antisuero de albúmina sérica antibovina también reaccionará con albúmina sérica humana. Por lo tanto, este antisuero no será útil para distinguir entre albúminas de suero bovino y humano.

Se han adoptado varios enfoques para superar el problema de especificidad de los antisueros policlonales. Una es absorbiendo los anticuerpos no deseados pasando el antisuero a través de una columna de cromatografía de antígenos inmovilizados (2). Este método es tedioso y con frecuencia incapaz de eliminar completamente los anticuerpos no deseados. Otro enfoque es aislar las células B productoras de anticuerpos individuales y expandirlas en cultivo. Sin embargo, como la mayoría de las células no transformadas normales, las células B no sobreviven en el cultivo a largo plazo.

Para superar la incapacidad de las células B para sobrevivir en el cultivo, un enfoque es preparar un hibrioma de células mieloma-B. En 1847, Henry Bence-Jones descubrió que los pacientes con mieloma múltiple, un tumor linfoide, producían una gran cantidad de anticuerpos (3). Las células B de estos pacientes se han vuelto malignas y crecen incontrolablemente. Dado que las células B malignas se derivan de un solo clon, son idénticas y producen un solo tipo de anticuerpo(es decir,un anticuerpo monoclonal o mAb). Sin embargo, la mayoría de estas células del mieloma producen anticuerpos de especificidades desconocidas. En 1975, al fusionar una célula de mieloma a una célula B, Cesar Milstein y Georges Kohler lograron producir un hibrioma que se puede cultivar indefinidamente in vitro y produce un número ilimitado de anticuerpos monoclonales de especificidad antigénica conocida (4). La razón de trás de su enfoque es combinar las propiedades inmortales de la célula del mieloma y el anticuerpo que produce propiedades de la célula B. Su técnica revolucionó la producción de anticuerpos y proporciona un poderoso medio para la identificación y purificación de moléculas biológicas utilizando anticuerpos monoclonales.

Generalmente, preparar un anticuerpo monoclonal requiere varios meses. El procedimiento general incluye los siguientes pasos:

1. Inmunización y cribado del título de anticuerpos
2. Fusión de células B productoras de anticuerpos y células de mieloma
3. Crecimiento selectivo del hybridoma
4. Detección de los hibridatos para producir el anticuerpo monoclonal deseado
5. Clonación mediante la limitación de la dilución - un proceso por el que las células se diluyen a una concentración para permitir estadísticamente que se agregue menos de 1 célula a los pozos de una placa de 96 pocillos. Algunos pozos terminarán con 0 células y algunos tendrán 1 célula. Los pozos con sembrados con 1 célula eventualmente crecerán en una población monoclonal de células.
6. Crecimiento del hibridado y preparación de anticuerpos monoclonales

Este protocolo se centra en el último paso : el crecimiento del hibrioma y la preparación del anticuerpo monoclonal. El anticuerpo se purifica del sobrenadante de cultivo mediante precipitación de sulfato de amonio (a menudo conocida como salazón) - un método comúnmente utilizado para eliminar proteínas de una solución. Las proteínas en solución forman enlaces de hidrógeno, junto con otras interacciones hidrófilas, con el agua a través de sus grupos polares e iónicos expuestos. Cuando se añaden concentraciones de iones pequeños y altamente cargados (como amonio o sulfato), estos grupos compiten con las proteínas para unirse al agua. Esto elimina las moléculas de agua de la proteína y disminuye su solubilidad, lo que resulta en la precipitación de la proteína.